實(shí)驗(yàn)3、植物染色體標(biāo)本制備及核型分析目前，國內(nèi)外常用的植物染色體制片技術(shù)可以分為兩種，即壓片技術(shù)和去壁低滲技術(shù)。Belling(1921提出植物染色體壓片技術(shù)后，壓片已成為植物染色體研究中最廣泛應(yīng)用的常規(guī)技術(shù)；但是由于植物細(xì)胞有堅(jiān)實(shí)的細(xì)胞壁，染色體很難象動物染色體那樣平整地貼在載玻片上，Omura和Kurata(1978把植物原生質(zhì)體技術(shù)應(yīng)用到水稻染色體研究之中，用纖維素酶、果膠酶和氯化鉀處理取得了一定的進(jìn)展，陳瑞陽等人（1979、1982）提出了植物染色體標(biāo)本制備的酶解去壁低滲技術(shù)，并在多種植物上得到廣泛應(yīng)用，成為當(dāng)今植物染色體研究中的重要方法。壓片技術(shù)和去壁低滲技術(shù)在取材和預(yù)處理要求及其操作都是相同的，即兩者的材料基礎(chǔ)條件是相同的，但它們所采用的染色體分散方法是不同的。壓片法是以人工外加機(jī)械壓力使染色體分散，而去壁低滲法是用酶分解細(xì)胞壁，低滲液使細(xì)胞膜吸脹、水表面張力使染色體分開。兩種技術(shù)各有其優(yōu)缺點(diǎn)，前者操作快速簡便、省材省時(shí)，后者染色體易于展開、且真實(shí)不變形，尤其是對成熟細(xì)胞多的植物組織，如芽、愈傷組織等材料有獨(dú)到效果，本實(shí)驗(yàn)主要介紹去壁低滲染色體制片技術(shù)。一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、掌握植物根尖、莖尖及葉片去壁低滲染色體制片技術(shù)，通過3周開放性實(shí)驗(yàn)教學(xué)，進(jìn)行植物染色體制片技能訓(xùn)練；2、掌握植物染色體顯微照象技術(shù)及組型分析技術(shù)，通過大量的制片觀察，能獲得圖象清晰、完整、高度分散的染色體典型制片；通過顯微攝影，獲得某植物染色體自然核型圖，并能用國內(nèi)外通用的植物核型分析標(biāo)準(zhǔn)，確定該植物染色體模型圖、核式公式及類型；3、掌握植物有絲分裂制片技術(shù)，通過大量的制片觀察，能比較快速準(zhǔn)確地判斷細(xì)胞有絲分裂前、中、后、末期的染色體圖象，并對其典型制片照像，收集核型分析及有絲分裂過程觀察的染色體制片素材；4、結(jié)合實(shí)驗(yàn)，對某一新資源植物進(jìn)行染色體組型分析，獲得該物種染色體組型公式、類型、核型圖及核型模式圖。二、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容1、植物染色體制片技術(shù)訓(xùn)練，獨(dú)立完成植物根尖、莖尖及幼葉的取材、預(yù)處理、低滲、酶解、固定、制片、染色等去壁低滲染色體制片全過程，并獲得圖象清晰、完整、高度分散的染色體典型圖象制片；2、染色體顯微照相技術(shù)訓(xùn)練，用生物攝影顯微鏡，攝制某新資源植物種典型的染色體圖象照片40張，并從中挑選確定，被用于核型分析的染色體自然核型圖5張；3、植物染色體核型分析技術(shù)訓(xùn)練，用國內(nèi)外植物染色體核型分析標(biāo)準(zhǔn)，確定該新資源植物種的染色體組型公式、類型、核型圖及核型模式圖；進(jìn)行該新資源植物種染色體核型分析，力爭能將該新資源植物實(shí)驗(yàn)結(jié)果，撰寫成一篇研究小論文，或一篇能發(fā)表的研究論文；4、細(xì)胞有絲分裂典型時(shí)期識別技能訓(xùn)練，通過大量的染色體圖象觀察，能比較快速準(zhǔn)確地判斷細(xì)胞有絲分裂前、中、后、末各個(gè)時(shí)期的。三、實(shí)驗(yàn)材料1、蠶豆根尖，2n=2x=12;2、某新資源植物莖尖、幼葉或子房，如顯齒蛇葡萄、泥蒿、魚腥草等有開發(fā)潛力的新資源植物種的莖尖、幼葉或子房。四、實(shí)驗(yàn)器材1、設(shè)備：普通生物顯微鏡、NIKON數(shù)碼攝影顯微鏡、NIKON數(shù)碼相機(jī)、計(jì)算機(jī)圖象處理系統(tǒng)、培養(yǎng)箱、恒溫水浴鍋、噴墨彩色打印機(jī)等；2、用具：載玻片、蓋玻片、眼科鑷子、不銹鋼剪刀、單面刀片、磨口三角瓶、移液管、試劑瓶、凹型孔白瓷板、玻璃板、燒杯、天平、電爐、染色缸、擴(kuò)大鏡、游標(biāo)卡尺、濾紙片、玻片標(biāo)簽紙等；3、藥品：8－羥基喹啉、秋水仙素、氯化鉀、甲醇、冰乙酸、纖維素酶、果膠酶、對二氯苯、氯化鈉、檸檬酸鈉、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、氫氧化鋇、甘油、鹽酸、胰蛋白酶、尿素、氯化鈣、EDTA、Giemsa、洋紅、地衣紅、卡寶品紅、錫夫（Schiff）試劑。附試劑配制⑴0.002mol.L-18－羥基喹啉配制：取8-羥基喹啉0.29g，先用少許乙醇溶解，用鮮蒸餾水定溶1000ml。⑵0.01%秋水仙素配制：稱取1g秋水仙素，用少許乙醇溶解后，用鮮蒸餾水定溶至100ml。⑶飽和對二氯苯溶液配制：鮮配鮮用，稱取5g對二氯苯結(jié)晶，用40-45℃蒸餾水100mL溶解，振搖5min，靜置1h，取上清液，10-20℃下預(yù)處理。⑷0.075mol.L-1KCL溶液配制：稱KCL5.592g，加少許鮮蒸餾水溶解后，定溶至1000ml。⑸2.5%混合酶配制：常用濃度2.5%，取纖維素酶、果膠酶各1g，分別溶于20mL蒸餾水中，配成5%的纖維素酶及果膠酶，再等量混合，配成2.5%濃度混合酶，溶后用0.1mol.L-1鹽酸或0.1mol.L-1NAOH調(diào)pH值為5.5左右，鮮配鮮用或棕色瓶4℃下保存?zhèn)溆谩＂?XSSC溶液配制：2XSSC溶液即0.3mol.L-1氯化鈉與0.03mol.L-1檸檬酸鈉Na3C6H5O7溶液。稱氯化鈉17.53g,Na3C6H5O78.8233g,加少許鮮蒸餾水溶解后，定溶至1000ml。⑺Sorensen磷酸緩沖液配制。A液：0.067mol.L-1磷酸二氫鉀溶液，稱取KH2PO49.118g，用少許鮮蒸餾水60℃下溶后，定溶至1000ml。B液：0.067mol.L-1磷酸氫二鈉溶液，稱取Na2HPO.12H2O,23.995g,用少許鮮蒸餾水60℃下溶后，定溶至1000ml；根據(jù)使用時(shí)pH值的要求按下例比例混合。⑻Giemsa母液配制：：取Giemsa1g，甲醇66ml，優(yōu)質(zhì)甘油66ml；先將Giemsa加適量甘油充分研磨60min，無顆粒時(shí)傾盡全部甘油充分磨勻，然后在56℃下，保溫2h，冷卻后再加入甲醇（GR或AR），充分混合，盛入棕色瓶內(nèi)，4℃下保存?zhèn)溆?，保存的時(shí)間越久越好。⑼Giemsa染液：染色前鮮配鮮用，按Giemsa母液：Sorensen磷酸緩沖液=1：10稀釋后用。⑽45%醋酸溶液配制：95%冰乙酸，稀釋成45%濃度。所需濃度（45%）=冰乙酸體積／溶液體積=45ml冰乙酸×0.95／（45+50），⑾0.1mol.L-1鹽酸溶液配制：用滴定管量取濃鹽酸8.25ml，加蒸餾水至1000ml。⑿飽和氫氧化鋇溶液配制：鮮配鮮用，稱取5-8g氫氧化鋇，用100mL煮沸的蒸餾水溶解，振搖充分溶解，待冷卻后過濾，配成5%-8%的飽和氫氧化鋇水溶液⒀1mol.L-1磷酸氫二納溶液配制：稱取Na2HPO.12H2O156.01，用少許鮮蒸餾水60℃下溶后，定溶1000ml。⒁0.85%生理鹽水溶液配制：稱取0.85g氯化鈉溶于100ml蒸餾水中。⒂0.01%胰蛋白酶溶液配制：取活性單位1：250胰蛋白酶0.1g，Hank’液100ml，先用少許Hank’液溶解胰蛋白酶，然后再將余液加入，置于37℃水溶液中溶解1h，（時(shí)間長短取決于溶解度，待溶液全部透切清涼為止）。溶解后用除菌過濾器過濾，無菌分裝，密封，貼好標(biāo)簽，置于-20℃冰箱中保存，使用前用0.1mol.L-1NAOH調(diào)pH值為7.6-7.8。⒃Hank’原液配制：稱取1.4g氯化鈣溶于30-50ml的重蒸餾水中；取1000ml的燒杯及容量瓶各一個(gè)，先加入重蒸餾水800ml于燒杯中，再分別稱取氯化納80.0g、Na2HPO4.12H2O，0.6g、氯化鉀4.0g、KH2PO40.6g、MgSO4.7H2O2.0g、葡萄糖10.0g（含1分子水時(shí)為11.0g），均在前一藥品完全溶解后，方可加入后一藥品，直到完全溶解后，定溶至1000ml；用濾紙過濾后，加入氯仿2ml防腐，充分混勻后，分裝，貼好標(biāo)簽，4℃下保存。Hank’緩沖液配制：Hank’原液100ml，重蒸餾水896ml，0.5%酚紅4ml，混勻后，在5.28×104Pa下滅菌，4℃下保存。使用前用0.1mol.L-1NAOH調(diào)pH值為7.6-7.8。⒄Dhank’溶液或0.02%EDTA鈉鹽溶液配制：氯化鈉8g，綠化鉀0.20g，磷酸氫二納0.073b，磷酸二氫鉀0.20g，無水葡萄糖2.00g，EDTA20mg。重蒸餾水加至1000ml。⒅鐵醋酸洋紅染液配制：先將50mL45%的醋酸水溶液放入150mL的錐形瓶中煮沸，然后慢慢地加入0.5-1g洋紅粉末（注意不要一下倒入，以防濺出），過1-2min后，加入一銹鐵釘，再過幾分鐘后取出鐵釘（使染色劑略含鐵質(zhì)，以增強(qiáng)染色性能），繼續(xù)用微火加熱1h后，冷卻過濾，即可使用，保存于棕色瓶中（避免陽光直射）。如無洋紅也可用地衣紅代替，配制方法同前。此液常用于植物細(xì)胞核，特別是花粉母細(xì)胞的涂抹和壓碎法染色，效果良好。⒆席夫（Schiff）試劑配制：稱0.5g堿性品紅溶于煮沸的重蒸水（或蒸餾水）中，攪動使充分溶解，冷卻至50℃時(shí)，過濾于—棕色細(xì)口瓶中，加入10mLlNHCl，冷卻至25℃左右，加入1g偏亞硫酸鉀或鈉（Na2S2O5或K2S2O5），振蕩使溶解，密封瓶口，置于黑暗和低溫處過夜，次日檢查，如染色液透明無色或呈淡茶色，即可使用。如顏色較深，可加入少量優(yōu)質(zhì)活性炭（0.5-2g），振蕩1min，置4℃冰箱中過夜，經(jīng)過濾后即可使用。此液配好后，應(yīng)緊塞瓶塞，外包黑紙，貯藏于冰箱中。⒇卡寶品紅（Carborfuchsin）試劑的配制:稱3g堿性品紅，溶于100ml70%的乙醇中，稱為A原液（此液可以長期保存），取10mlA液，加入90ml15%的石碳酸溶液（兩周內(nèi)使用），稱為B原液。使用前，取B原液10ml，加入90ml45%的醋酸和1.8克山梨醇，充分溶解后備用。此液適用于植物核型分析、染色體形態(tài)觀察。五、實(shí)驗(yàn)原理凡是細(xì)胞處于活躍增殖狀態(tài)或經(jīng)過某種實(shí)驗(yàn)處理后進(jìn)入細(xì)胞分裂狀態(tài)的任何植物組織，如植物根尖、莖尖、幼葉、花蕾、幼花粉、幼胚、核型胚乳、愈傷組織、居間分生組織、莖形成層等細(xì)胞分裂狀態(tài)的植物組織均可以作為染色體分析的實(shí)驗(yàn)材料；通過8-羥基喹啉、秋水仙素、對二氯苯等預(yù)處理藥劑處理，來降低細(xì)胞質(zhì)的粘度，促進(jìn)染色體縮短分散，障礙紡錘體形成；通過纖維素酶、果膠酶酶解去壁，使分生細(xì)胞的原生質(zhì)體能從細(xì)胞壁里壓出來，經(jīng)過精心制片，使染色體周圍不帶有細(xì)胞質(zhì)或僅有少量的細(xì)胞質(zhì)，獲得圖象清晰、完整、高度分散的染色體典型圖象。各植物種的染色體數(shù)目都是恒定的，二倍體植物體細(xì)胞內(nèi)都含有兩組相同的染色體(chromosome，每一條染色體都有兩條染色單體（chromatids）。細(xì)胞有絲分裂時(shí)，每一條染色單體分向細(xì)胞兩極，形成子細(xì)胞；細(xì)胞分裂間期染色單體復(fù)制，縱裂并向的兩條染色單體往往通過著絲粒（centromere）聯(lián)在一起。著絲粒在染色體上的位置是固定的，呈現(xiàn)出一個(gè)淡染色區(qū)間。著絲粒的兩端是染色體的“兩臂”，著絲粒不在中央的染色體，就必然有長臂（q）、短臂（p）之分。由于著絲粒位置不同，可以把染色體分成中部著絲粒染色體（m）、近中部著絲粒染色體（sm）、近端部著絲粒染色體（st）及端部著絲粒染色體（t）。有些染色體除了著絲粒之外，還有一段稍窄的淡染色區(qū)，叫次縊痕；次縊痕的遠(yuǎn)端突起，為隨體（satellite）。所謂核型（karyotype）就是指：一個(gè)細(xì)胞內(nèi)的染色體按照一定的順序排列起來，所構(gòu)成的染色體圖象；通常是將顯微攝影得到的染色體照片粘貼或染色體核型分析系統(tǒng)軟件處理生成的染色體圖象。所謂組型（idiogram）就是指：通過許多細(xì)胞染色體測量，取其平均值繪制成的染色體模式圖；通常是用染色體相對長度（relativelength）、臂指數(shù)（amindex）、著絲粒指數(shù)（centromereindex）等形態(tài)特征參數(shù)來描述染色體模式圖。人類染色體研究早在1960年就召開了專門的國際會議，確定了人類染色體核型分析的國際標(biāo)準(zhǔn)，即Denver命名標(biāo)準(zhǔn)；但植物染色體核型分析至今還沒有一個(gè)專門的國際標(biāo)準(zhǔn)；1984年8月，我國第一次全國植物染色體學(xué)術(shù)討論會上，李懋學(xué)、陳瑞陽（1984）所作的“關(guān)于植物核型分析的標(biāo)準(zhǔn)化問題”報(bào)告，經(jīng)過與會代表的充分討論，成為大家的約定標(biāo)準(zhǔn)，被同行所承認(rèn)。由于染色體是基因的載體，核型代表了種屬的特征，所以染色體組型分析對于探討植物生命奧秘、生物起源、物種間親緣關(guān)系、遠(yuǎn)緣雜種鑒定等方面都有重要意義。六、實(shí)驗(yàn)方法（一）植物染色體制片技術(shù)及方法1、正確取材一般來講，凡是能進(jìn)行細(xì)胞分裂的植物組織或單個(gè)細(xì)胞，都可以作為染色體制片材料；如根尖、莖尖、幼花、幼胚、愈傷組織及正在分裂的大、小孢子母細(xì)胞等；正確取材就是強(qiáng)調(diào)取材部位一定要準(zhǔn)確，取材數(shù)量一定要少而精、切忌多而雜，材料新鮮、盡可能是活材料。⑴根尖用能見根冠的根尖材料作為實(shí)驗(yàn)材料比較適宜；植物根尖不同部位的細(xì)胞，其分裂細(xì)胞頻率有明顯的差別；根冠是由不同分化程度的薄壁細(xì)胞組成，且常含淀粉粒，根冠細(xì)胞已經(jīng)停止細(xì)胞分裂，染色體制片時(shí)應(yīng)該切除根冠；但因根冠很容易識別，且根冠后1-2mm長的根段就是根尖分生區(qū)細(xì)胞，所以，根冠是確定根尖分生細(xì)胞區(qū)的重要標(biāo)志；染色體制片時(shí)，比較重視能見根冠的根尖材料作為實(shí)驗(yàn)材料比較適宜。根尖分生細(xì)胞區(qū)多為等直徑的分裂細(xì)胞，其細(xì)胞質(zhì)濃，細(xì)胞核大、細(xì)胞核體積約占整個(gè)細(xì)胞體積的3/4，是染色體制片的好材料；染色體制片取材如果不是在根尖分生細(xì)胞區(qū)取材，即使制片全過程每一環(huán)節(jié)都作得很好，也是徒勞的。根尖分生區(qū)上端是伸長區(qū)，該區(qū)的細(xì)胞主要是細(xì)胞體積增加，基本上已停止分裂。所以，根尖染色體制片的取材部位是根冠末端1-2mm的根段為宜。以洋蔥為例，根冠區(qū)約，分生區(qū)1－2mm，3mm之后為伸長區(qū)（圖9-1）。物種不同根冠及分生區(qū)的長度也不同，一般而言，用于染色體制片的根尖長度，以根冠末端1-2mm為宜。圖9-1洋蔥跟尖縱切面，各部分細(xì)胞分裂的頻率差異植物體細(xì)胞染色體的研究中，根尖分生組織是主要的染色體制片材料；因?yàn)樗〔姆奖?，分生區(qū)易于區(qū)別，如果用種子發(fā)芽取根，還不受季節(jié)的影響，這是其他材料所不及的。根尖材料獲得的方法很多，常有種子發(fā)芽、鱗莖水培、扦插取根、引發(fā)氣生根等。①種子萌發(fā)取根：生長健壯的根尖不僅細(xì)胞分裂頻率較高，而且染色體形態(tài)也比較平直，也就是所謂的“硬染色體”；而根尖生長勢差的材料，不僅細(xì)胞分裂頻率低，而且染色體形態(tài)也多是扭曲的，也就是所謂的“軟染色體”。所以，種子萌發(fā)取根，不僅要求種子的飽滿度、生活力等品質(zhì)性狀好之外，還要求種子萌發(fā)條件最佳，獲得最佳的“硬染色體”。②鱗莖水培：洋蔥、水仙、蒜、風(fēng)信子等材料多用此方法；在水培過程中，注意經(jīng)常更換新鮮的同溫水，是獲得良好材料的關(guān)鍵。③扦插取根：揚(yáng)、柳、桑、葡萄、菊花等扦插繁殖植物多用此方法；在扦插繁殖過程中，注意保濕通氣，可以獲得良好的根尖材料。⑵莖尖用能見生長錐的莖尖材料作為實(shí)驗(yàn)材料比較適宜；莖尖一般包括有生長錐和葉原基兩部分，廣義上講的芽，還包括有幼葉和腋芽原基。生長錐是莖的頂端分生細(xì)胞組織區(qū)，不同植物或同一植物的不同發(fā)育階段，其生長錐的大小和形狀都有較大的變化，他們可以是下凹、園丘、園錐或極端伸長（如禾本科）等多種不同的形狀；生長錐的寬度，因物種不同也不同；丁香生長錐寬度<40μm，蘇鐵生長錐寬度達(dá)300μm。生長錐不同部位的細(xì)胞，其細(xì)胞分裂的頻率及細(xì)胞周期長短有明顯的差異。一般來講，生長錐則面的葉原基細(xì)胞比生長錐中心區(qū)細(xì)胞的分裂周期短一倍左右；如曼佗羅生長錐中心區(qū)及葉原基區(qū)細(xì)胞分裂周期分別為76、36h，菊花生長錐中心區(qū)及葉原基區(qū)細(xì)胞分裂周期分別為140、70h。也就是說，生長錐則面的葉原基細(xì)胞也是染色體制片取材的好材料。莖尖取材以生長錐頂開始為宜，休眠芽不宜用作染色體制片的材料。莖尖取材工作是比較繁復(fù)的，需要細(xì)心地剝掉全部幼葉，用擴(kuò)大鏡觀察，能見生長錐時(shí)方可（圖9-2）。9-2茶葉葉芽縱切面圖物種不同，生長錐的形狀及寬度，因物種不同也不相同，且易受季節(jié)影響；所以，莖尖取材技術(shù)難度比根尖取材技術(shù)要高。莖尖的正確取材，更需要強(qiáng)調(diào)取材部位一定要準(zhǔn)確，取材數(shù)量一定要少而精、切忌多而雜，應(yīng)在擴(kuò)大鏡下，盡可能地剝除幼葉、盡可能地減少木質(zhì)分子結(jié)晶的干擾。⑶幼葉幼葉是葉原基頂端分生細(xì)胞繼續(xù)分裂發(fā)育形成的小葉，其發(fā)育早期主要是細(xì)胞分裂使葉原基伸長、增加體積、形成葉軸，所以幼葉可以作為染色體制片的材料。幼葉的分生組織，按其分布位置可以分為頂端分生組織、近軸分生組織、邊緣分生組織、居間分生組織及板狀分生組織等。一般來講，頂端分生組織的細(xì)胞分裂使整個(gè)葉原基伸長、形成錐形的葉軸（圖9-3），是沒有分化的細(xì)胞，但其分裂活動停止較早；居間分生組織的細(xì)胞分裂活動停止較晚，是染色體制片取材的好材料；邊緣分生組織的細(xì)胞分裂形成扁平的葉片，其分裂活動依物種葉片厚度不同而不同。幼葉的取材大小，依物種而異，但總原則是幼葉越小越好，一般以含有葉軸的幼葉5－10mm長為宜，子葉則以－3mm為宜。圖9-3煙草幼葉順序圖解⑷花蕾花蕾是指花芽分化始期至減數(shù)分裂之前的幼蕾，包括花辨原基、雌蕊原基及雄蕊原基正在細(xì)胞分裂的花芽（圖9-4）。圖9-4桃的花芽分化花蕾是僅次于根尖染色體制片的理想材料，它的最大優(yōu)點(diǎn)是在植物孕蕾階段，可以直接從植株上取得大量的制片材料，幼小的花藥和子房，往往比根尖更便于制片操作，且細(xì)胞分裂指數(shù)比根尖材料高；花蕾的取材時(shí)間，通常需要定期鏡檢作出選擇，其方法是取幼小花藥或子房在植物孕蕾期，多數(shù)植物在開花前10d以上；其方法是取含有幼小花藥和子房的小花3－5mm左右方可。⑸花粉是指花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂后，所形成的小孢子至發(fā)育成為雄配子體過程中的花粉粒，植物小孢子形成后，要經(jīng)過1-2次有絲分裂，形成具有兩核或三核細(xì)胞花粉。如百合科、石蒜科、鴨跖科、茄科等植物為兩核細(xì)胞花粉，禾本科、菊科等植物為三核細(xì)胞花粉，極少數(shù)植物是兩核和三核細(xì)胞兼有，如堇菜屬植物。利用小孢子有絲分裂過程來觀察染色體，有獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)：其一、是染色體數(shù)目減半后的細(xì)胞，染色體數(shù)目是單倍數(shù)，為染色體記數(shù)或核型分析提供了極大的方便；其二、花粉分裂細(xì)胞數(shù)目多，可以同時(shí)獲得大量的實(shí)驗(yàn)材料；其三、一般都不需要進(jìn)行預(yù)處理和細(xì)胞解離，操作簡便。因此，對難以獲得種子或種子發(fā)芽困難的植物來說，是比較理想的材料來源。取樣時(shí)間，與減數(shù)分裂取材時(shí)間相當(dāng)，多數(shù)植物在開花前3－12d，主要以植物的某些形態(tài)特征為參考依據(jù)。如小麥在麥穗伸出旗葉1-4cm,玉米雄花序抽出3cm左右，棉花花蕾10-13mm,芍藥花蕾直徑1.5-2cm,銀杏花藥呈黃綠色時(shí)等形態(tài)特征，都是處于減數(shù)分裂后第一、二次有絲分裂時(shí)期，是染色體制片最佳取樣時(shí)期。⑹愈傷組織是指人工培養(yǎng)條件下產(chǎn)生的愈傷組織。在一塊愈傷組織中，細(xì)胞分裂比較集中的部位，通常難以確定，受培養(yǎng)條件的影響較大，因此，準(zhǔn)確取材比較困難。一般來講，以轉(zhuǎn)移到新鮮培養(yǎng)基上，經(jīng)3-7天培養(yǎng)后的材料比較適宜；在解剖鏡下觀察，細(xì)胞個(gè)體小，細(xì)胞核大，細(xì)胞質(zhì)濃的愈傷組織分生細(xì)胞是染色體制片最佳取樣材料，而細(xì)胞體積較大、比較疏松透明的細(xì)胞群，因細(xì)胞老化，而難以獲得理想的染色體。2、預(yù)處理⑴目的及作用：植物有絲分裂中期染色體高度濃縮，形態(tài)和結(jié)構(gòu)都比較清楚，但因紡垂體的作用，染色體緊密地排列在赤道板上，很難將其分開,尤其是染色體數(shù)目較多的植物材料，很容易產(chǎn)生染色體嚴(yán)重重疊；而且因細(xì)胞分裂中期維持的時(shí)間短，一般僅10-30min，使中期染色體細(xì)胞出現(xiàn)頻率不高。為了克服上述矛盾，常用化學(xué)或物理方法對材料進(jìn)行預(yù)處理。這些方法的作用機(jī)理及其作用是：①阻止或破壞紡垂體微管的形成，由于沒有紡垂體的作用，細(xì)胞有絲分裂過程，被阻抑在細(xì)胞分裂中期階段，從而累計(jì)比較多的處于細(xì)胞分裂中期的染色體圖象。②促進(jìn)染色體濃縮變短，減少染色體之間相互纏繞重疊，有利染色體的高度分散。③改變胞質(zhì)粘度，促進(jìn)染色體清晰，促進(jìn)細(xì)胞質(zhì)清潔。所以預(yù)處理是否適宜，是染色體制片技術(shù)中最關(guān)鍵的操作步驟；如果預(yù)處理的效果良好，即使是初學(xué)者也不難制作出優(yōu)良的染色體標(biāo)本，反之，如果預(yù)處理失敗，即使是很有經(jīng)驗(yàn)的人也難以制作出好的制片。⑵處理藥劑可以用作染色體預(yù)處理的化學(xué)藥品，主要有生物堿、甙類、酸類及其他物質(zhì)；最常用的化學(xué)藥品有秋水仙素、8－羥基喹啉及對二氯苯。①秋水仙素（Colchicine）：是從石蒜科秋水仙素屬秋水仙(Colchicumautumnale種子或鱗莖中提取的一種生物堿，其分子式為C22H25NO6+1.5H2O，分子量為399.45。純秋水仙素為針狀結(jié)晶，商品多為白色或淡黃色粉末,融點(diǎn)155℃，易溶于水、酒精、氯仿及甲醛中,但在熱水中的溶解度差，不溶于苯。劇毒,易引起眼睛失明或中樞神徑麻醉，使用時(shí)一定要要注意安全。秋水仙素預(yù)處理的有效濃度為0.001-1%，常用濃度為0.05-0.2%。②8－羥基喹啉（8-hydroxyquinoline）：白色結(jié)晶或粉末,其分子式為HO8H3N：CHCH：CH，分子量145.17。溶于酒精，難溶于水,需60℃、2－3h才完全溶解。8－羥基喹啉不僅具有秋水仙素的預(yù)處理的效果，而且所顯示的染色體縊痕及隨體的結(jié)構(gòu)，往往比秋水仙素更為清晰，尤其在處理中、小型染色體比秋水仙素好，能使染色體、縊痕及隨體的圖象更清晰。常用濃度為0.002mol/L，少數(shù)學(xué)者使用0.004mol/L濃度，但使用者不多。③對二氯苯（p-dichlorobenzene）:為一種苯的衍生物，其分子式為C6H2CI2，分子量為。商品對二氯苯為無色結(jié)晶，大塊時(shí)呈白色，具有特殊臭味，常溫下可以升華揮發(fā)；易溶于乙醇、乙醚、苯等有機(jī)溶劑，難溶于水；易燃、有毒，通常用作防腐劑。對二氯苯比秋水仙素遠(yuǎn)為價(jià)廉而易得，藥劑配制及使用方便，易于廣泛使用。對二氯苯在水中的溶解度很低，多用飽和水溶液進(jìn)行預(yù)處理；所以，對不同植物預(yù)處理時(shí)僅需要考愈處理的時(shí)間長短，不需要考慮濃度。對二氯苯應(yīng)用范圍廣泛，對大染色體、小染色體植物預(yù)處理都有效。對二氯苯不僅對紡錘體微管的組裝有較強(qiáng)的阻抑作用，還可能對其他微管蛋白或某些細(xì)胞器有分解作用，能很大程度上改變細(xì)胞質(zhì)粘度，稱之為細(xì)胞質(zhì)清除作用。因此，使染色體易于分散，尤其是對染色體數(shù)目多的細(xì)胞，染色體分散效果好。但對二氯苯對細(xì)胞代謝活動有較大的毒害作用，預(yù)處理溫度太高或時(shí)間太長，都容易導(dǎo)致染色體斷裂、粘連等類似于輻射畸變的效果，曾被用作植物的化學(xué)誘變劑。因此，嚴(yán)格控制預(yù)處理時(shí)間、溫度條件是非常重要的。一般采用鮮配鮮用的方法，即稱取5g對二氯苯結(jié)晶，用40-45℃蒸餾水100mL溶解，振搖5min，靜置1h，取上清液，10-20℃下預(yù)處理。⑶處理方法預(yù)處理的方法往往容易被忽視，但預(yù)處理失敗的實(shí)驗(yàn)多是預(yù)處理的方法使用不當(dāng)而致。就材料本身而言，預(yù)處理的方法有離體處理、非離體處理和低溫三種。①離體處理：即將處理器官或組織從母體上切除下來，浸沒在預(yù)處理液中。該處理方法的主要特點(diǎn)是藥物作用迅速，短時(shí)簡便，良好的預(yù)處理效果是在細(xì)胞的某些合成作用受到抑制，而前期分裂過程又能正常進(jìn)行的條件下獲得的。由于被處理的材料小，離開了母體，細(xì)胞代謝的能源被中斷，加上處于嚴(yán)重缺氧和有毒的惡劣環(huán)境中，一旦處理時(shí)間太長或毒害太大，細(xì)胞將會因缺氧中毒、死亡。所以，預(yù)處理的技術(shù)性強(qiáng)，操作要求高。多用培養(yǎng)皿鋪2層濾紙，加一淺層預(yù)處理液，均勻擺齊，讓少部分材料能露出預(yù)處理液的液面，也可以用指形管沉沒材料的方法進(jìn)行處理。一般來講，提高預(yù)處理效果，應(yīng)該做到：被處理的材料忌多，根尖或莖尖每管不超過15個(gè)，每皿不超過30個(gè)；切取的材料忌大，根尖或莖尖長2－3mm；注意避光通氧，采用經(jīng)常更換預(yù)處理液或振搖的方法完成預(yù)處理過程；預(yù)處理溫度不宜太高，20℃為宜，一般不超過25℃；預(yù)處理時(shí)間依物種不同而不同，一般1－3h。②非離體處理：預(yù)處理材料沒有與母體分開，僅僅是把要預(yù)處理的部分浸入預(yù)處理液中，如帶有種子種根、鱗莖、根狀莖、莖節(jié)的根尖，只將根尖分生區(qū)浸沒在預(yù)處理液中進(jìn)行處理。由于分生組織沒有離開母體，耐藥抗毒性強(qiáng)，允許延長相應(yīng)的處理時(shí)間，但也正因?yàn)槿绱耍幬锏淖饔靡蚕鄳?yīng)減慢。所以，處理的持續(xù)時(shí)間便隨之延長。如果處理得當(dāng)，非離體處理比離體處理積累的中期分裂細(xì)胞更多。非離體處理的藥物多是秋水仙素，因預(yù)處理時(shí)間過長，則可能導(dǎo)致染色體數(shù)目加倍，產(chǎn)生多倍化細(xì)胞。處理的方法是，把分生區(qū)組織浸沒在預(yù)處理液中，20℃條件下，多數(shù)植物一般不超過25℃，大染色體類型材料處理12－20h、小染色體類型材料處理4－5h。如果需要將預(yù)處理材料保存7天以上時(shí)，用非離體處理比較好。③低溫處理：低溫也可以阻抑紡錘體微管的組裝，與預(yù)處理藥物有異曲同工的效果。但是，低溫作為一種預(yù)處理的方法，并不能適用于所有植物。這是因?yàn)椴煌参锏姆稚M織細(xì)胞對低溫的反應(yīng)是不同的，其細(xì)胞的合成、代謝及分裂都有不同的臨界低溫，尤其在離體條件下情況十分復(fù)雜。至今，用低溫預(yù)處理獲得較好效果的報(bào)道仍然很少。成功的例子主要是禾本科農(nóng)作物，如小麥、黑麥、大麥用1-4℃低溫，水稻、玉米用6-8℃低溫預(yù)處理能獲得較好的效果。低溫也有抑制紡垂體形成的作用，將活體材料或離體材料浸入蒸餾水，置于4℃冰箱中處理20-40小時(shí)，有一定的預(yù)處理效果。3、前低滲⑴目的與作用：自20世紀(jì)50年代在人類及哺乳動物染色體制備研究中的低滲和火焰干燥法發(fā)明以來，就有許多學(xué)者試圖將人類染色體標(biāo)本的低滲技術(shù)引入到植物染色體標(biāo)本制備上，但都沒有進(jìn)展。直到1979年，陳瑞陽等人在前人工作的基礎(chǔ)上，通過37科422個(gè)物種廣泛試驗(yàn)，才創(chuàng)建了一套完整的去壁低滲技術(shù)。低滲的目的是促使分裂細(xì)胞膨脹，細(xì)胞膜的淋巴細(xì)胞膨脹，使染色體從細(xì)胞膜內(nèi)釋放出來，能使細(xì)胞質(zhì)和染色體上部分蛋白質(zhì)丟失。植物染色體標(biāo)本制備中的前低滲，其主要作用有兩個(gè)：①促進(jìn)質(zhì)壁分離，有利于用酶去壁。②促進(jìn)細(xì)胞質(zhì)粘度改變，有利于染色體圖象清晰。★為什么說前低滲是染色體標(biāo)本制作的關(guān)鍵技術(shù)？⑵處理藥劑：一般多用氯化鉀作為前低滲藥劑，KCL為白色結(jié)晶,分子量，易溶于水，常用濃度，也可以用雙重蒸餾水前低滲，但比氯化鉀低滲效果差些。⑶處理方法：去掉預(yù)處理液，用氯化鉀低滲液浸沒材料，25℃下處理30min。如果因時(shí)間或工作的原因，需將預(yù)處理材料保存幾天或一段時(shí)間，則前低液處理時(shí)間不宜太長，一般不超過10min(6－8min，用甲醇：冰乙酸=3:1鮮固定液固定4h,轉(zhuǎn)入75%乙醇，再轉(zhuǎn)入50%乙醇中保存?zhèn)溆?。酶處理之前，用蒸餾水沖洗多次，并浸泡30min。★為什么要強(qiáng)調(diào)用蒸餾水多次沖洗、并浸泡后，再進(jìn)入酶解去壁？4、酶解去壁⑴目的與作用：Gill(1974在壓片前應(yīng)用纖維素和果膠酶對細(xì)胞壁進(jìn)行解離，Mouras(1978等人用煙草愈傷組織經(jīng)纖維素處理獲得染色體，Omura和Kurata(1978在水稻染色體研究中應(yīng)用了纖維素酶、果膠酶處理取得了一些進(jìn)展，陳瑞陽提出了植物染色體標(biāo)本制備的酶解去壁低滲方法。酶解去壁的作用：①生物解離處理替代理化解離處理，減少了染色體變形、畸變，呈現(xiàn)出真實(shí)的硬染色體。②去掉細(xì)胞壁纖維、果膠及胞質(zhì)對染色體數(shù)量影響，使染色體分散空間更大。③有利染色體著絲點(diǎn)隨體等圖象完整清晰。酶解去壁是染色體標(biāo)本制備的關(guān)鍵技術(shù)，因?yàn)樗苯佑绊懙絾渭?xì)胞的得率，酶解不足或過度都會導(dǎo)致染色體制片失敗，被處理材料的大小、數(shù)目，酶的質(zhì)量、濃度、pH值及處理溫度都會影響到酶的處理效果。⑵處理藥劑：纖維素酶，有國產(chǎn)及進(jìn)口兩類商品；進(jìn)口纖維素酶因純度高，而價(jià)格貴；國產(chǎn)纖維素酶實(shí)用、價(jià)格便利，商品多為綜色，1g裝。果膠酶，也有國產(chǎn)及進(jìn)口兩類商品；國產(chǎn)果膠酶淺灰色粉末，10g裝，均溶于水。常用濃度2.5%，100余個(gè)根尖約100mL2.5%纖維素酶及果膠酶液用量方可。⑶處理方法：將纖維素酶及果膠酶按5%的濃度充分溶解，再按1：1等量混合，配成2.5%濃度混合酶，鮮配鮮用。吸除前低滲液后，加入混合酶液；25℃下處理2－4h，因物種不同，處理的時(shí)間也不同，但均以被處理材料一觸即破為度。處理結(jié)束后，注意酶液回收，4℃下保存可以再次利用；回收酶液的活性單位及濃度會有所下降，再次利用時(shí)，處理的時(shí)間會有所延長；需要10多小時(shí)處理時(shí)，應(yīng)注意防止酶液干燥。5、后低滲⑴目的及作用：后低滲是染色體分散的關(guān)鍵步驟，其主要作用是：①使細(xì)胞吸水膨脹，讓染色體隨之分散到細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，有利于染色體分散。②新鮮雙蒸餾水進(jìn)入細(xì)胞，使細(xì)胞體積增大，細(xì)胞質(zhì)濃度降低，有利于染色體標(biāo)本清潔程度提高。③后低滲處理時(shí)，混合酶已將分裂細(xì)胞的細(xì)胞壁酶解，原生質(zhì)又充分吸水，所以細(xì)胞顯得比較嬌嫩，應(yīng)該向被處理材料中加入（）℃鮮雙蒸餾水為宜。⑵處理方法：混合酶液回收以后，用（）℃蒸餾水清洗2－3次。如果用吸管回收酶液或吸掉清洗液時(shí)，被處理材料也有被吸出危險(xiǎn)，應(yīng)該放慢操作速度或者適當(dāng)減少清洗次數(shù)。清洗完畢后，向被處理材料中緩慢加入新鮮雙蒸餾水，浸沒材料為度，（）℃下浸泡30min，讓細(xì)胞吸水膨脹。后低滲處理后，常有懸液法及涂片法兩種染色體標(biāo)本制備方法。涂片法是先固定再涂片，被廣泛使用，而懸液法是先制備細(xì)胞懸浮液再固定滴片。6、固定⑴目的及作用：固定的主要作用是①迅速殺死細(xì)胞，保留分裂圖象。②使染色體核蛋白變性、沉淀，呈現(xiàn)出染色體真實(shí)形態(tài)及結(jié)構(gòu)。③使細(xì)胞質(zhì)原生質(zhì)體蛋白變性、沉淀，有利于染色體背景清晰。⑵處理藥劑：①卡諾氏Ⅰ：冰乙酸：無水乙醇=1:3，比較適宜于動物染色體標(biāo)本制片；卡諾氏Ⅱ：冰乙酸:氯仿:無水乙醇=1:3:6，比較適宜于油脂類含量較多的生物。②冰乙酸：甲醇=1：3，通用于多數(shù)生物染色體標(biāo)本制片，近來普遍采用。⑶涂片制備法的材料固定方法：將低滲后的材料直接用固定液，固定30min以上。固定液宜鮮配鮮用，固定時(shí)間依物種不同而有些不同，固定30min-20h，材料粗大宜長，反之則反，4℃低溫下固定的效果更佳，一般為30min。7、涂片酶解效果好時(shí)，組織一觸即破，多用涂抹制片方法。將材料放在預(yù)先洗凈、用蒸餾水浸泡，并冷凍的清潔玻片上，滴一滴固定液，然后用鑷子取一根尖留取分生細(xì)胞區(qū)，迅速將材料敲碎涂抹，并去掉大塊組織殘?jiān)?。酶解效果不好時(shí)，可以用鑷子柄垂直敲打；滴45%醋酸1-2滴后，再次敲打，借助醋酸液表面張力把分裂細(xì)胞分開、把染色體引開，并除掉大塊組織殘?jiān)?。涂抹或敲碎涂抹制片的玻片均?yīng)自然干躁或火焰干躁?；鹧娓稍锸侵篙d有分裂細(xì)胞材料的載玻片在酒精燈火焰上微微加熱烤干的辦法，火焰干燥對分裂細(xì)胞有分色的作用。為了加強(qiáng)細(xì)胞分色，還可以在材料處滴加1滴甲醇冰乙酸固定液后，再火焰干躁，其細(xì)胞分色效果更好?；鹧娓稍陼r(shí)，玻片離火焰3cm左右，來回晃動，千萬不要離火焰太近，防止炸片導(dǎo)致細(xì)胞破碎。涂片干燥后進(jìn)入下一步染色。懸液法先制備細(xì)胞懸液：倒去后低滲處理的雙蒸餾水，用鑷子將材料挾碎、攪拌，形成細(xì)胞懸液，再固定、去沉淀及滴片：①固定：向細(xì)胞懸液中加入鮮配的甲醇冰乙酸固定液1-2mL，置20min，細(xì)胞懸液中出現(xiàn)大塊組織沉淀時(shí)，將上層細(xì)胞懸液，倒入另一個(gè)小瓶中，去掉沉淀物；去掉沉淀物的細(xì)胞懸液凈置30min，能見細(xì)胞沉淀時(shí)，用吸管輕輕地吸去上清液，留1mL左右細(xì)胞懸液為染色體標(biāo)本滴片備用。取一張預(yù)先洗凈、用蒸餾水浸泡，并冷凍的清潔載玻片，用吸管滴2-3滴細(xì)胞懸液滴在玻片上，立即將玻片一端抬起，并輕輕吹氣，使細(xì)胞迅速分散，然后在酒精燈火焰上微微加熱烤干或自然干燥。8、染色⑴目的及作用：染色的目的是盡量使染色體及細(xì)胞核染色，而細(xì)胞質(zhì)不染色或淡著色，以便于觀察。因染色體被染色，呈現(xiàn)出原有的形態(tài)結(jié)構(gòu)及數(shù)目，能進(jìn)行植物染色體核型分析；因生物染色體上富含A－T或G=C堿基數(shù)量及分布差異或其它原因，經(jīng)染色在染色體上可以產(chǎn)生著色深淺不同的染色體顯帶，為植物核型分析補(bǔ)充了一項(xiàng)很好的分類指標(biāo)，進(jìn)行染色體帶型分析。⑵常用藥劑用于植物染色體染色的方法很多，各種染色方法都有其自身的特點(diǎn)及其適用的材料，下面簡介國內(nèi)外常用的幾種染色劑。①洋紅（Carmine）：洋紅是從胭脂蟲(Coccuscacti的雌蟲中直接提取的一種染料，為非結(jié)晶的紫褐色物質(zhì)。但因所用的胭脂蟲的種類不同，洋紅的品質(zhì)也往往有些差異。在胭脂蟲的提取物中加入鋁或鈣而成為深紅色的洋紅，洋紅并不是真正的化合物，而是一種混合物。洋紅中具有染色活性的洋紅酸（Carminicacid），為一種二元酸，有一定比例能溶于水，在它的等電點(diǎn)時(shí)幾乎不溶于水。如果溶于等電點(diǎn)酸性的一邊，則成為一種類似堿性染料的性質(zhì)，可以使染色質(zhì)著色；如果溶于堿性溶液中，則具有酸性染料的性質(zhì)，可以使細(xì)胞質(zhì)著色。洋紅酸的染色能力不是很強(qiáng)，通常鐵-乙酸洋紅、乙酸-鹽酸洋紅、丙酸-鐵-洋紅。乙酸或丙酸洋紅的配制和染色都比較方便，對細(xì)胞壁的穿透能力較強(qiáng)，能使染色體核仁均可以著色，很適于植物小孢子母細(xì)胞及小孢子的染色，但它的染色強(qiáng)度和分散效果不及其他染料。所以不及其他染色劑應(yīng)用廣泛，通常只作臨時(shí)染色觀察之用。②地衣紅（Orcein）：地衣紅是從一種地衣紅（Lecanoraparella）及染料衣(Rocellatictoria中提煉出來的紫紅色染料。地衣紅與過氧化氫、氫氧化氨作用，可以獲得無色的母物地衣酸（Orceinicacid）,天然產(chǎn)物的地衣紅與人工合成的地衣酸對染色體有同樣的染色作用，但后者不如前者，地衣紅溶于水及酒精，其配制方法與乙酸洋紅相同，但無需加鐵媒染，也無需回流（藥劑配制見附錄）。先配成2%母液，再稀釋成1%后使用。地衣紅對染色體及細(xì)胞核著色能力明顯優(yōu)于洋紅，為目前國內(nèi)外應(yīng)用十分廣泛的一種染色體和細(xì)胞核的染色劑。③堿性品紅（Basicfuchsin）：為一種三苯甲烷類的堿性燃料，商品堿性品紅幾乎都是由副品紅（pararisaniline）或薔薇苯胺（rosaniline）組成。堿性品紅所含的所有成分均溶于水，更易溶于乙醇。堿性品紅用于染色體染色，有兩個(gè)重要的配方，即卡寶品紅（Carbolfuchsin,也稱苯酚品紅或石炭酸品紅）及錫夫（Schiff）試劑?？▽毱芳t，是目前國內(nèi)外應(yīng)用最為廣泛的一種優(yōu)良的核和染色體的染色劑，它既具有乙酸洋紅的染色簡便、快速的特點(diǎn)，又具有乎爾根（Feulgen）反應(yīng)分色清晰的優(yōu)點(diǎn)，且染色劑耐保存、穩(wěn)定性好、制片色澤持久，這些都是前兩種方法所不及的，該染色劑在我國的推廣應(yīng)用最為普遍。該染色劑配制后立即使用，染色較淡，放置2周后，染色能力會明顯加強(qiáng)，而且放置的時(shí)間越長，染色的效果會越好。在常溫下，此液可以存放兩年而不會變質(zhì)?？▽毱芳t對染色體的染色效果，與鹽酸的解離條件密切相關(guān)，解離的時(shí)間太短，細(xì)胞質(zhì)也會有不同程度的著色、分色效果不理想；在合適的解離條件下才有最佳的染色效果，染色體呈紅色，細(xì)胞質(zhì)無色或極淡紅色，著色之前，最好將材料中的殘余鹽酸沖洗干凈，否則卡寶品紅將不易著色。錫夫（Schiff）試劑是FeulgenR與RossonbeckH于1924年創(chuàng)造的一種DNA的細(xì)胞化學(xué)鑒定方法，也稱為乎爾根（Feulgen）染色方法。錫夫（Schiff）試劑的配制，該方法的優(yōu)點(diǎn)是只對細(xì)胞核和染色體著色，染色也比較均勻、背景清晰，但染色時(shí)間長，少數(shù)植物染色十分困難，因過度軟化，而染色體分散困難。④卡寶品紅（Carborfuchsin）:卡寶品紅是3%的堿性品紅與15%石碳酸或45%醋酸等試劑配制而成，具有染色快、著色深、適應(yīng)性廣的特點(diǎn)，是多數(shù)植物根尖、幼芽、花藥以及細(xì)胞愈傷組織染色的好染料。⑤姬母薩（Giemsa）：最初用于DNA原位分子雜交(parldue,1970。隨染色體分帶技術(shù)興起及發(fā)展，Giemsa染色愈加廣泛應(yīng)用。是一種含有不同氧化程度的噻嗪類復(fù)合染料，噻嗪類染料與磷酸基結(jié)合著色，有4個(gè)甲基亞甲蘭和3個(gè)甲基天青A，2個(gè)甲基天青B協(xié)助噻嗪染料使染色體著色。因?yàn)樗粌H僅使染色體著色，還可以把DNA復(fù)性過程中，DNA上“堿基種類(富A－T，還是富G－c，從著色帶紋上區(qū)分，稱染色體顯帶。Giemsa染色，因材料不同，著色速度差異很大，從幾分鐘到數(shù)小時(shí)不等。進(jìn)化階段低的植物種或固定時(shí)間長的材料易于著色，而進(jìn)化階段高的植物種或固定時(shí)間短的材料不易于著色。從染色體染色效果來看，上述四種染色劑中，染色效果最好的是Giemsa，其次是卡寶品紅，依次才是地衣紅、錫夫（Schiff）試劑、洋紅。⑶染色方法：因染色劑不同，染色方法也有些微小差異。但都有兩種染色方法，其一、制片后玻片材料染色，一般都要待被染色材料干燥后，取染色劑染色。如取Giemsa、卡寶品紅或地衣紅染色稀釋液，浸沒材料區(qū)、嚴(yán)防氣泡干擾，染色15min或者更長一點(diǎn)的時(shí)間，稀釋液的稀釋倍數(shù)見藥劑配制附錄。待染色時(shí)間足夠后，自來水沖洗玻片，注意水流量不能太大，沖洗時(shí)，材料面面對自來水緩慢沖洗；待多余染料沖洗完畢后，讓染色體玻片自然干躁或火焰干躁，加蓋蓋玻片后，用顯微鏡觀察。其二、材料整體染色，在染色體常規(guī)壓片方法中還比較流行用材料整體染色方法，各種染色劑的整體染色方法見附錄。Giemsa染色，一般按Giemsa母液：緩沖液=1：20稀釋（pH為時(shí)），浸沒材料區(qū)染色15min。地衣紅染色，一般按母液：鮮蒸餾水=1：1稀釋，浸沒材料區(qū)染色15min。上述1-8步都是用植物活體材料直接去壁低滲，再固定進(jìn)行染色體標(biāo)本制片的方法，稱為活體材料制片法。為了方便野外材料采集，又提出了預(yù)先固定材料的去壁低滲方法，即需要染色體制片的材料，可以分批采集，經(jīng)過預(yù)處理后就用甲醇冰乙酸固定，集中染色體制片的方法。如果采集的材料能在1周之內(nèi)進(jìn)行染色體制片，可以在甲醇冰乙酸固定液中保存，超過1周還不能進(jìn)行染色體制片時(shí)，應(yīng)把固定后的材料，用剃度酒精處理，保存在70%的酒精中，備用。預(yù)先固定材料的去壁低滲方法與活體材料直接去壁低滲方法，大同小異。大體步驟為：正確取材→預(yù)處理→甲醇冰乙酸固定→前低滲→酶解去壁→后低滲→涂片或懸液法滴片→染色，方法同前。預(yù)先固定材料的去壁低滲方法與活體材料直接去壁低滲方法的比較：活體材料直接去壁低滲法的最大優(yōu)勢是活體原生質(zhì)，半滲透性很好，吸水速度快，染色體因低滲作用而分散到細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，所以染色體分散程度高，容易獲得比較好的染色體圖象。但它的不足之處是不便于野外材料采集，每一批材料采集后，都要立即染色體制片，需要制片的材料很多時(shí)，時(shí)間緊張，工作也顯得比較累。預(yù)先固定材料的去壁低滲法的最大優(yōu)勢是方便野外材料采集，需要進(jìn)行染色體制片的材料可以分批采集，集中染色體制片。但因先固定再酶解，細(xì)胞質(zhì)失去半滲透性，染色體難以隨低滲作用分散到細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。所以，低滲吸水的時(shí)間需要很長的才會使細(xì)胞軟化膨脹，染色體分散的效果也沒有活體材料直接去壁低滲方法的好。9、實(shí)驗(yàn)觀察染色體標(biāo)本玻片干躁后，先用低倍鏡找分裂細(xì)胞區(qū)，在分裂細(xì)胞區(qū)內(nèi)尋找典型分裂相細(xì)胞。當(dāng)找到含有紅色條狀物質(zhì)的細(xì)胞輪郭圖象后，再用高倍鏡觀察染色體，把染色體數(shù)目齊全、分散度高、重疊很少的圖象，記錄其染色體數(shù)目、坐標(biāo)及圖象，作實(shí)驗(yàn)報(bào)告，盡可能地觀察到染色體的長臂、短臂、著絲點(diǎn)位置及某些染色體次縊痕、隨體；圖象十分清晰的玻片，在材料面右邊帖上標(biāo)簽，說明材料名稱，制片時(shí)間，工作者姓名。據(jù)實(shí)況加分，并交玻片。10、封片染色體標(biāo)本玻片制好后如果來不及觀察或照相時(shí)，需要暫時(shí)封存。暫時(shí)封存先在蓋玻片四周各放麥粒大石蠟一塊，再用燒熱的解剖針迅速溶化石蠟，使蓋玻片四周嚴(yán)密封閉。封好的玻片可放在冰箱內(nèi)保存7-10天。如果玻片染色不太理想，可以水解或用固定液退色后，改用卡寶品紅染色5-10min。發(fā)現(xiàn)有圖象清晰、完整、高度分散的染色體典型圖象制片后，應(yīng)制成永久玻片，將玻片在二甲苯中脫水1小時(shí)，涼干后，在典型分裂圖形處滴上1滴中性樹脂或達(dá)馬膠，蓋上蓋玻片封片，制成永久玻片。（二）顯微攝影技術(shù)見實(shí)驗(yàn)2。（三）植物染色體組型分析技術(shù)由于國際上還沒有一個(gè)植物染色體核型分析的共同標(biāo)準(zhǔn)，國內(nèi)有關(guān)染色體的統(tǒng)計(jì)、測量、命名、圖表格式等項(xiàng)工作，各人所采用的方法和標(biāo)準(zhǔn)也不盡相同，在染色體研究工作中，就有一個(gè)急需解決的問題，即核型分析的標(biāo)準(zhǔn)化問題。1984年8月，在遼寧興城召開全國第一次全國植物染色體學(xué)術(shù)討論會上，李懋學(xué)、陳瑞陽聯(lián)名（1984）作了“關(guān)于植物核型分析的標(biāo)準(zhǔn)化問題”報(bào)告，經(jīng)過與會代表的充分討論，根據(jù)大多數(shù)代表的意見形成大家約定的標(biāo)準(zhǔn)，被同行所承認(rèn)。1、核型分析的約定標(biāo)準(zhǔn)⑴染色體的數(shù)目由于減數(shù)分裂價(jià)體難以保證準(zhǔn)確，所以，僅除苔蘚和蕨類因材料所限而用減數(shù)分裂細(xì)胞記數(shù)外，一般以體細(xì)胞染色體數(shù)目為準(zhǔn)。統(tǒng)計(jì)的細(xì)胞數(shù)目應(yīng)在30個(gè)以上。其中85%以上的細(xì)胞具有恒定一致的染色體數(shù)目，即可認(rèn)為是該植物種染色體數(shù)目。如果觀察材料是混倍體，則應(yīng)如實(shí)記錄其染色體數(shù)目變異范圍及各類細(xì)胞的數(shù)目及百分比。⑵染色體的形態(tài)作為核型分析的染色體，一般以體細(xì)胞分裂中期的染色體作為基本形態(tài)，如果減數(shù)分裂粗線期的染色體分散良好，著絲粒清晰者，也可以用作核型分析。核型分析的細(xì)胞數(shù)目以5個(gè)以上的細(xì)胞為準(zhǔn)，不僅要求有一定的數(shù)量，更要求有高質(zhì)量的染色體圖象，才會保證核型分析準(zhǔn)確。①染色體長度染色體絕對長度（或?qū)嶋H長度）：均以微米(μm表示,一般宜在放大照片或圖象上進(jìn)行測量,換算成μm長度。染色體絕對長度=放大染色體長度(mm/放大倍數(shù)×1000。絕對長度值只在有些情況下才有相對的比較價(jià)值；在許多情況下，它不是一個(gè)可靠的比較數(shù)值，因?yàn)轭A(yù)處理?xiàng)l件和染色體縮短的程度不同，即使是同一個(gè)物種，不同的實(shí)驗(yàn)者測得的絕對長度往往有明顯的差異。所以，絕對長度的穩(wěn)定性不是很理想，僅作為相對長度計(jì)算的基礎(chǔ)，一般都不列入核型分析表中。染色體相對長度：均以百分率表示，計(jì)算相對長度值的方法，在過去的文獻(xiàn)中也有多種公式，現(xiàn)以levan(1964的公式計(jì)算為準(zhǔn)。染色體相對長度(%=染色體絕對長度(μm/染色體組總長度(μm×100；每對同源染色體長臂的相對長度(%=染色體長臂的絕對長度(μm/染色體長臂的總長度(μm×100。相對長度是穩(wěn)定的可以比較的數(shù)值，近年來，國內(nèi)外多數(shù)核型研究的文獻(xiàn)中，往往只用相對長度值，將相對長度值列入核型分析表中，這種簡化是可取的。染色體相對長度系數(shù)（I、R、L）：這是郭辛榮等人（1972）提出的對染色體長度分類的方法，即染色體相對長度系數(shù)（I、R、L）=染色體長度/全組染色體平均長度。I、R、L<0、76時(shí)為短染色體（S）；76≤I、R、L≤100時(shí)為中短染色體（M1）；0.1≤I、R、L≤125時(shí)為中長染色體（M2）；I、R、L≥126時(shí)為長染色體（L）。染色體長度比：是指核型中最長染色體與最短染色體的比值，即染色體長度比=最長染色體/最短染色體。在Stebbins(1971的核型分類系統(tǒng)中，它是衡量核型對稱或不對稱的兩個(gè)主要指標(biāo)之一。②臂比臂比的計(jì)算公式為：臂比=染色體長臂／短臂，臂比列入核型分析表中。③著絲粒位置據(jù)染色體臂比，參照levan(1964的染色體命名規(guī)則，經(jīng)過討論，略加修改，即取小數(shù)點(diǎn)后兩位數(shù)值，以嚴(yán)格區(qū)分，并列入核型分析表中。著絲點(diǎn)在染色體上的位置是固定的，由于著絲位置不同，可以把染色體分成幾種形態(tài)種類（見表9-1）。表9-1據(jù)臂比進(jìn)行染色體命名標(biāo)準(zhǔn)臂比值著絲點(diǎn)位置染色體命名簡記符號1.00正中部著絲點(diǎn)正中著絲點(diǎn)染色體(medianpointM1.01-1.70中部著絲區(qū)中部著絲粒染色體(medianpointm1.71-3.00近中部著絲區(qū)近中著絲粒染色體(submedianpointsm3.01-7.00近端部著絲區(qū)近端著絲粒染色體(subterminalpontst7.01以上端部著絲區(qū)端部著絲粒染色體(terminalpontt∞+端部著絲點(diǎn)端部著絲點(diǎn)染色體(terminalpontT此命名規(guī)則的特點(diǎn)是將染色體的一半長度分為兩粒四區(qū)，這四區(qū)是等分的。Levan等人在分析了其他各種著絲粒命名法之后指出，這種命名發(fā)是比較合理的?，F(xiàn)已被全世界廣泛采用。其他常用的命名：為了便于閱讀文獻(xiàn)時(shí)參考，下面把其他常用的著絲粒命名法，如著絲粒指數(shù)和短臂差值Levan等（1964）的命名規(guī)則對照列于表9-2。臂比=長臂/短臂，即r=L/S，差值=長臂-短臂,d=L-S，染色體全長為10；著絲粒指數(shù)=短臂/染色體全長×100i=100S/C;三者的換算公式分別為d=10(r-L/(r+L;r=(10+d/(10-d;I=100/(r+L×5(10-d.表9-2著絲粒指數(shù)和長短臂差值命名參數(shù)表著絲粒位置臂比值（r）差值（d）著絲粒指數(shù)（i）2.083.532.5sm2.334.030.0st4.716.517.5（numberfundamental）:臂指數(shù)(N.F=(中部著絲粒染色體+近中部著絲粒染色體數(shù)目×2+（端部著絲粒染色體+近端部著絲粒染色體數(shù)目）×1，即把中部和近中部著絲粒染色體計(jì)算為2，把端部和近端部著絲粒染色體計(jì)算為1，兩者的總和為總臂數(shù)。⑶核型的表述格式包括核型計(jì)算的基本數(shù)據(jù)、染色體序號、模式照片、核型圖、核型模式圖、核型公式及核型分類7個(gè)內(nèi)容。①核型測定數(shù)據(jù)表：核型分析中各項(xiàng)測定的平均數(shù)值，應(yīng)列表報(bào)道，列表內(nèi)容要簡明實(shí)用，其格式和項(xiàng)目見表9-3表9-3染色體相對長度、臂比和類型序號相對長度臂比類型（短臂+長臂=全長）（長臂/短臂）19.93410.09920.0331.017m26.9548.27815.2321.188m…n表中染色體序號一律用啊拉伯字母，相對長度和臂比均取小數(shù)點(diǎn)后兩位數(shù)，第三位數(shù)四舍五入。染色體絕對長度變異范圍、染色體長度比、核型類別等內(nèi)容在表下單列說明。隨體的長度一般不計(jì)算在染色體全長內(nèi)，列表時(shí)，在具有隨體或次縊痕的染色體應(yīng)在表中該染色體序號上標(biāo)上“*”號。②染色體序號：一律按染色體全長，由長到短按序編號。如果兩對染色體長度完全相等，則按短臂長度順序排序。性染色體及B染色體一律排在最后。二型核型（bimodalkarytype）,如中國水仙、蘆薈等植物，則長染色體群按L1、2…順序排列，短染色體群按S1、2…順序排列。異源多倍體，根據(jù)其親本的染色體組分別排列。如普通小麥按A、B、C三組分別編號排列，而不是全部21對染色體統(tǒng)一順序排列。如果核型中有差異明顯而恒定的雜合染色體對時(shí)，則應(yīng)分別測量每一成員的長度值和臂比值，分別列于表中，編號可在任選其中一成員為準(zhǔn)，并附加說明。③模式照片：一般每種材料應(yīng)附一張有代表性的中期染色體的完整照片，并標(biāo)明一個(gè)以微米為長度單位的標(biāo)尺，便于目測染色體大小，盡量少用放大倍數(shù)。④核型圖（karyogram）：將于模式照片同一細(xì)胞的染色體剪下或復(fù)制粘貼，參考染色體長度和臂比值，進(jìn)行同源染色體配對，然后按表格中的染色體序號順序排列。即為該細(xì)胞的核型圖。⑤核型模式圖(idiogram：用表中所列各染色體的相對長度均值繪圖，橫坐標(biāo)為染色體序號，縱坐標(biāo)為染色體相對長度（%）見圖9-5圖9-5染色體核型模式圖⑥核型公式：綜合核型分析的結(jié)果，將核型的主要特征以公式形式表示。它簡明扼要、便于記憶和比較。如牛角椒2n=24=20m+2sm(SAT+2st(SAT.⑦核型分類。據(jù)Stebbins(1971參照生物界現(xiàn)有核型分析資料，根據(jù)核型中染色體長度和臂比兩項(xiàng)主要特征，區(qū)分核對稱和不對稱性程度，將其分成12種類型（表9-4）。表9-412種核型類型分類表最長染色體臂比大于2：1的染色體比值最短染色體0.00.0-0.500.51-0.991.0<2：11A2A3A4A2：1—4：11B2B3B4B>4：11C2C3C4C該分類法在分析和討論核型進(jìn)化的一個(gè)方面是有參考價(jià)值的，可以作為核型表述的一項(xiàng)內(nèi)容。⑷關(guān)于具有小染色體的植物核型分析所謂小染色體，是指其長度在2微米以下而又不容易分辨著絲粒的染色體。植物界中，具有此類染色體的種類很多，有的整個(gè)屬或整個(gè)科均有。以往，這類植物所提供的惟一細(xì)胞學(xué)信息就是染色體數(shù)目。為了核型研究的范圍，對這類植物提供比單一的數(shù)目更多一些有用的核型信息，初步擬定如下幾個(gè)方面進(jìn)行核型的分析比較。①染色體數(shù)目；②具有隨體染色體的數(shù)目；③每對染色體的相對長度值；④染色體長度比；⑤如果含有大小差別明顯的染色體，可以分大、小群分別統(tǒng)計(jì)其數(shù)量和長度，以及各自所占染色體組全長的百分比。2、染色體組型分析步驟①染色體數(shù)目確定；②顯微照相：檢查攝影裝置，讓光路選擇拉桿向外拉出一級；普通相機(jī)調(diào)準(zhǔn)ASA膠片感光盤，并裝入膠卷或數(shù)碼相機(jī)先調(diào)到Bab照相模式；接通電源；選擇自動暴光方式；畫幅選擇；屈光度調(diào)節(jié)；取景聚焦；選擇濾光鏡；將選取的5-10個(gè)染色體分散良好的中期細(xì)胞分別顯微照相，沒一個(gè)分裂細(xì)胞照1-3張，并同時(shí)將鏡臺測微尺在同樣倍數(shù)下拍照。③沖洗放大或放大打?。浩胀ㄏ鄼C(jī)為了增加反差，可以用D-19沖卷，按顯微攝影技術(shù)顯影、定影、沖洗、考片。放大前，應(yīng)該先用鏡臺測微尺底片校正放大倍數(shù)。例如：鏡臺測微尺每一小格為1×10-2mm欲放大2000倍，1×10-2mm×2000=20mm，測微尺每一小格20mm，即為2000倍，或者將20mm長線表為10μm，如此類推計(jì)算出照片的準(zhǔn)確擴(kuò)大倍數(shù)。數(shù)碼相機(jī)，將照片輸入計(jì)算機(jī)，選定需要打印的照片，每張相紙打印4-6張照片。④剪貼或粘貼：用眼科剪刀，爰沿染色體邊緣將每一條染色體剪下放在小培養(yǎng)皿內(nèi)，數(shù)碼照片采用復(fù)制粘貼方式，粘貼在同一條線上。⑤染色體配對：首先目測配對，根據(jù)染色體的長短和形態(tài)特征，進(jìn)行同源染色體配對。有條件的情況下，可以采用染色體組型自動分析系統(tǒng)完成染色體配對及測量工作。⑥染色體序排：按染色體序號排列方法將一個(gè)細(xì)胞內(nèi)所有染色體進(jìn)行排隊(duì)，編號。染色體配對后核型圖翻拍。⑦染色體測量：按染色體核型分析方法，完成染色體數(shù)目、絕對長度、相對長度、臂比、染色體長度比、臂指數(shù)等各項(xiàng)測定工作。⑧列染色體相對長度、臂比及類型分析表⑨繪制核型模式圖。⑩描述核型公式，進(jìn)行核型分類。（五）新資源植物染色體核型及帶型分析1、新資源植物染色體制片過程中經(jīng)常碰到的3個(gè)難題①中期分裂細(xì)胞頻率低：新資源植物染色體，由于沒有前人進(jìn)行研究，沒有現(xiàn)成的染色體制片工藝可以借鑒，尤其是新手，第一次進(jìn)行新資源植物染色體制片，往往典型分裂細(xì)胞頻率低，甚至看不到中期分裂的染色體的圖象，主要原因是沒有找到良好的預(yù)處理技術(shù)，一般可以在預(yù)處理試劑種類、預(yù)處理時(shí)間、溫度3個(gè)方面進(jìn)行試驗(yàn)，獲得該新資源植物良好的預(yù)處理技術(shù)。⑵染色體或分裂細(xì)胞之間分散度不夠：染色體之間分散度不夠，主要從前、后低滲上進(jìn)行試驗(yàn)低滲時(shí)間不夠，會影響到原生質(zhì)吸水膨脹，會影響到染色體分散到細(xì)胞質(zhì)去，還會影響到細(xì)胞背景不清晰。分裂細(xì)胞之間分散度不夠主要是酶解效果不理想，酶解不夠或過頭都會影響到分裂細(xì)胞之間分散度；同時(shí)制片過程中敲片利用45%乙酸液表面張力或吹氣分散細(xì)胞技巧上也有一些差異。可以從酶處理溫度、時(shí)間及制片技巧上多次試驗(yàn)，獲得高度分散的染色體或典型分裂細(xì)胞。⑶染色體著色不夠。尤以Giemsa染色，因制片材料不同，著色速度差異很大。幾分鐘到幾小時(shí)不等。尤其是進(jìn)化階段高的物種或固定時(shí)間短的材料，其著色速度一般都比較慢。使染色體著色不明顯，或染色體與細(xì)胞質(zhì)之間的反差太小，顯微照象效果差。可以從從固定時(shí)間、著色處理方法及著色時(shí)間上進(jìn)行多次試驗(yàn)，尋找該新資源植物比較適宜的固定及染色技術(shù)。為了獲得某新資源植物種染色體制片的最佳工藝，可以根據(jù)新資源植物染色體制片最大難度點(diǎn)，擬分3-6因素，進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)。如小染色體、多染色體植物，進(jìn)化階段高的植物，可以在預(yù)處理、低滲及酶解各個(gè)環(huán)節(jié)，從處理溫度、時(shí)間上各設(shè)置2-3個(gè)水平進(jìn)行正交試驗(yàn)，探討新資源植物染色體制片工藝，獲得最佳染色體圖象。第一步：擬定試驗(yàn)因素及水平。以小染色體、進(jìn)化階段較高的新資源植物種為例說明。在暫時(shí)不考慮處理溫度的情況下，可以設(shè)置如下因素。預(yù)處理時(shí)間(A：20℃下用濃度8-羥基喹啉，在預(yù)處理時(shí)間上設(shè)置不同水平。低滲時(shí)間(B：25℃下，用-1氯化鉀或，（）℃下，用新鮮雙蒸餾水，在前、后低滲處理時(shí)間15-60min上設(shè)置不同水平。固定處理時(shí)間(C：20℃下，低滲后的材料固定，在固定30-