§1.細胞全能性一.細胞全能性的一般概念二.細胞分化三.離體培養中細胞的脫分化、再分化第1頁/共72頁第一頁，共73頁。一.細胞全能性的一般概念

一個細胞所具有的產生完整生物個體的固有能力稱之為細胞的全能性。

細胞全能性的絕對性與相對性:

不是所有基因型的所有細胞在任何條件下都具有良好的培養反應;即使對于植物細胞而言，細胞全能性也并不意味著任何細胞均可以直接產生植物個體;動、植物細胞全能性的表現程度存在明顯的差異。

第2頁/共72頁第二頁，共73頁。第3頁/共72頁第三頁，共73頁。植物細胞全能性表現根據細胞類型不同從強到弱:

營養生長中心>形成層>薄壁細胞>厚壁細胞(木質化細胞)>特化細胞(篩管、導管細胞)；根據細胞所處的組織不同從強到弱為：頂端分生組織>居間分生組織>側生分生組織>薄壁組織(基本組織)>厚角組織>輸導組織>厚壁組織。第4頁/共72頁第四頁，共73頁。第5頁/共72頁第五頁，共73頁。二.離體培養中細胞的脫分化（Dedifferentiation）

脫分化

外植體―→愈傷組織或↗體細胞胚↘完整植株

脫分化細胞↘不定器官↗

直接伸長

莖尖培養（較大時）――→完整植株

發育

幼胚培養（較大時）――→完整植株

第6頁/共72頁第六頁，共73頁。外植體：植物組織培養中用來進行無菌培養的離體材料，可以是器官、組織、細胞和原生質體等。

第7頁/共72頁第七頁，共73頁。脫分化后的細胞，經過細胞分裂，產生無組織結構、無明顯極性的、松散的細胞團稱為愈傷組織。

愈傷組織的種類

1、胚性愈傷組織（Embryoneniccallus）：表面光滑、組織結構緊湊、細胞小、再生力強。

胚性愈傷組織容易形成胚狀體，所以被稱為胚性愈傷組織。

2、非胚性愈傷組織：表面粗糙、組織結構疏松、細胞大。

第8頁/共72頁第八頁，共73頁。第9頁/共72頁第九頁，共73頁。第10頁/共72頁第十頁，共73頁。注意：

1、并不是所有的細胞脫分化的結果都必然形成愈傷組織。有些植物體的細胞脫分化以后直接形成胚性細胞，進而形成體細胞胚。

2、多數愈傷組織內的細胞并不都是未分化的細胞，即同一愈傷組織內的細胞之間其狀態存在一定的差異。

第11頁/共72頁第十一頁，共73頁。三.細胞分化所謂細胞分化，是指在個體發育進程中,細胞發生化學組成、形態結構和功能等發生改變的現象。分化程度低的細胞其分化能力強,分化程度高的細胞其分化能力弱。時間上的分化：一個細胞在不同的發育階段上可以有不同的形態結構和功能；空間上的分化：對于多細胞生物來講，同一細胞后代，由于所處的環境不同而可以有相異的形態結構和功能。第12頁/共72頁第十二頁，共73頁。第13頁/共72頁第十三頁，共73頁。1．細胞分化與基因組變化細胞分化過程中，可以觀察到的最常見的變化是染色體的反復復制，而并不進行細胞分裂。核內染色體的復制過程可以區分出兩種主要類型，一是核內有絲分裂，導致核內多倍體，二是大量復制染色絲，導致形成多線染色體。在植物的分化發育中，另一類基因組的變化是基因重排。例如，在玉米、金魚草等植物中，轉座子的移動能引起很多發育性狀的改變。第14頁/共72頁第十四頁，共73頁。2.細胞分化與極性建立

極性是指植物的器官、組織、甚至單個細胞在不同的軸向上存在的某種形態結構以及生理生化上的梯度差異。在很多情況下，細胞的不均等分裂是是細胞極性建立的標志。無論是在活體還是在離體條件下，一般認為，極性的建立和維管成分的產生，是植物細胞分化的基本特征。第15頁/共72頁第十五頁，共73頁。

3.細胞分化的過程

細胞分化可分為兩個階段：決定：是指胚胎細胞在發育過程中發生的不可逆的特化現象。因此，決定就是細胞發育途徑的確定，它是細胞分化的早期過程；分化細胞特征逐漸表現：在大多數情況下，細胞從決定到表現特定細胞特征通常需要經過幾代細胞的傳遞（細胞分裂）。第16頁/共72頁第十六頁，共73頁。4.影響細胞分化的因素a激素b蔗糖濃度c光照與溫度第17頁/共72頁第十七頁，共73頁。a.激素生長素能促進維管組織形成細胞分裂素與木質部的發生有關第18頁/共72頁第十八頁，共73頁。

激素在細胞分化中的作用，可能是通過在轉錄或翻譯水平上的調節作用而影響相關基因的表達從而調控細胞分化。第19頁/共72頁第十九頁，共73頁。b、蔗糖濃度第20頁/共72頁第二十頁，共73頁。C、光照與溫度

光照對于維管組織的分化具有促進作用，適宜的溫度對于維管組織的分化是必需的。第21頁/共72頁第二十一頁，共73頁。§2.器官發生

一．離體培養中器官發生的方式二.器官分化的過程三.影響器官分化的因素第22頁/共72頁第二十二頁，共73頁。植物的離體器官的發生：培養條件下的組織或細胞團（愈傷組織）分化形成不定根（adventitiousroots）、不定芽（adventitiousshoots）等器官的過程。

不定根：從莖、葉上生出的根叫做不定根

不定芽：不是從葉腋或枝頂發出，而是從葉子、根上或從樹干上發出的芽

第23頁/共72頁第二十三頁，共73頁。

第24頁/共72頁第二十四頁，共73頁。一.離體培養中器官發生的方式

通過器官發生形成再生植株大體上有三種方式：

第一種方式是先芽后根；如小麥，蘆薈、蘋果第二種方式為先根后芽；如枸杞、苜蓿等第三種方式是在愈傷組織的不同部位形成芽和根，再通過維管組織的聯系形成完整植株。如胡蘿卜、石刁柏

第25頁/共72頁第二十五頁，共73頁。石刁柏第26頁/共72頁第二十六頁，共73頁。二.器官分化的過程

離體條件下，經過愈傷組織再分化器官一般要經過三個生長階段：

1.外植體經過誘導形成愈傷組織。

2.生長中心的形成。

3.器官原基及器官形成。

第27頁/共72頁第二十七頁，共73頁。生長中心（擬分生組織）器官原基芽形成第28頁/共72頁第二十八頁，共73頁。在有些情況下，外植體不經過典型的愈傷組織即可形成器官原基，這一途徑有兩種情況，一是外植體中已存在器官原基，進一步培養即形成相應組織器官進而再生植株，另一種情況是外植體形成分生細胞團后在分生細胞團上直接形成器官原基。第29頁/共72頁第二十九頁，共73頁。一般認為，芽和莖原基通常起源于培養組織中比較表層的細胞，即外起源，而根原基則發生在組織較深處，是內起源。

第30頁/共72頁第三十頁，共73頁。三.影響器官分化的因素1.外植體-位置、狀態及組織類型（蘆薈、小麥）外植體的狀態和組織類型影響誘導和分化的難易；外植體的部位直接影響器官分化的類型。例如：蘆薈第31頁/共72頁第三十一頁，共73頁。第32頁/共72頁第三十二頁，共73頁。第33頁/共72頁第三十三頁，共73頁。具有變態器官（如鱗莖、球莖、塊莖等）的植物，在培養中往往也容易形成相應的變態器官，如百合、水仙等鱗莖類植物培養中往往易形成小鱗莖；草石蠶、馬鈴薯等塊莖植物培養中則可觀察到塊莖的形成。這一特性也使以變態器官為繁殖體的植物實現實驗室工廠化生產種子提供了可能。

第34頁/共72頁第三十四頁，共73頁。草石蠶水仙百合第35頁/共72頁第三十五頁，共73頁。2.生長調節劑生長調節劑在細胞生長與個體發育中具有重要的調控作用。離體培養下的器官分化在大多數情況下是通過外源提供適宜的植物生長調節劑來實現的。種類、濃度和不同類型生長調節劑的比例是影響根芽等分化的關鍵。第36頁/共72頁第三十六頁，共73頁。3.光照光照有利于維管組織和葉綠體形成進而分化成芽。愈傷組織的誘導培養一般是在黑暗或弱光照條件下進行的，細胞中完全沒有維管成分，當轉入強光照條件下以后，才能逐漸變綠并形成維管組織。分化培養的初期連續光照能促進愈傷組織變綠，隨后的晝夜交替則有利于細胞極性的建立，從而促進器官分化。有些植物，只有在一定的光周期條件下才能分化芽，例如天竺葵的愈傷組織進入器官分化培養，一般要在16h/d光照和8h/d黑暗條件下才能分化芽。第37頁/共72頁第三十七頁，共73頁。天竺葵第38頁/共72頁第三十八頁，共73頁。4.溫度

愈傷組織誘導培養時，溫度可以適當提高，而分化溫度比誘導溫度要低。例如煙草，愈傷組織生長時33℃仍可良好生長，而分化則必需在18℃條件下才適宜。與光周期相似，某些需要通過低溫春化的植物，在離體培養中器官形成有時也需要低溫處理，特別是對于某些特殊目的的培養，例如菊苣根培養產生的愈傷組織，誘導分化時經低溫處理可形成花芽，而在25℃下培養只能形成營養芽。第39頁/共72頁第三十九頁，共73頁。菊苣根第40頁/共72頁第四十頁，共73頁。§3.離體培養下的遺傳與變異一、培養細胞變異的類型二、變異原因三.影響離體培養細胞遺傳變異的因子四.體細胞無性系變異的誘導五、優良變異的篩選方法六.體細胞無性系變異的利用七、變異的抑制第41頁/共72頁第四十一頁，共73頁。一、培養細胞變異的類型

第42頁/共72頁第四十二頁，共73頁。

變異，由于離體培養條件下并沒有發生雌雄配子的重組和交換，因此，這些變異的發生可以說均屬于突變的范疇，由于它們沒有發生有性過程，因此，我們把在組織培養條件下所表現的遺傳與變異特征稱之為體細胞遺傳與變異，由此發展起來的一個新的遺傳學分枝稱為體細胞遺傳學。離體培養中，組織、細胞、原生質體培養再生植株中，會有各種各樣的變異。例如，葉色、花色的變異，株高、果實大小的變異，染色體結構和數目的第43頁/共72頁第四十三頁，共73頁。培養細胞變異的類型：

自發產生的變異。

培養物在未加誘變因素的情況下產生變異。

誘發產生的變異。

培養物在誘變因素作用下產生變異。

前者變異率一般在10-7~10-6之間，后者一般在10-5~10-4。

第44頁/共72頁第四十四頁，共73頁。1、自發產生的變異A.染色體多倍性和非整倍性第45頁/共72頁第四十五頁，共73頁。B.畸形變異

最常見的變異是白化苗突變，其次是產生叢生芽、肉質莖芽等。

第46頁/共72頁第四十六頁，共73頁。

第47頁/共72頁第四十七頁，共73頁。

安祖花第48頁/共72頁第四十八頁，共73頁。C.非遺傳變異a、外遺傳變異（epigeneticvariation)

在植物愈傷組織培養過程中，常常出現一種不涉及基因結構的變化，而只是在基因表達水平上的變異，如最常見的生長素自養型變異。這種變異不能通過有性世代傳遞給后代植株，但在離體條件下卻可以經過培養繼代，長期保存。（馬鈴薯）第49頁/共72頁第四十九頁，共73頁。b、生理適應（physiologicadaptation）變異

通常是在某種外界條件存在時才表現出變

異，外界條件不存在時，變異也隨之消失。

第50頁/共72頁第五十頁，共73頁。2、誘發產生的變異

抗鐮刀菌毒素細胞變異系的分離

將誘導產生的愈傷組織接種在含不同濃度梯度毒素的培養基上

篩選得到半致死劑量濃度、100%生長抑制生長濃度、致死計量濃度

以半致死劑量為最低濃度，逐代增加毒素濃度至致死劑量濃度

轉移至無毒素培養基繼代培養兩代

轉移到致死劑量和高于致死劑量的培養基培養，統計存活率

第51頁/共72頁第五十一頁，共73頁。二、變異原因：

1、

植物本身的異質性

無性繁殖植物的體細胞中，存在廣泛的異質性（如體細胞突變等原因造成），在整體中被掩蓋，無法表現出來。在離體培養中，原來具有不同類型的細胞被誘導分裂，由這些變異的細胞再生的植株為變異植株，經過一定的選擇，選育新品種。

第52頁/共72頁第五十二頁，共73頁。2、培養條件引起的變異

變異原因可能與如下因素有關：

1）

培養基中添加的激素

2）

形成愈傷組織過程中，細胞分裂異常

3）環境條件的改變（溫度、光照時間及強度與原來生長環境不同）

第53頁/共72頁第五十三頁，共73頁。三.影響離體培養細胞遺傳變異的因子

1、供體植株方面

倍性水平、基因型、外植體細胞的分化程度

2、培養基及培養方式

培養基的成分、物理狀態及培養類型

原生質體培養的體細胞變異大于細胞培養的變異，而細胞培養的變異又大于組織器官培養的變異

3、繼代培養的次數

一般來講，繼代時間越長、繼代次數越多，細胞變異的幾率就越大。

第54頁/共72頁第五十四頁，共73頁。四.體細胞無性系變異的誘導

自發變異往往頻率較低，為了增加變異頻率，在培養基中添加化學誘變劑或使用物理方法處理，這樣，細胞群體中就會產生各種各樣的變異。

第55頁/共72頁第五十五頁，共73頁。誘變劑類型：

誘變劑包括物理的和化學的兩大類。

物理誘變劑：X射線、γ射線、中子、β粒子、α粒子和紫外線等。

化學誘變劑：烷化劑、堿基類似物、移碼誘變劑和某些抗生素類等。

第56頁/共72頁第五十六頁，共73頁。五、優良變異的篩選方法

1、離體條件下體細胞無性系變異的篩選的優點：

（1）可以在小空間內對大量個體進行選擇

（2）不受季節限制，篩選效率高

（3）誘變和篩選條件可以根據需要進行調節和控

制，提高了試驗的重復性。

（4）理化誘變劑可較均勻接觸細胞，因此可以引

起培養細胞較高頻率發生突變，增加了選擇

機會

（5）變異是在單細胞水平上進行的，因此一個突變

體來自一個細胞，，避免了整株水平上常呈

現出的嵌合體，因而可以省去變異分離的麻煩

第57頁/共72頁第五十七頁，共73頁。2、體細胞變異材料的選擇

選擇起始材料需根據試驗目標確定，一般應考慮（1）目標性狀的可行性。體細胞突變的頻率雖然較高，但對于某一個體來講，變異的性狀是個別的，因此選擇綜合性狀良好的植物品種材料，通過誘變改變個別不良性狀，是體細胞突變系選擇的目的。

（2）必須充分考慮試驗植物的細胞培養技術水平，只有對起始材料有良好的培養技術，才有可能制定完滿的誘變及選擇方案。如果起始細胞的培養技術不成熟，不能再生植株，則不能進行后繼的各項操作。

第58頁/共72頁第五十八頁，共73頁。（3）適當的細胞類型也是提高體細胞突變系篩選效率的重要條件。

雖然各種狀態下的培養細胞均可以作為分離突變細胞的來源，但實踐中原生質體和懸浮細胞系被優先考慮。

第59頁/共72頁第五十九頁，共73頁。3、篩選方法

（1）直接篩選法

在設計的選擇條件下，能使培養細胞或再生個體獲得直接感官上的差異，因此能將突變個體和非突變個體分離。

最直接的做法是用一種含有特定物質的選擇培養基，在此培養基上只有突變細胞能夠生長，而非突變細胞不能生長，從而直接篩選出突變體，如抗除草劑、抗鹽突變體的篩選，均可直接在培養基中加入一定濃度的除草劑或增加滲透壓的物質。

另外也可以在再生植株水平上進行篩選。

第60頁/共72頁第六十頁，共73頁。培養及篩選過程（在細胞水平上）：

組織、器官、愈傷組織、原生質體等

↓誘發變異處理、篩選壓

耐性愈傷組織

↓

再生植株

↓鑒定

耐性植株

第61頁/共72頁第六十一頁，共73頁。培養及篩選過程（在再生植株水平上）：

組織、器官、愈傷組織、原生質體等

↓誘發變異處理

愈傷組織

↓

再生植株

↓篩選壓

耐性植株

第62頁/共72頁第六十二頁，共73頁。第63頁/共72頁第六十三頁，共73頁。2、間接篩選法

間接選擇法是一種借助于與突變表現型有關的性狀作為選擇指標的篩選方法。當缺乏直接選擇表型指標或直接選擇條件對細胞生長不利時，可考慮采用間接篩選法。

抗病突變體的篩選也常常用間接篩選的策略。由于在離體培養中直接接種病原物會嚴重阻礙細胞生長，因此可以在培養基中加入一定劑量的病原物類毒素來增加選擇壓力。第64頁/共72頁第六十四頁，共73頁。體細胞無性系變異的表示方法主要有兩種：

（1）、Chaleff提出的以R0、R1、R2、….分別代表體細胞無性系變異的當代和自交以后的世代

（2）Larkin和Scowcroft提出的SC1、RC2、RC3…..分別代表當代和自交以后的世代第65頁/共72頁第六十五頁，共73頁。六、體細胞無性系變異的利用

1．創造育種中間材料或直接篩選新品種

據統計，誘導突變已被用來改良諸如小麥、水稻、大麥、棉花、花生和菜豆這些種子繁殖的重要作物。在全世界50多個國家中，已培育出1000多個由直接突變獲得的或由這些突變體雜交而衍生的品種。這些品種的主要特性包括品質改良、增強抗病性和抗逆性等

第66頁/共72頁第六十六頁，共73頁。2．遺傳研究

突變體作為基因克隆和標記篩選具有獨特的優點。因為突變一旦發生，即可在表現型上與供體顯著不同，通過差異顯示或分子雜交篩選，即可快速獲得突變位點的DNA序列，經過測序與功能鑒定，就可能獲得與突變性狀相關的基因。即使通過分析不能獲得功能基因，這些DNA序列也可作為與突變性狀相關的分子標記，用于相關遺傳研究。突變體用于基因克隆和功能鑒定早已成為模式植物如擬南芥等的常規方法，近年來也已開始廣泛用于其它作物中。特別是與轉座子標簽插入突變技術相結合，更顯現出這一途徑的高效性。目前，利用突變體策略已分離出一些功能基因和抗病基因，如玉米

乙醇脫氫酶基因ADH，赤霉素合成相關基因GA1、GA4，生長素敏感性基因AUX1、AUX2