KRAS和EGFR檢測與臨床應用匯報內容KRAS和EGFR的簡介及臨床意義ARMS-PCR的基本原理和技術特點等位特異性引物設計KRAS試劑盒開發簡介KRAS和EGFR的簡介及臨床意義KRAS基因突變影響結直腸癌藥物療效KRAS基因野生型的轉移性結直腸癌患者能從EGF抗體（西妥昔單抗、帕尼單抗）治療中獲益，而基因突變的患者治療效果很差；KRAS突變型患者對西妥昔單抗無應答，其總體生存期明顯低于KRAS野生型患者KarapetisCS,2008,NEngJMed結直腸癌患者檢測KRAS突變相關指南歐洲藥品評估局（EMEA，2008）指出：KRAS野生型的進展期結直腸癌患者可能從帕尼單抗中受益，而突變型患者受益較少。美國臨床腫瘤學會（ASCO，2009）推薦：轉移性結直腸癌患者應檢測KRAS突變，如有KRAS12、13位突變，則不應進行EGFR單克隆抗體治療；美國FDA指南推薦：在使用靶向藥物西妥昔單抗和帕尼單抗治療轉移性結腸直腸癌前必須檢測KRAS基因的基因型；2012年7月6日批準第一個用于結直腸癌的基因檢測（Qiagen），以判斷西妥昔單抗是否有效；美國國立綜合癌癥網絡（NCCN，2014）指南說：轉移性結直腸癌患者均應進行RAS突變檢測（KRAS和NRAS），至少應檢測KRAS第二外顯子的突變情況。KRAS或NRAS突變型的病人不應采取西妥昔單抗或帕尼單抗治療。中國衛生部于2010年10月14日發表了《結直腸癌診療規范（2010版）》。明確指出在患者確定為復發或轉移性結直腸癌接受西妥昔單抗、帕尼單抗時，必須檢測腫瘤組織的K-ras基因狀態。在晚期/轉移性結直腸癌化療中，在治療前檢測腫瘤K-ras基因狀態，EGFR不推薦作為常規檢查項目。KRAS基因突變影響非小細胞肺癌藥物療效KRAS基因野生型的非小細胞肺癌患者能從小分子酪氨酸激酶抑制劑（TKI，如吉非替尼、厄洛替尼）治療中獲益，而基因突變的患者易發生抵抗；KRAS突變型患者使用厄洛替尼聯合化療后，其無癥狀生存期和總生存期明顯低于野生型患者（圖中紅線所示）AndersonSM,2011,ExpertRev.Mol.DiagnEberhardDA,2005,JClinOncol非小細胞肺癌患者檢測KRAS突變相關指南美國國立綜合癌癥網絡（NCCN，2009）指出，KRAS突變與非小細胞肺癌患者TKI抵抗有關，KRAS基因測序有助于確定哪些病人適合TKI治療。當KRAS基因發生了突變，則不建議病人使用厄洛替尼進行分子靶向治療。EGFR突變背景EGFR基因位于染色體7p11.2，大小約200kb，是上皮生長因子（EGF）細胞增殖和信號傳導的受體。EGFR等蛋白酪氨酸激酶功能缺失或其相關信號通路中關鍵因子的活性或細胞定位異常，與腫瘤細胞的增殖、血管生成、腫瘤侵襲、轉移及細胞凋亡的抑制有關。非小細胞肺癌中EGFR突變率在北美和西歐為10%左右，而在東亞為30-50%。其中在亞洲、女性、非吸煙、腺癌患者中EGFR突變率最高，達70-80%。EGFR突變影響肺癌藥物療效研究表明EGFR突變型患者使用吉非替尼的療效要優于卡鉑與紫杉醇組合治療，而在野生型患者中則相反，使用吉非替尼的療效不如卡鉑與紫杉醇組合治療。MokT.S.2009,NEngJMedMaemondoM.2010,NEngJMedEGFR突變位點（常規檢測29個）突變外顯子堿基變化CosmicIDG719A182156G>C6239G719S182155G>A6252G719C182155G>T6253E746-A750del(1)192235-2249del156223E746-A750del(2)192236-2250del156225L747-P753>S192240-2257del1812370E746-A750>I192235-2252>AAT(complex)13551E746-A750del192235-2253del1812728E746-A750>A192237-2251del1512678E746-S752>A192237-2254del1812367E746-S752>V192237-2250>T(complex)12384E746-S752>D192238-2255del186220L747-A750>P192238-2248>GC(complex)12422L747-T751>Q192238-2252>GCA(complex)12419L747-E749del192239-2247del96218L747-T751del192239-2253del156254L747-S752del192239-2256del186255L747-A750>P192239-2248TTAAGAGAAG>C12382L747-P753>Q192239-2258>CA(complex)12387L747-T751>S192240-2251del126210L747-T751del192240-2254del1512369L747-T751>P192239-2251>C(complex)12383T790M202369C>T6240S768I202303G>T6241V769-D770insASV202307-2308insGCCAGCGTG12376H773-V774insH202319-2320insCAC12377D770-N771insG202310-2311insGGT12378L858R212573T>G6224L861Q212582T>A6213EGFR突變與EGFR-TKI藥物療效關系所在外顯子突變類型與EGFR-TKI療效關系18G719A(S/C)3種點突變藥敏突變1919種缺失突變藥敏突變20點突變S768I藥敏突變20點突變T790M耐藥突變*203種插入突變耐藥突變*21點突變L858R藥敏突變21點突變L861Q藥敏突變ADxEGFR試劑盒突變結果檢測組別突變類型所占比例對吉非替尼敏感性證據

1Exon19deletions;L858R90%充分2T790M/deletion;T790M/L858R;G719X;L861Q;S768I7%有限3T790Malone;Exon20insertions;othermutations3%無ARMS-PCR的基本原理和技術特點ARMS-PCR原理ARMS是AmplificationRefractoryMutationSystem(擴增阻礙突變系統)的縮寫。根據PCR過程中要求引物和模板間的嚴格互補配對來實現對突變位點的檢測,當引物3′末端出現錯配時,產物將不能延伸。因此設計兩條上游（或下游）引物，使其3′末端分別與突變位點堿基匹配和錯配，共用下游（或上游）引物，分別擴增野生型和突變型目的片斷。PCR產物檢測--RealtimePCR每個PCR循環檢測熒光信號，不同PCR產物，不同熒光信號相比凝膠電泳：更快，可定量，無PCR產物污染信號產生方法：Scorpion(Qiagen)，雙環探針(廈門艾德)，Taqman，Molecularbeacons，Sybrgreen，Yo-proFigure2ThesensitivityofQuanTAS-PCRforquantifyingJAK2mutantalleles.ZapparoliG.V.2013,BMCCancer應用于Realtime-PCR的ARMS-PCRGCATGAAGGalleleAallele5’5’5’5’3’3’3’3’ASprimerASprimerMismatchMismatchReverseprimerReverseprimerFAM-5’3’-BHQ1FAM-5’3’-BHQ1ProbeProbe測序法與ARMS法相比較Sanger測序法焦磷酸測序ARMS敏感度10-20%5-10%1%FFPE標本成功率低較高高商用試劑盒無有有流程與速度1-2天2-3天<1天數據分析要求高高低試劑成本低低略高儀器成本高高低操作流程及數據解讀使用ARMS的KRAS突變檢測試劑盒試劑盒公司密碼子位點個數檢測技術TheraScreenassayQiagencodon12、137個重要突變ARMS-PCR和蝎形探針技術KRAS檢測試劑盒廈門艾德codon12、137個重要突變ARMS-PCR和雙環探針技術人K-RAS基因7種突變檢測試劑盒上海透景(Tellgen)codon12、137個重要突變ARMS-PCR和Taqman探針技術人類KRAS基因7種突變檢測試劑盒武漢友芝友Codon12、137個重要突變ARMS-PCR熒光探針法人KRAS基因突變檢測試劑盒蘇州工業園codon12、134個突變ARMS-PCR和Taqman探針技術使用ARMS的EGFR突變檢測試劑盒DxSARMSADxARMS友芝友生產廠商英國DxS公司(Qiagen)廈門艾德公司武漢友芝友引物與探針設計蝎形引物與探針雙環引物與探針特異性引物和探針檢測突變種類29種29種29種突變判讀FAM信號,ΔCt值FAM信號,Ct值FAM信號,Ct值DNA用量20ng10ng20ng樣本中檢測1%突變適用qPCR機型StratageneMx系列,ABI系列StratageneMx系列,ABI系列,Lightcycler480StratageneMx3000P,ABI7500,Lightcycler480等

等位特異性引物設計三引物設計原理YouF.M.2008,BMCBioinformatics三引物設計 ATGACTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTGGTGGCGTAGGCAAGAGTGCCTTGACGATACAGCTAATTCAGAATCATTTTGTGGACGAATATGATCCAACAATAGAGGATTCCTACAGGAAGCAAGTAGTAATTGATGGAGAAACCTGTCTCTTGGATATTCTCGACACAGCAGGTCAAGAG野生型引物（F） 5’-CTTGTGGTAGTTGGAGCTG-3’ 19nt，51℃突變型引物（F） 5’-CTTGTGGTAGTTGGAGCTA-3’ 19nt，49℃下游引物（R） 5’-CCTCTATTGTTGGATCATATTCGTC-3’ 25nt，54℃三引物設計—下游引物設計 ATGACTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTGGTGGCGTAGGCAAGAGTGCCTTGACGATACAGCTAATTCAGAATCATTTTGTGGACGAATATGATCCAACAATAGAGGATTCCTACAGGAAGCAAGTAGTAATTGATGGAGAAACCTGTCTCTTGGATATTCTCGACACAGCAGGTCAAGAG選擇序列： 5’-GACGAATATGATCCAACAATAGAGG-3’互補鏈： 3’-CTGCTTATACTAGGTTGTTATCTCC-5’下游引物： 5’-CCTCTATTGTTGGATCATATTCGTC-3’3’端增加錯配如果3’端是弱錯配（C/A或G/T）則需要引入強的錯配（A/G或C/T）才可阻斷3’端的擴增；如果3’端是強錯配（A/G或C/T）則需要引入弱的錯配（C/A或G/T）或不需引入錯配即可阻斷3’端的擴增；當3’端是中度錯配（A/A，C/C，G/G或T/T）則需要引入中度的錯配。野生型引物（F） 5’-CTTGTGGTAGTTGGAGCTG-3’突變型引物（F） 5’-CTTGTGGTAGTTGGAGCCT-3’下游引物（R） 5’-CCTCTATTGTTGGATCATATTCGTC-3’四引物設計四引物設計ATGACTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTGGTGGCGTAGGCAAGAGTGCCTTGACGATACAGCTAATTCAGAATCATTTTGTGGACGAATATGATCCAACAATAGAGGATTCCTACAGGAAGCAAGTAGTAATTGATGGAGAAACCTGTCTCTTGGATATTCTCGACACAGCAGGTCAAGAG內引物（F）5’-CTTGTGGTAGTTGGAGCTA-3’內引物（R）5’-ACTCTTGCCTACGCCACC-3’外引物（F）5’-ATGACTGAATATAAACT-3’外引物（R）5’-CTCTTGACCTGCTGTGTCG-3’KRAS試劑盒開發簡介KRAS突變探針和引物設計KRAS序列：ATGACTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTGGTGGCGTAGGCAAGAGTGCCTTGACGATACAGCTAATTCAGAATCATTTTGTGGACGAATATGATCCAACAATAGAGGATTCCTACAGGAAGCAAGTAGTAATTGATGGAGAAACCTGTCTCTTGGATATTCTCGACACAGCAGGTCAAGAG1.5’-CTTGTGGTAGTTGGAGCTTA-3’ 12GGT—GAT2.5’-AAACTTGTGGTAGTTGGAGCG

GT-3’ 12GGT—GTT3.5’-AACTTGTGGTAGTTGGAGCTGC-3’ 12GGT—GCT4.5’-ATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTA-3’ 12GGT—AGT5.5’-AACTTGTGGTAGTTGGAGCG

T-3’ 12GGT—TGT6.5’-ATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCC

C-3’ 12GGT—CGT7.5’-GTGGTAGTTGGAGCTGGTAA-3’ 13GGC—GAC8.參照引物：5’-CTGAATATAAACTTGTGGTAGTT-3’9.下游引物：5’-ACCTCTATTGTTGGATCATATTCGTC-3’TaqMan探針：5’-FAM-TCTGAATTAGCTGTATCGTCAAGGCACTCT-BHQ1-3’鎖核酸阻滯探針(野生型)：5’-TGGAGCTGGTGGCGTAGGC-P04-3’浙江大學，CN102367478B反應體系引物終濃度：0.3μMTaqma