3種人工核酸酶的原理及其應用探析,分子生物學論文隨著基因測序技術的發展，利用基因組編輯技術〔genomeeditingtechnologies〕研究基因的功能已經成為后基因組時代生物學研究的重要方向。鋅指核酸酶〔zincfingernucleases,ZFN〕、類轉錄激活因子核酸酶〔transcriptionactivator-likeeffectornucleases,TALEN〕及規律成簇的間隔短回文重復序列〔clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats,CRISPR〕是繼同源重組基因打靶技術后，迅速發展起來的基因組編輯技術。與傳統的基因打靶技術不同，人工核酸酶技術是利用限制性內切酶在特定的DNA位點切割DNA雙鏈斷裂〔doublestrandbreaks,DSBs〕,誘導細胞產生非同源末端連接〔non-homologousendjoining,NHEJ〕或同源重組〔homologousrecombination,HR〕修復機制對損傷的DNA進行修復，進而實現對基因組的定點修飾。傳統的基因修飾技術是通過胚胎干細胞的同源重組實現基因組的靶向修飾[1],但是該技術打靶效率低、耗時長，且打靶后有外源基因的殘留[2].人工核酸酶技術構建簡單，耗時短且不再依靠ES細胞，能夠通過受精卵注射直接獲得基因修飾動物，在很多物種已經實現基因的定向修飾。本文將介紹3種人工核酸酶的原理及在生命科學和醫學研究的應用。1基于ES細胞同源重組的基因打靶技術傳統的基因修飾技術是基于胚胎干細胞的獲得與DNA同源重組引入外源基因這兩種技術獲得轉基因動物[1].同源重組技術是在酵母細胞中最先發展起來。Smithies等[3]初次證明了在哺乳動物細胞也存在同源重組現象。Mansour等[4]采用了正負選擇系統使同源重組的概率大大提高。同時，Capecchi[5]利用ES細胞同源重組打靶技術成功構建基因敲除小鼠。固然基于ES細胞的同源重組基因打靶技術能夠實現基因組的定點突變，但是由于該技術依靠于胚胎干細胞的獲得、胚胎干細胞嵌合到動物生殖細胞的能力以及同源重組在胚胎干細胞中的重組效率等因素，導致這種基因打靶技術存在效率低、耗時長并有明顯物種限制的缺陷。2人工核酸酶介導的基因修飾技術當前，主要的人工核酸酶主要包括3種：ZFN、TALEN和CRISPR系統。這3種基因組編輯技術的工作原理大致類似：DNA的特異性結合，限制性內切酶在特定的DNA位點切割DNA雙鏈斷裂〔doublestrandbreaks,DSBs〕,誘導細胞產生非同源末端連接〔non-homologousendjoining,NHEJ〕和同源重組〔homologousrecombination,HR〕修復機制對損傷的DNA進行修復，進而實現對基因組的定點修飾[6,7].2.1鋅指核酸酶鋅指核酸酶〔zincfingernucleases,ZFN〕是第1代人工核酸酶，ZFN由鋅指蛋白〔zincfingerprotein,ZFP〕構成的特異性的DNA結合域和核酸內切酶FokⅠ構成切割域兩部分組成[8,9].DNA結合構造域由3~6個Cys2-His2鋅指重復單位組成。ZFP能夠辨別并結合3個連續的堿基，然后ZFP在核酸內切酶FokⅠ的指導下在靶基因位點將DNA雙鏈切開〔Fig.1〕。由于核酸內切酶FokⅠ需要構成二聚體才具有酶切活性[10].因而需要將兩個鋅指蛋白分別與核酸內切酶FokⅠ結合，使核酸內切酶FokⅠ構成二聚體將DNA雙鏈切開，誘發細胞的DNA損傷修復機制[11].經過十幾年的發展，鋅指核酸酶技術已經成功應用于很多物種的遺傳研究，不僅在果蠅[12]、斑馬魚[13]、大鼠[14]、小鼠[15]等多種形式動物成功實現了基因敲除或修飾，而且在2005年ZFN技術初次實現了對人類細胞的基因的定點敲除[16],隨后更多類型的人類細胞也成功實現了靶基因的定點修飾[17,18].作為最先應用的靶向基因編輯技術，與ES細胞同源重組基因打靶技術相比ZFN技術有下面幾點優勢：1〕不需要獲取ES細胞就能實現基因組修飾；2〕ZFN能夠實現基因的定點修飾；3〕敲除效率明顯提高。但是，ZFN也有一定的局限性，比方：ZFN對于每一個特定的靶點都需要構建龐大的鋅指表示出文庫，然后再挑選出高效且特異的鋅指蛋白，這一構建經過耗時耗力且費用較高。2.2類轉錄激活因子核酸酶類轉錄激活因子核酸酶〔TALEN〕是第2代人工核酸酶，與ZFN相比，構建愈加簡單，特異性更強。TALEN與ZFN結構類似，其DNA結合域由TALE蛋白構成，TALE蛋白的DNA結合域由12個以上的串聯重復單元組成[20],每個重復單元一般含有34個氨基酸殘基，華而不實第12、13位氨基酸被稱為RVD〔repeat-variablediresidue〕[21,22].不同的RVD能夠特異性辨別一種或多種堿基，當前已經發現了五種RVD,它們與堿基對應關系為：組氨酸-天冬氨酸辨別堿基C;天冬酰胺-異亮氨酸辨別堿基A;天冬酰胺-天冬酰胺辨別堿基G或A;天冬酰胺-甘氨酸辨別堿基T;天冬酰胺-絲氨酸能夠辨別A、T、G、C中的任一種。與ZFN的工作原理一樣，兩個TALE蛋白分別與核酸內切酶FokⅠ結合構成二聚體，對基因組上特定靶位點進行切割，誘導細胞DNA修復機制從而實現靶位點的基因修飾〔Fig.2〕。目前TALEN技術已經成功的應用于包括果蠅[23]、斑馬魚[24]、大鼠[25]、小鼠[26]以及人類的多能干細胞[27]等的基因組修飾。2020年，我們的研究組與國內學者合作利用TALEN技術實現了對非人靈長類X染色體連鎖基因MECP2基因敲除[28].TALEN技術較ZFN技術有宏大的進步。TALEN技術有如下優勢：1〕在構建上TALEN易于ZFN,且TALEN只需要簡單的分子克隆技術就能夠完成挑選；2〕TALEN在辨別靶位點時有愈加廣泛的選擇范圍，且在特異辨別DNA序列上能力更強，特異性更強，相應的效率也高。但是，TALEN技術當前仍然處于初級階段，存在下面幾個方面存在的問題：1〕與ZFN一樣TALEN辨別目的基因的成分是蛋白質，構建辨別20bpDNA的TALEN蛋白，可能需要設計含有1000多個氨基酸的TALEN蛋白，這可能會引起機體的免疫反響，進而在細胞中降低TALEN的作用；2〕TALEN也存在一定脫靶問題，這會直接影響基因的敲除效率。2.3規律成簇的間隔短回文重復序列規律成簇的間隔短回文重復序列〔CRISPR〕系統是第3代人工核酸酶，該系統最初并沒有被應用于生物基因組的編輯，而是在原核生物中表現出某種獲得性免疫功能，能使宿主獲得抵抗噬菌體、質粒等外來DNA入侵的免疫能力[29].CRISPR系統通常由CRISPR基因座轉錄的RNA以及CRISPR-associated〔Cas〕蛋白兩個部分組成，華而不實最為常見的是Ⅱ型CRISPR系統即CRISPR/Cas9系統。在CRISPR/Cas9系統中CRISPR基因座轉錄crRNA〔CRISPRRNA〕與轉錄激活crRNA〔trans-activatingcrRNA,tracrRNA〕退火構成復合物特異辨別基因組序列，然后引導Cas9核酸內切酶在目的片段生成DNA雙鏈斷裂〔double-strandbreaks,DSBs〕,進而誘導細胞產生DNA損傷修復〔Fig.3〕。目前，CRISPR/Cas9已經在斑馬魚[29]、大鼠[30]、小鼠[31]、以及人類細胞[32]等成功實現了基因的靶向修飾。除此之外，2020年，我們與合作者利用CRISPR/Cas9技術對非人靈長類的基因組進行了修飾，獲得多位點基因敲除食蟹猴[33].CRISPR/Cas9系統相比于ZFN和TALEN有著明顯的優勢：首先，CRISPR/Cas9系統的靶位點比ZFN和TALEN在基因組中分布范圍廣；其次，CRISPR/Cas9系統能夠同時實現對多個基因進行定點修飾，而ZFN和TALEN則需要多對；再次，相對于ZFN和TALEN的構建，CRISPR/Cas9系統愈加相簡易且成本較低；最后，Ⅱ型CRISPR/Cas9系統易于改造，例如將cas9蛋白進行改造能夠實現對真核細胞轉錄的調控[35].然而，CRISPR/Cas9系統也存在像ZFN、TALEN這些人工核酸酶常見的脫靶效應[36,37].3基因組編輯技術的應用3.1基因功能研究隨著基因測序技術的不斷發展，深切進入了解基因的功能、構建人類疾病動物模型以及探尋求索新型基因治療方案已經成為后基因組時代的重要研究方向。而基因敲除是基因功能研究必不可少的環節，隨著人工核酸酶技術的不斷發展，ZFN、TALEN和CRISPR/Cas9系統都已經在很多物種實現了靶基因的敲除。例如：2018年，Geurts等[38]利用ZFN技術成功構建靶基因敲除的大鼠，而且該基因突變能夠穩定遺傳至后代；Huang等[39]利用TALEN技術在斑馬魚中實現對Tnikb和Dip2a兩基因的定點突變，并證明這種突變能夠穩定地遺傳；利用傳統的基因打靶技術很難實現對哺乳動物的Y染色體的基因修飾，而Wang等[40]成功利用TALEN技術實現了小鼠Y染色體上相關基因的修飾，并且成功獲得了基因修飾的小鼠。Wang等[41]利用CRISPR/Cas9技術實現了同時高效編輯5個不同基因，這對于基因家族成員的功能相關性的研究有著重要的意義。同樣的結果相繼在斑馬魚[29]和人體細胞[32]被證實。3.2人類疾病模型人類疾病動物模型在探尋求索發病機制、疾病診斷及藥物挑選等方面發揮重要作用。采用基因組打靶技術至今，研究者已制備很多重要的人類疾病動物模型。Jaenisch等報道了利用CRISPR/Cas9技術構建多基因突變的小鼠，實現初次應用CRISPR/Cas9技術對哺乳動物進行基因編輯。2020年，我們研究組[28]與國內學者合作利用TALEN技術實現了對食