各領(lǐng)域中CRISPR技術(shù)的運用綜述,分子生物學(xué)論文摘要：由于CRISPR(clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats)系統(tǒng)具有多功能基因編輯工具，研究人員能更精到準確、簡便地編輯特定基因組元件.CRISPR技術(shù)可對特定位點的DNA或RNA序列進行辨別和切割.由于DNA鏈斷裂會啟動細胞修復(fù)程序，結(jié)合CRISPR技術(shù)導(dǎo)致靶位點處可設(shè)計的基因插入、敲除或替換等.對CRISPR系統(tǒng)的分類進行簡介，對CRISPR技術(shù)在醫(yī)學(xué)、農(nóng)業(yè)、畜牧領(lǐng)域及高通量挑選領(lǐng)域中的應(yīng)用進行綜述.本文關(guān)鍵詞語:CRISPR;醫(yī)學(xué);農(nóng)業(yè);畜牧業(yè);高通量挑選;Abstract：ResearcherscaneditspecificgenomiccomponentsmoreaccuratelyandeasilyastheCRISPR(clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats)systemhasamulti-functiongeneeditingtool.CRISPRtechnologyidentifiesandcleavesDNAorRNAsequencesatspecificsites.ThebreakofDNAstrandinitiatecellrepairprocedures,andthecombinationwithCRISPRtechnologywillleadtoeditablegeneinsertion,knockoutorreplacementatthetargetsite.ThispaperreviewstheclassificationofCRISPRsystemsandtheapplicationofthistechnologyinthefieldsofmedicine,agriculture,animalhusbandryandhigh-throughputscreening.Keyword：CRISPR;medicine;agriculture;animalhusbandry;high-throughputscreens;成簇的規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列(clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats,CRISPR)由JansenR等命名[1],華而不實，CRISPR-associated(Cas)基因總是位于CRISPR基因座附近，表示清楚兩者可能具有互相作用關(guān)系.2007年，RodolpheBarrangou等證實，CRISPR-Cas廣泛存在于細菌和古細菌中的一套抵御病毒和噬菌體入侵的獲得性免疫系統(tǒng)[2].CRISPR系統(tǒng)極具多樣性，當(dāng)前可分成2大類，即干擾效應(yīng)物由多亞基蛋白復(fù)合物組成；干擾效應(yīng)物依靠單個蛋白質(zhì)[3].根據(jù)特征基因的不同，CRISPR系統(tǒng)又可細分(圖1a):Ⅰ型系統(tǒng)的特征蛋白是Cas3,它是一種具有核酸酶和解旋酶構(gòu)造域的蛋白質(zhì)；在Ⅱ型系統(tǒng)中，特征Cas9基因編碼干擾所必需的唯一蛋白質(zhì)；Ⅲ型系統(tǒng)以Cas10為特征蛋白，且Cas10組裝成類似Cascade的干擾復(fù)合體；Ⅳ型系統(tǒng)具有Csf1蛋白質(zhì)，它是一種未被鑒定的蛋白質(zhì)，被以為是Cascade復(fù)合物的一部分[4];Ⅴ型系統(tǒng)的特征蛋白為Cas9單核酸酶，即Cpf1,C2c1或C2c3[5];Ⅵ型系統(tǒng)的特征蛋白為C2c2,它是含有2個HEPN構(gòu)造域的RNase蛋白[5].Ⅰ,Ⅲ,Ⅳ型系統(tǒng)基于其多亞基效應(yīng)復(fù)合物發(fā)揮功能，而Ⅱ,Ⅴ,Ⅵ型系統(tǒng)基于單個效應(yīng)蛋白發(fā)揮功能.圖1a展示了以上6種類型的代表性Cas基因座[6].圖1CRISPR系統(tǒng)的基本分類和應(yīng)用情況圖1中僅存在于某些細菌亞型中的Cas蛋白以虛線輪廓顯示，介入干擾的模塊為白色，介入crRNA生物發(fā)生的模塊為黑色，介入適應(yīng)性的模塊為灰色.TypeⅠ中的Cas6同時介入干擾和crRNA生物發(fā)生.Ⅳ型系統(tǒng)在沒有CRISPR基因座的情況下頻繁發(fā)生.由于CRISPR-Cas9系統(tǒng)構(gòu)造簡單，當(dāng)前它的研究和應(yīng)用最為廣泛.初次發(fā)現(xiàn)Cas蛋白能夠通過短的RNA引導(dǎo)切割特定的DNA序列后不久[7],Doudna和張鋒證實CRISPR介導(dǎo)的基因組修飾可應(yīng)用于哺乳動物細胞[8,9].當(dāng)前，CRISPR技術(shù)作為新興的基因編輯工具，與ZFN(鋅指核酸酶)和TALEN(轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶)技術(shù)一同引領(lǐng)基因工程的現(xiàn)代[10,11,12].CRISPR技術(shù)在基因編輯上的應(yīng)用大致可分為基因插入[13]、基因敲除[14]、基因定點突變[15]、靶向定位[16]、基因表示出調(diào)控[17]、基因表觀修飾[18]、基因融合[19]等(圖1b).在近期的研究中，CRISPR還被應(yīng)用于選擇性消除單條染色體[20]和產(chǎn)生誘導(dǎo)性多能干細胞[21].CRISPR技術(shù)不但在實驗室基因編輯經(jīng)過中發(fā)揮了重要作用，更在日常飲食、醫(yī)療等方面中扮演了越來越重要的角色.筆者綜述CRISPR技術(shù)在醫(yī)學(xué)、農(nóng)業(yè)、畜牧及高通量挑選等領(lǐng)域的最新進展和應(yīng)用情況，并對其發(fā)展前景進行瞻望.1、CRISPR技術(shù)在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用基因治療是從基因水平上治療某些疾病的技術(shù).基于DNA或RNA的遺傳操縱原理，可將外源正常基因?qū)氚屑毎委熀皖A(yù)防人類疾病.與傳統(tǒng)治療相比，基因治療有針對性強、效果顯著、患者無痛苦等優(yōu)勢.但也存在安全隱患，面臨著穩(wěn)定性差、效率低、操作復(fù)雜的缺陷.CRISPR作為高效、簡便、靶向性強的新興基因編輯工具，對于解決基因治療的缺陷問題將發(fā)揮重要的作用.當(dāng)前，CRISPR技術(shù)在基因治療領(lǐng)域已經(jīng)有了廣泛的應(yīng)用，并在病毒性疾病、基因突變性疾病、建立疾病模型、疾病新療法開發(fā)和疾病檢測等方面獲得了重大進展(表1).1.1治療病毒性疾病CRISPR作為細菌抵御病毒和噬菌體入侵的免疫系統(tǒng)，能夠特異性切割外源基因，當(dāng)前用于病毒感染類疾病治療的研究，詳細可從靶向切割病毒基因和編輯人體基因組2方面入手：靶向切割病毒基因是在確定病毒的保守序列后，針對其設(shè)計gRNA,進而到達去除病毒的目的；編輯人體基因組，則是基于人體細胞本身特性，賦予被編輯的細胞特定性狀，或者用于激活免疫系統(tǒng)，以此作為治療手段.固然CRISPR技術(shù)治療病毒性疾病應(yīng)用于臨床還有一定的距離，但是其潛力不容忽視.表1CRISPR技術(shù)在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用2021年，XuL等通過CRISPR-Cas9系統(tǒng)在造血干細胞移植中靶向切割人CCR5基因[22].將CCR5敲除處理的人HSPC(hematopoieticstem/progenitorcells)重建人免疫系統(tǒng)移植到高度免疫缺陷小鼠后，賦予了小鼠抗1型人類免疫缺陷病毒(humanimmunodeficiencyvirus-1,HIV-1)感染的能力.2021年，OphinniY等通過CRISPR-Cas9設(shè)計6種gRNA[23],華而不實3種靶向切割HIV-1調(diào)節(jié)基因Tat,Rev,通過抑制Tat,Rev蛋白的表示出，成功減少持續(xù)和潛伏感染的CD4+T細胞系中HIV病毒衣殼的產(chǎn)生，可為艾滋病的治療提供新方式方法.高風(fēng)險人乳頭瘤病毒致癌基因(E6,E7)的失調(diào)表示出是宮頸癌發(fā)病和惡化的關(guān)鍵因素.2020年，ZhenS等通過CRISPR-Cas9靶向E6,E7基因的啟動子和編碼區(qū)[24],導(dǎo)致P53,P21蛋白的積累，進而顯著降低宮頸癌細胞的體外增殖能力，證明CRISPR技術(shù)能夠作為宮頸癌和其他HPV相關(guān)癌癥治療的新策略.1.2、治療基因突變遺傳病作為一種多用處的基因組編輯工具，CRISPR技術(shù)的應(yīng)用領(lǐng)域特別廣泛，如可通過基因定點突變、異常基因靶向敲除等方式應(yīng)用于基因突變遺傳病的治療[25].華而不實，單基因突變疾病的治療研究最為成熟，相信很快可應(yīng)用于臨床.鐮刀型貧血癥是一種基因單位點突變疾病，很多科學(xué)家已經(jīng)嘗試應(yīng)用CRISPR技術(shù)對其進行治療[26,27,28].2021年12月，CRISPRTherapeutics公司請求歐洲監(jiān)管部門允許其開展針對鐮狀細胞病和β地中海貧血患者的研究性CRISPR治療方式方法(CTX001)的臨床試驗.Tmc1基因顯性突變會引起人和小鼠漸進性聽力喪失.2021年，GaoX等通過CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)使產(chǎn)生突變的Tmc1基因失活[29],進而改善了小鼠模型中的聽力喪失情況.肌萎縮側(cè)索硬化癥(amyotrophiclateralsclerosis,ALS)是一種成人發(fā)病的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，患者全身進行性肌肉無力和萎縮，一般發(fā)病3～5a內(nèi)癱瘓并死亡，當(dāng)前還沒有治愈的方式方法.SOD1基因的突變常被用于模擬ALS神經(jīng)變性疾病.2021年，GajT等通過CRISPR-Cas9毀壞患有肌萎縮側(cè)索硬化癥的G93A-SOD1小鼠模型中SOD1的表示出[30],與對照動物相比，疾病發(fā)作延遲37%,存活率增加25%.1.3、建立疾病模型構(gòu)建疾病模型對致病機理和治療方式方法的研究有重要意義.疾病狀態(tài)常由單個或多個基因突變導(dǎo)致，在確定導(dǎo)致疾病性狀的詳細基因和基因突變類型后，研究者可按照所需性狀對特定基因進行編輯，以此模擬疾病性狀.CRISPR技術(shù)具有簡便、可遺傳和高度穩(wěn)定等優(yōu)勢，是疾病模型構(gòu)建領(lǐng)域的有效工具.杜氏肌營養(yǎng)不良癥(duchennemusculardystrophy,DMD)是由編碼抗肌萎縮蛋白的Dmd基因突變引起的X連鎖致死性肌肉疾病.2020年，NakamuraK等通過CRISPR-Cas9同時靶向敲除大鼠Dmd基因中的2個外顯子[31],結(jié)果表示清楚，F(xiàn)0代大鼠中出現(xiàn)抗肌萎縮蛋白表示出缺失的性狀；Dmd突變的大鼠表現(xiàn)出肌肉氣力下降，骨骼肌、心臟和膈肌中退行性/再生性的表型；F1代雄性大鼠的骨骼肌具有類似的表型，證明這些突變可被下一代遺傳.進而成功構(gòu)建了杜氏肌營養(yǎng)不良癥的疾病模型.2021年，JarnoDrost等通過CRISPR-Cas9探尋求索癌癥相關(guān)突變信號的來源[32],發(fā)現(xiàn)錯配修復(fù)基因MLH1缺陷的類器官中突變積累是由復(fù)制錯誤驅(qū)動的，并通過敲除離體器官中的NTHL1基因模擬了在錯配修復(fù)缺陷的結(jié)腸直腸癌中觀察到的突變譜.1.4、開發(fā)疾病新療法隨著技術(shù)的不斷改良和融合，CRISPR技術(shù)已經(jīng)被應(yīng)用于多種新型治療方式方法的研究，如與免疫治療相結(jié)合、改變基因表觀修飾、尋找藥物新靶點等.大量的研究成果讓我們感遭到CRISPR技術(shù)在藥物研發(fā)和疾病治療中無限潛能，更讓我們對攻克長期危害人類健康的疑難雜癥充滿自信心.2021年，KimMY等在(Cell〕上發(fā)表了一種能結(jié)合CRISPR技術(shù)和CAR-T細胞療法(chimericantigenreceptorT-Cellimmunotherapy)治療急性髓性白血病的新方式方法[33],即通過CRISPR技術(shù)敲除CD33基因，產(chǎn)生白血病特異性抗原，進而賦予CAR-T細胞靶向治療急性髓性白血病的能力.2021年，LiuXS等初次通過自主研發(fā)的一種移除甲基化的改良型CRISPR-Cas9系統(tǒng)[18],恢復(fù)受脆性X染色體綜合征影響的神經(jīng)元中FMR1基因的活性，表示清楚該方式方法可用于治療由異常甲基化引起的疾病.2021年，BarbieriI等構(gòu)建了多種小鼠白血病細胞模型[34],用于系統(tǒng)性地測試每個可能相關(guān)的基因，進而發(fā)現(xiàn)哪些基因是AML細胞存活所必需的，最終通過CRISPR-Cas9鑒定出AML白血病的藥物新靶標METTL3.1.5、檢測病毒性疾病CRISPR家族中的一些成員(Cas12,Cas13)能夠靶向切割單鏈DNA或RNA,研究人員應(yīng)用這種特性開發(fā)出一系列核酸檢測新方式方法.這些核酸檢測方式方法可應(yīng)用于病毒檢測等領(lǐng)域，也為醫(yī)學(xué)檢驗提供更多項選擇擇.2021年，張鋒等開發(fā)一種基于CRISPR-Cas13的快速、便宜且高度靈敏的診斷工具SHERLOCK(specifichighsensitivityenzymaticreporterUnLOCKing)[35,36],可用于檢測RNA或DNA的單分子.出于加強實用性目的，他們又開發(fā)出一種微型試紙條測試方式方法，該方式方法使肉眼觀察測試結(jié)果成為可能，且無需使用昂貴的設(shè)備.2021年，Doudna使用被稱作DETECTR(DNAendonucleasetargetedCRISPRtransreporter)的DNA檢測方式方法實現(xiàn)了靈敏且準確的病毒DNA檢測[37],該方式方法通過在人類樣品中檢測2種致癌性的人類乳頭狀瘤病毒得到驗證.2、CRISPR在農(nóng)業(yè)、畜牧領(lǐng)域的應(yīng)用在國家政策的扶持、宏大的市場需求以及相關(guān)研究不斷獲得進展的背景下，CRISPR技術(shù)在農(nóng)業(yè)應(yīng)用方向迎來了新的機遇.與傳統(tǒng)技術(shù)相比，CRISPR擴展了農(nóng)業(yè)育種工具庫，能夠更快、更精準地培育出農(nóng)作物新性狀，并極大地縮短育種的時間.同時，使用CRISPR-Cas9技術(shù)對農(nóng)作物基因進行編輯，不牽涉外源DNA引入，且經(jīng)USDA(unitedstatesdepartmentofagriculture)認定不在轉(zhuǎn)基因監(jiān)管范圍之內(nèi)，沒有食品安全方面的風(fēng)險.因而，將來CRISPR技術(shù)在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域更多的突破和發(fā)展值得等待.2.1、農(nóng)作物的遺傳改進隨著人口的增長，糧食危機成為不得不面對的問題.CRISPR基因編輯技術(shù)已經(jīng)在優(yōu)化農(nóng)作物產(chǎn)量、抗病性、口味等性狀上獲得了一定突破，已成為將來農(nóng)業(yè)育種領(lǐng)域的一大助力.2.1.1、提高作物產(chǎn)量2021年，ZacharyBL等通過CRISPR編輯番茄開花抑制因子基因SELFPRUNING5G,促進番茄的日長敏感性[38],使番茄快速、集中開花，提高了產(chǎn)量.他們還通過CRISPR基因編輯技術(shù)成功改進西紅柿苗的分枝、花的數(shù)量以及果實的大小等性狀[39].氨基酸轉(zhuǎn)運子(aminoacidtransporters,AATS)在植物發(fā)育階段的營養(yǎng)分配經(jīng)過中起到不可或缺的作用.2021年，LuK等通過CRISPR技術(shù)抑制氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白OsAAP3的表示出[40],提高了作物的氨基酸含量，并通過促進水稻的芽生長和分蘗數(shù)的增加提高了谷物產(chǎn)量.2.1.2、加強抗病性植物病毒感染不僅影響作物的產(chǎn)量，更對糧食安全構(gòu)成嚴重威脅.CRISPR技術(shù)應(yīng)用于作物抗病性研究已有很多實例：2021年，ZahirA等證實CRISPR-Cas9系統(tǒng)可用于植物中以賦予其對DNA病毒的分子免疫[41];2021年，ZhaoK等設(shè)計的針對水稻OsERF922基因的CRISPR-Cas9SSN(C-ERF922)[42],改善了稻瘟病抗性；2021年，PengA等通過CRISPR-Cas9靶向編輯柑橘關(guān)鍵抗性基因CsLOB1啟動子[43],大大改善了柑橘的潰瘍病抗性.除此之外，CRISPR系統(tǒng)還可實現(xiàn)對作物抗蟲害基因的編輯和挑選，如2021年KhanalC等通過該技術(shù)編輯棉花中的腎臟線蟲抗性基因[44].2.1.3、保障育種安全性對于食品安全問題，轉(zhuǎn)基因作物備受爭議，而CRISPR編輯的作物經(jīng)USDA認定不在轉(zhuǎn)基因監(jiān)管范圍之內(nèi).2021年，MickaelM將純化的CRISPR-Cas9核酸酶蛋白直接遞送至葡萄和蘋果的原生質(zhì)體內(nèi)[45],實現(xiàn)非轉(zhuǎn)基因的靶向基因編輯.還有研究者使用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瞬時CRISPR-Cas9基因表示出系統(tǒng)開創(chuàng)建立非轉(zhuǎn)基因的突變植物[46].這些非轉(zhuǎn)基因的育種方式方法為育種挑選提供了便利，同時提高了公眾的接受度，這對于商業(yè)化和大規(guī)模生產(chǎn)特別重要.2.2、動物育種自2020年CRISPR-Cas9技術(shù)成功應(yīng)用于哺乳動物細胞研究以來，該技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于動物育種.2.2.1、畜禽遺傳育種健康生活的需求使人們選擇食用更多瘦肉，因而提高家畜的瘦肉率是有意義的工作.2021年，趙建國等通過CRISPR向豬細胞內(nèi)插入UCP1基因[47],該基因負責(zé)棕色脂肪組織介導(dǎo)的產(chǎn)熱，并在防止感冒和調(diào)節(jié)能量穩(wěn)態(tài)中起關(guān)鍵作用.UCP1基因的插入可減少脂肪沉積、增加瘦肉率，培育出的豬比正常豬的脂肪少24%,同時抗寒性更好.2021年，ZouY等通過CRISPR-Cas9進行FBXO40基因的敲除[48],培育出的豬肌肉肥大，且沒有可檢測的病理效應(yīng).除了改進家畜的肉質(zhì)品質(zhì)，CRISPR技術(shù)還用于提高家畜的抗病性.禽白血病病毒亞群J(avianleukosisvirussubgroupJ,ALV-J)已給家禽業(yè)造成了重大的經(jīng)濟損失.2021年，LeeHJ等通過CRISPR精到準確編輯雞細胞中ChNHE1受體基因的關(guān)鍵位點[49],賦予了雞對ALV-J的抗性，表示清楚該技術(shù)能夠用于開發(fā)抗病品系.2.2.2、其他高價值動物遺傳育種CRISPR技術(shù)的應(yīng)用可實現(xiàn)寵物基因靶向編輯[50],知足客戶的個性化需求，同時也有助于寵物疾病的治療.基因編輯技術(shù)還可與克隆技術(shù)相結(jié)合，通過基因編輯敲除或敲入動物的某個基因，培育出有優(yōu)良性狀的品種，再通過克隆技術(shù)大量繁衍.世界首只基因編輯克隆犬“龍龍〞在中國誕生，它不僅僅是一只克隆犬，且其供體細胞來自于世界首例基因編輯疾病模型犬“蘋果〞.因而，對于有較高價值的動物，通過克隆技術(shù)能夠擴展基因編輯技術(shù)的應(yīng)用范圍.3、基于CRISPR技術(shù)的高通量挑選明確產(chǎn)生相應(yīng)性狀的基因是基因編輯技術(shù)應(yīng)用的前提.研究人員通常使用高通量挑選技術(shù)確認基因與性狀的聯(lián)絡(luò).結(jié)合CRIPSR-Cas9和二代測序技術(shù)的大規(guī)模基因敲除挑選方式方法，能夠極大地推動特異細胞類型及處理條件下挑選相關(guān)基因、藥物反響及抗藥發(fā)生等工作，還可快速、準確地找到與某種表型相關(guān)的基因，發(fā)現(xiàn)新的藥物靶標[51].相對于傳統(tǒng)的小干擾RNA敲降挑選、常規(guī)的突變挑選，CRISPR挑選實驗具有通量大、效率高及花費低廉的特點，這些優(yōu)勢使該方式方法具有宏大的應(yīng)用潛力.CRISPR-Cas9文庫高通量挑選能夠分為陽性挑選與陰性挑選2種形式[52]:陽性挑選對細胞文庫施加挑選壓力，只要少數(shù)目的表型細胞能夠存活；陰性挑選中存活的細胞并不是目的表型細胞，因而需要比擬不同時間點sgRNA的豐度，找出差異sgRNA確定關(guān)鍵基因(圖2).2種挑選方式都常需要與高通量測序技術(shù)結(jié)合應(yīng)用[53].圖2CRISPR-Cas9高通量挑選流程CRIPSR技術(shù)應(yīng)用于高通量挑選已有很多實例，證明其具有實用性和廣泛的適用性.2020年，張鋒等利用基因組規(guī)模的CRISPR-Cas9敲除(GeCKO)文庫[54],鑒定癌癥和多能干細胞中細胞存活所必需的基因，并在一個黑色素瘤模型中，挑選與vemurafenib耐藥性有關(guān)的基因，觀察到獨立的引導(dǎo)RNA對同一基因的高度一致性和高命中率，證明了使用CRISPR-Cas9進行基因尺度挑選的前景.2020年，ZhouY等通過基因敲除文庫挑選[55],成功鑒定炭疽和白喉毒素是細胞中毒所需的宿主基因.2021年，Pandolfi等開發(fā)了一種CRISPR激活lncRNA的挑選策略[56],可靶向14701種lncRNA基因.他們著重關(guān)注控制阿糖胞苷(cytarabine,Ara-C)耐藥性的遺傳學(xué)特征，通過基于CRISPR的高通量挑選方式方法評估哪些基因可能決定阿糖胞苷的耐藥性.CRISPR技術(shù)允許研究人員一次分析成千上萬個編碼基因和lncRNA,并可激活任意感興趣的基因.2021年，KurataJS和LinRJ構(gòu)建了靶向1594個(85%)已經(jīng)知道的人類miRNA莖環(huán)的sgRNA庫[57],并利用這個sgRNA庫挑選影響HeLa或NCI-N87細胞適應(yīng)度的miRNA.4、瞻望近年來，CRISPR技術(shù)飛速發(fā)展，在獲得顯著成績的同時也不免引人擔(dān)憂.最新的研究表示清楚，CRISPR-Cas9基因療法中發(fā)揮作用的細胞通常不攜帶功能性p53基因，如將這種基因療法改造過的細胞轉(zhuǎn)移到患者體內(nèi)，或許會誘發(fā)癌癥[58].CRISPR技術(shù)的脫靶現(xiàn)象也是重要的安全問題，最近(NatureBiotechnology〕上的一篇研究報告對CRISPR技術(shù)的安全性提出質(zhì)疑[59],并指出需要進行全面的基因組分析，以便在對患者給藥前鑒定具有正常基因組的細胞.以上是CRISPR技術(shù)發(fā)展中不得不面臨的問題，可從提高CRISPR技術(shù)安全性和技術(shù)性創(chuàng)新兩方面著手進行改善.相信經(jīng)過科學(xué)家的不懈努力，CRISPR技術(shù)將會給我們帶來更多驚喜.在提高CRISPR技術(shù)安全性方面，研究者開發(fā)新型Cas9核酸酶提高基因編輯安全性[60].RothTL等利用電穿孔成功對人T細胞進行CRISPR基因編輯且無需病毒載體[61].Carlson-StevermerJ等利用RNAaptamer分子膠組裝出一種CRISPR修復(fù)工具包并將其運送到DNA切割位點上[62],大大提高了修復(fù)精準度.與傳統(tǒng)CRISPR技術(shù)相比，該方式方法的準確率提高了10倍.在技術(shù)創(chuàng)新方面，研究人員也在努力發(fā)現(xiàn)新的CRISPR系統(tǒng)，并通過與其他技術(shù)結(jié)合擴展其應(yīng)用范圍.SilvanaKonermann等發(fā)現(xiàn)歸類為VI-D型的靶向RNA的CRISPR系統(tǒng)[63].受CRISPR系統(tǒng)介入細菌免疫調(diào)節(jié)機制的啟發(fā)，DoronS等通過測試抗噬菌體活性[64],發(fā)現(xiàn)9個新的抗噬防御系統(tǒng)家族和1個在微生物中廣泛存在的抗質(zhì)粒系統(tǒng)，并顯示出強烈的抗外來DNA入侵的能力.一旦它們的機制被破譯，將來可能會被改造成有用的分子工具.Hansen-BruhnM等開發(fā)一種使用超聲推進的方式方法將CRISPR-Cas9輸送進癌細胞的納米馬達[65],通過可逆的二硫鍵將Cas9-sgRNA復(fù)合物加載到納米馬達外表上，隨后超聲處理5min使其穿透細胞質(zhì)膜，這對臨床治療應(yīng)用有很大價值.毫無疑問，將來將會出現(xiàn)更多以新方式應(yīng)用CRISPR技術(shù)來提高人類生存質(zhì)量的例子.除了利用CRISPR技術(shù)獨特的優(yōu)勢和能力，研究人員還應(yīng)該專注于將新的基因編輯工具與其他成熟技術(shù)相結(jié)合，以提供更靈敏、強大的技術(shù)手段，進而更好地造福人類.以下為參考文獻[1]JANSENR,EMBDENJD,GAASTRAW,etal.IdentificationofgenesthatareassociatedwithDNArepeatsinprokaryotes[J].MolMicrobiol,2002,43(6):1565-7155.[2]BARRANGOUR,FREMAUXC,DEVEAUH.etal.CRISPRprovidesacquiredresistanceagainstvirusesinprokaryotes[J].Science,2007,315(5819)-1709-1712[3]LANDERES.TheheroesofCRISPR[J]Cll,.2021,164(1/2)-:18-28.[4]MAKAROVAKS,KOONINEV.AnnotationandclassificationofCRISPR-Cassystems[J].MethodsMolBiol,2021,1311:47-75.[5]SHMAKOVS,ABUDAYYEH0O,MAKAROVAKS,etal.Discoveryandfunctionalcharacterizationofdiverseclass2CRISPR-Cassystems[J].MolCell,2021,60(3):385-97.[6]WRIGHTAV,NUNEZJK,DOUDNAJA.BiologyandapplicationsofCRISPRsystems:Harnessingnaturestoolboxforgenomeengineering[J].Cell,2021,164(1/2):29-44.[7]JINEKM,CHYLINSKIK,FONFARAI,etal.Aprogrammabledual-RNA-guidedDNAendonucleaseinadaptivebacterialimmunity[J].Science,2020,337(6096):816-21.[8]CONGL,RANFA,COXD,etal.MultiplexgenomeengineeringusingCRISPR/Cassystems[J]Science,2020,339(6121):819-823.[9]JINEKM,EASTA,CHENGA.etal.RNA-programmedgenomeeditinginhumancells[J]Elife,2020,2:e00471.doi:10.7554/eLife.00471.[10]PENNISIE.TheCRISPRcraze[J].Science,2020,341(6148):833-836.[11]KIMYG,CHAJ,CHANDRASEGARANS.Hybridrestrictionenzymes.zincfingerfusionstoFokIcleavagedomain[J].ProcNatlAcadSciUSA,1996,93(3):1156-1160.[12]REYOND,TSAISQ,KHAYTERC,etal.FLASHassemblyofTALENsforhigh-throughputgenomeediting[J]NatBiotechnol,2020,30(5):460-465.[13]AUERTO,DUROUREK,CIANAD,etal.HighlyefficientCRISPR/Cas9-mediatedknock-ininzebrafishbyhomology-independentDNArepair[J].GenomeRes,2020,24(1):142-153.[14]BAUERDE,CANVERMC,ORKINSH.GenerationofgenomicdeletionsinmammaliancelllinesviaCRISPR/Cas9[J].JVisExp,2021(95):e52118.[15]HUANGXiaosong,WANGYing,YANWei,etal.Productionofgene-correctedadultbetaglobinproteininhumanerythrocytesdifferentiatedfrompatientiPSCsaftergenomeeditingofthesicklepointmutation[J]StemCells,2021,33(5):1470-1479.[16]MAYuanwu,ZHANGLianfeng,HUANGXingxu.GenomemodificationbyCRISPR/Cas9[J].FebsJ,2020,281(23):5186-5193.[17]LOWDERLG,ZHANGDengwei,BALTESNJ,etal.ACRISPR/Cas9toolboxformultiplexedplantgenomeeditingandtranscriptionalregulation[J].PlantPhysiol,2021,169(2):971-985.[18]LIUXS,WUHao,KRZISCHM,etal.RescueoffragileXsyndromeneuronsbyDNAmethylationeditingoftheFMR1Gene[J].Cell,2021,172(5):979-992.[19]MADDAIOD,MANCHADOE,CONCEPCIONCP,etal.InvivoengineeringofoncogenicchromosomalrearrangementswiththeCRISPR/Cas9system[J].Nature,2020,516(7531):423-427.[20]ZUOE,HUOX,YAOX.etal.CRISPR/Cas9-mediatedtargetedchromosomeelimination[J].GenomeBiol,2021,18(1):224.[21]LIUPeng,CHENMeng,LIUYanxia,etal.CRISPR-basedchromatinremodelingoftheendogenousOct4orSox2locusenablesreprogrammingtopluripotency[J].CellStemCell,2021,22(2):252-261.[22]XULei,YANGHuan,GAOYang,etal.CRISPR/Cas9-mediatedCCR5ablationinhumanhematopoieticstem/progenitorcellsconfersHIV-1resistanceinVivo[J].MolTher,2021,25(8):1782-1789.[23]OPHINNIY,INOUEM,KOTAKIT,etal.CRISPR/Cas9systemtargetingregulatorygenesofHIV-1inhibitsviralreplicationininfectedT-cellcultures[J].SciRep,2021,8(1):7784.[24]ZHENS,HUAL,TAKAHASHIY,etal.Invitroandinvivogrowthsuppressionofhumanpapillomavirus16-positivecervicalcancercellsbyCRISPR/Cas9[J].BiochemBiophysResCommun,2020,450(4):1422-1426.[25]GORIJL,HSUPD,MAEDERML,etal.DeliveryandspecificityofCRISPR-Cas9genomeeditingtechnologiesforhumangenetherapy[J].HumGeneTher,2021,26(7):443-451.[26]HOBANMD,LUMAQUIND,KUOCY,etal.CRISPR/Cas9-mediatedcorrectionofthesicklemutationinhumanCD34+cells[J].MolTher,2021,24(9):1561-1569.[27]YELin,WANGJiaming,TANYuting.etal.GenomeeditingusingCRISPR-Cas9tocreatetheHPFHgenotypeinHSPCs:.AnapproachfortreatingsickleceIIdiseaseandbeta-thalassemia[J].ProcNatlAcadSciUSA,2021,113(38):10661-10665.[28]BOURZACK.Genetherapy:Erasingsickle-celldisease[J].Na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