化學發光免疫分析化學發光免疫分析1

化學發光免疫技術：集靈敏的化學發光分析和特異的抗原抗體免疫測定于一體的檢測技術。概念

特點：特異性高、敏感性高、分離簡便、快速、試劑無毒、安全穩定、可自動化。2化學發光免疫技術：集靈敏的化學概念特點：2化學發光免疫技術的類型

按發光劑不同分為

1.發光酶免疫測定（CLEIA）

chemiluminescenceenzymeimmunoasssay

2.化學發光免疫測定技術(CLIA)chemiluminescenceimmunoassay

3.電化學發光免疫測定技術(ECLI)electrochemiluminescenceimmunoassay

按分離方法不同分

1.微粒子化學發光免疫測定

2.磁顆粒化學發光免疫測定3化學發光免疫技術的類型按發光劑不同分為3第一節發光與化學發光劑一、發光一種物質由電子激發態回復到基態時，釋放出的能量表現為光的發射。1.光照發光:發光劑經短波長入射光照射后進入激發態，當回復至基態時發出較長波長的可見光。2.生物發光:反應底物在熒光素酶的催化下利用

ATP產能，生成激發態的氧化熒光素，后者在回復到基態時多余的能量以光子形式放出。3.化學發光:在常溫下由化學反應產生的光的發射。化學發光是一個多步驟的過程。4第一節發光與化學發光劑一、發光一種物質由電子激發態回

熒光素酶ATP；O2；Mg2+氧化螢火蟲熒光素螢火蟲熒光素生物發光返回光+AMP+O2+CO2+5熒光素酶氧化螢火蟲熒光素螢火蟲熒光素生物發光返回光化學發光

機制：某些化合物可以利用化學反應產生的能量使其產物分子或反應中間態分子上升至電子激發態。當此產物分子或中間態分子衰退至基態時，以發射光子的形式釋放能量（即發光）。

化學發光劑或發光底物：在化學發光反應中參與能量轉移并最終以發射光子的形式釋放能量的化合物。發光劑分為熒光素、生物發光劑、化學發光劑6化學發光機制：某些化合物可以利用化學反應產生的能化學發①能參與化學發光反應；

②與抗原或抗體偶聯后形成穩定的結合物試劑；

③偶聯后仍保留高的量子效應和反應動力；

④應不改變或極少改變被標記物的理化特性，特別是免疫活性。化學發光劑應符合以下幾個條件返回7①能參與化學發光反應；化學發光劑應符合以下幾個條件返回71.酶促反應的發光底物

是指經酶的降解作用而發出光的一類發光底物。

CLEIA中常用的酶有HRP和APHRP的發光底物有魯米諾、對-羥基苯乙酸

AP的發光底物有AMPPD、4-MUP（熒光底物）特點：可作標記物、也可作過氧化物酶的底物1.1魯米諾H2O2/OH—HRP+N2+H2O

+光81.酶促反應的發光底物是指經酶的降解作用而發出光的一類發光大家學習辛苦了，還是要堅持繼續保持安靜9大家學習辛苦了，還是要堅持繼續保持安靜9對-羥基苯乙酸（HPA）HPA在H2O2存在下被HRP氧化成氧化二聚體（熒光物質），在350nm激發光作用下，發出450nm波長的熒光，可用熒光光度計測量。1.2HPAH2O2HRP+熒光氧化二聚體10對-羥基苯乙酸（HPA）HPA在H2O2存在下被HRP氧化AMPPDAMPPD在堿性條件下，被AP酶解生成相當穩定的

AMP-D陰離子，其有2～30min的分解半衰期，發出波長為470nm的持續性光，在15min時其強度達到高峰，15～60min內光強度保持相對穩定。光AP

/OH—HPO42—1.3AMPPD11AMPPDAMPPD在堿性條件下，被AP酶解生成相當穩定的4-MUP4-MUP被AP催化生成4-甲基傘形酮，在360nm的激發光的作用下，發出448nm的熒光，可用熒光光度計進行測量。熒光AP1.44-MUP4-MU360nm激發光H3PO4+124-MUP4-MUP被AP催化生成4-甲基傘形酮，在3602.直接化學發光劑特點：不需催化劑，只需改變溶液的pH等條件就能發光的物質。反應迅速、背景低、信比高，發光量與AE濃度呈線性關系。常用試劑：吖啶酯（acridinium，AE）+CO2+光132.直接化學發光劑特點：不需催化劑，只需改變溶液的pH等條件3.電化學發光劑

是指通過在電極表面進行電化學反應而發出光的物質。特點：①反應在電極進行；

②電子供體為：三丙胺（TPA）

③化學發光劑：三聯毗啶釕返回三聯毗啶釕分子結構圖143.電化學發光劑是指通過在電極表面進行電化學反應而發出返回第二節發光酶免疫測定（CLEIA）一、原理屬于酶免疫測定的一種。只是最后一步酶反應所用底物為發光劑，通過發光反應發出的光在特定的儀器上進行測定。二、技術類型

根據酶促反應底物不同可分為：

1.熒光酶免疫測定技術

2.化學發光酶免疫測定技術

根據免疫學反應模式分

1.雙抗體夾心法和雙抗原夾心法

3.固相抗原競爭法：15第二節發光酶免疫測定（CLEIA）一、原理屬于酶免疫熒光酶免疫測定技術反應原理圖

洗滌棄上清

是利用理想的酶熒光底物，生成的產物穩定并有強的熒光強度，通過測定熒光強度進行定量。16熒光酶免疫測定技術反應原理圖洗滌是利用理想的酶熒光底物，化學發光酶免疫測定技術反應原理圖

洗滌棄上清

是利用酶對發光底物催化作用而直接發光，通過光強度的測定而直接進行定量。17化學發光酶免疫測定技術反應原理圖洗滌是利用酶對發光底電化學發光原理圖

這一過程可在電極表面周而復始地進行產生許多光子，使光信號增強

返回激發態不穩定基態電極18電化學發光原理圖這一過程可在電極表面周而復始地進行返回激發1.抗原抗體結合反應將已包被了抗體的乳膠微粒和待測標本加入反應杯中，經溫育一定時間后,再加入AP標記抗體，溫育,形成固相包被抗體-抗原-酶標抗體復合物技術要點2.分離技術將復合物轉移到玻璃纖維上，用緩沖液洗滌，沒結合的抗原被洗脫，酶標抗體-抗原-膠乳微粒抗體復合物則被保留在纖維膜上。3.酶促發光反應

加入4-MUP，酶標抗體上AP將

4-MUP分解，形成4-MU，它在360nm激發光的照射下，發出448nm的熒光，經熒光儀記錄，放大，根據標準曲線由電腦計算出所測物質的含量191.抗原抗體結合反應將已包被了抗體的乳膠微技術要點2.1.磁顆粒分離法：用抗原或抗體包被磁顆粒,與標本中相應抗原或抗體和酶標的抗體或抗原通過一定模式的免疫學反應后,最終通過磁場將結合酶標記物IC和游離酶標記物進行分離的技術。分離技術2.微粒子捕獲法：所用顆粒是無磁性微粒子作為抗體或抗原的包被載體,然后用纖維膜柱子進行酶標記物的結合狀態和游離狀態的分離。3.包被珠分離法：用聚苯乙稀等材料制成小珠,在小珠上包被抗原或抗體,經抗原抗體反應后,將結合狀態和游離狀態的酶標記物進行分離.201.磁顆粒分離法：用抗原或抗體包被磁顆粒,與標分離技術2.微第三節化學發光免疫測定技術（CLIA）一、原理用化學發光劑直接標記抗原或抗體,與待測標本中相應Ab或Ag、磁顆粒性的Ag或Ab反應，通過磁場把結合狀態（沉淀部分）和游離狀態的化學發光劑標記物分離開來，然后加入發光促進劑進行發光反應，通過對發光強度的檢測進行定量或定性檢測。二、技術類型

1.分離方法常用磁顆粒分離技術

2.免疫學反應模式同酶發光免疫測定技術

3.不同只是相應標記物是吖啶酯而不是酶21第三節化學發光免疫測定技術（CLIA）一、原理用化學1.抗原抗體結合反應將包被McAb的磁顆粒和待測標本加入到反應管中，標本中待測Ag與磁珠上Ab結合，再加上AE標記Ab，經過溫育，形成磁珠Ab-Ag-AE標記Ab復合物。技術要點2.分離技術在電磁場中進行2-3次洗滌后，很快地將未結合的多余Ag和標記Ab洗去。3.化學發光反應經洗滌的磁珠中，加入H2O2和

pH糾正液NaOH，這時AE不需要催化劑即分解并發光，由集光器接收，經光電倍增管放大，記錄1S內所產生的光子能，其積分與被測物含量成正比，按標準曲線，儀器可計算出被測物含量。221.抗原抗體結合反應將包被McAb的磁顆粒和待技術要點1.AE其低背景噪音、化學反應簡單、快速而無催化劑。方法評價2.AE與大分子的結合并無減少所產生的光量，從而增加靈敏度，靈敏度可達10-15g/ml。3.AE標記試劑有效期長，可達一年。4.固相分離劑為極為幼細的磁粉，除增大包被面積，加快反應外，亦同時使清洗及分離更簡易、快捷。231.AE其低背景噪音、化學反應簡單、快速而無催方法評價2化學發光免疫分析化學發光免疫分析24

化學發光免疫技術：集靈敏的化學發光分析和特異的抗原抗體免疫測定于一體的檢測技術。概念

特點：特異性高、敏感性高、分離簡便、快速、試劑無毒、安全穩定、可自動化。25化學發光免疫技術：集靈敏的化學概念特點：2化學發光免疫技術的類型

按發光劑不同分為

1.發光酶免疫測定（CLEIA）

chemiluminescenceenzymeimmunoasssay

2.化學發光免疫測定技術(CLIA)chemiluminescenceimmunoassay

3.電化學發光免疫測定技術(ECLI)electrochemiluminescenceimmunoassay

按分離方法不同分

1.微粒子化學發光免疫測定

2.磁顆粒化學發光免疫測定26化學發光免疫技術的類型按發光劑不同分為3第一節發光與化學發光劑一、發光一種物質由電子激發態回復到基態時，釋放出的能量表現為光的發射。1.光照發光:發光劑經短波長入射光照射后進入激發態，當回復至基態時發出較長波長的可見光。2.生物發光:反應底物在熒光素酶的催化下利用

ATP產能，生成激發態的氧化熒光素，后者在回復到基態時多余的能量以光子形式放出。3.化學發光:在常溫下由化學反應產生的光的發射。化學發光是一個多步驟的過程。27第一節發光與化學發光劑一、發光一種物質由電子激發態回

熒光素酶ATP；O2；Mg2+氧化螢火蟲熒光素螢火蟲熒光素生物發光返回光+AMP+O2+CO2+28熒光素酶氧化螢火蟲熒光素螢火蟲熒光素生物發光返回光化學發光

機制：某些化合物可以利用化學反應產生的能量使其產物分子或反應中間態分子上升至電子激發態。當此產物分子或中間態分子衰退至基態時，以發射光子的形式釋放能量（即發光）。

化學發光劑或發光底物：在化學發光反應中參與能量轉移并最終以發射光子的形式釋放能量的化合物。發光劑分為熒光素、生物發光劑、化學發光劑29化學發光機制：某些化合物可以利用化學反應產生的能化學發①能參與化學發光反應；

②與抗原或抗體偶聯后形成穩定的結合物試劑；

③偶聯后仍保留高的量子效應和反應動力；

④應不改變或極少改變被標記物的理化特性，特別是免疫活性。化學發光劑應符合以下幾個條件返回30①能參與化學發光反應；化學發光劑應符合以下幾個條件返回71.酶促反應的發光底物

是指經酶的降解作用而發出光的一類發光底物。

CLEIA中常用的酶有HRP和APHRP的發光底物有魯米諾、對-羥基苯乙酸

AP的發光底物有AMPPD、4-MUP（熒光底物）特點：可作標記物、也可作過氧化物酶的底物1.1魯米諾H2O2/OH—HRP+N2+H2O

+光311.酶促反應的發光底物是指經酶的降解作用而發出光的一類發光大家學習辛苦了，還是要堅持繼續保持安靜32大家學習辛苦了，還是要堅持繼續保持安靜9對-羥基苯乙酸（HPA）HPA在H2O2存在下被HRP氧化成氧化二聚體（熒光物質），在350nm激發光作用下，發出450nm波長的熒光，可用熒光光度計測量。1.2HPAH2O2HRP+熒光氧化二聚體33對-羥基苯乙酸（HPA）HPA在H2O2存在下被HRP氧化AMPPDAMPPD在堿性條件下，被AP酶解生成相當穩定的

AMP-D陰離子，其有2～30min的分解半衰期，發出波長為470nm的持續性光，在15min時其強度達到高峰，15～60min內光強度保持相對穩定。光AP

/OH—HPO42—1.3AMPPD34AMPPDAMPPD在堿性條件下，被AP酶解生成相當穩定的4-MUP4-MUP被AP催化生成4-甲基傘形酮，在360nm的激發光的作用下，發出448nm的熒光，可用熒光光度計進行測量。熒光AP1.44-MUP4-MU360nm激發光H3PO4+354-MUP4-MUP被AP催化生成4-甲基傘形酮，在3602.直接化學發光劑特點：不需催化劑，只需改變溶液的pH等條件就能發光的物質。反應迅速、背景低、信比高，發光量與AE濃度呈線性關系。常用試劑：吖啶酯（acridinium，AE）+CO2+光362.直接化學發光劑特點：不需催化劑，只需改變溶液的pH等條件3.電化學發光劑

是指通過在電極表面進行電化學反應而發出光的物質。特點：①反應在電極進行；

②電子供體為：三丙胺（TPA）

③化學發光劑：三聯毗啶釕返回三聯毗啶釕分子結構圖373.電化學發光劑是指通過在電極表面進行電化學反應而發出返回第二節發光酶免疫測定（CLEIA）一、原理屬于酶免疫測定的一種。只是最后一步酶反應所用底物為發光劑，通過發光反應發出的光在特定的儀器上進行測定。二、技術類型

根據酶促反應底物不同可分為：

1.熒光酶免疫測定技術

2.化學發光酶免疫測定技術

根據免疫學反應模式分

1.雙抗體夾心法和雙抗原夾心法

3.固相抗原競爭法：38第二節發光酶免疫測定（CLEIA）一、原理屬于酶免疫熒光酶免疫測定技術反應原理圖

洗滌棄上清

是利用理想的酶熒光底物，生成的產物穩定并有強的熒光強度，通過測定熒光強度進行定量。39熒光酶免疫測定技術反應原理圖洗滌是利用理想的酶熒光底物，化學發光酶免疫測定技術反應原理圖

洗滌棄上清

是利用酶對發光底物催化作用而直接發光，通過光強度的測定而直接進行定量。40化學發光酶免疫測定技術反應原理圖洗滌是利用酶對發光底電化學發光原理圖

這一過程可在電極表面周而復始地進行產生許多光子，使光信號增強

返回激發態不穩定基態電極41電化學發光原理圖這一過程可在電極表面周而復始地進行返回激發1.抗原抗體結合反應將已包被了抗體的乳膠微粒和待測標本加入反應杯中，經溫育一定時間后,再加入AP標記抗體，溫育,形成固相包被抗體-抗原-酶標抗體復合物技術要點2.分離技術將復合物轉移到玻璃纖維上，用緩沖液洗滌，沒結合的抗原被洗脫，酶標抗體-抗原-膠乳微粒抗體復合物則被保留在纖維膜上。3.酶促發光反應

加入4-MUP，酶標抗體上AP將

4-MUP分解，形成4-MU，它在360nm激發光的照射下，發出448nm的熒光，經熒光儀記錄，放大，根據標準曲線由電腦計算出所測物質的含量421.抗原抗體結合反應將已包被了抗體的乳膠微技術要點2.1.磁顆粒分離法：用抗原或抗體包被磁顆粒,與標本中相應抗原或抗體和酶標的抗體或抗原通過一定模式的免疫學反應后,最終通過磁場將結合酶標記物IC和游離酶標記物進行分離的技術。分離技術2.微粒子捕獲法：所用顆粒是無磁性微粒子作為抗體或抗原的包被載體,然后用纖維膜柱子進行酶標記物的結合狀態和游離狀態的分離。3.包被珠分離法：用聚苯乙稀等材料制成小珠,在小珠上包被抗原或抗體,經抗原抗體反應后,將結合狀態和游離狀態的酶標記物進行分離.431.磁顆粒