西南大學網絡與繼續教育學院課程考試試題卷類別：網教專業:農學2018年6月課程名稱【編號】：細胞工程【1117】A卷大作業滿分：100分一、問答題（84分）（請選擇6道題作答，14分/題，共84分）簡述離體條件下生長素與細胞分裂素在細胞分化中的作用。答：離體培養中，外源激素在細胞內的吸收和代謝影響到激素的活性從而影響其培養效果。外源細胞分裂素被外植體吸收后，在細胞內首先被修飾和轉化形成多種分子形式，包括活化形式和鈍化形式。一般認為，細胞分裂素自由堿基形式是活性形式，而核苷形式為鈍化形式，細胞分裂素進入細胞后轉化成核苷形式是降低其活性的主要原因。因此，細胞分裂素自由堿基形式與核苷形式相互轉換的酶學機制，可能是植物細胞內細胞分裂素活性的重要調控機制。生長素進入細胞后，一部分以游離狀態存在，另一部分則與氨基酸結合形成生長素一氨基酸復合體。與生長素結合的氨基酸主要為天冬氨酸，也有谷氨酸。2，4-D、NAA、IAA是常用的3種生長素，前兩種為化學合成生長素，IAA為生物合成生長素，植物細胞本身也具有合成IAA的能力。研究認為，與細胞分裂素相似，生長素的復合體形式是鈍化形式，而游離形式才具有誘導和調控作用，培養效果與游離生長素的含量成顯著正相關。2,4-D在進入植物體后，能夠持續地以游離形式存在，與氨基酸的結合量很少。但IAA進入細胞后大多與氨基酸結合形成復合物，游離形式很少。NAA則介于二者之間（表）。因此，不同生長素可能具有不同的作用方式。近年來的研究還證明，植物激素對生長發育的調控是通過復雜的信號轉導途徑實現的，不同的生長素均具有各自獨立的生長素受體。這些研究指出，盡管不同生長素在離體培養中具有類似的作用，但它們調控細胞生長與分化的途徑和方式可能存在較大差異。對于各種生長素作用方式和調控途徑的深入了解，將對離體培養中器官分化的有效調控具有重要意義。簡述體細胞無性系誘變的方法及突變體篩選方法。答：體細胞無性系變異的表示方法主要有兩種：一種是Chaleff（1981）提出的以R0、R1、R2、…分別代表體細胞無性系變異的當代和自交以后的世代；另一種是由Larkin和Scowcroft（1983）提出的以SC1、RC2、RC3、…來分別代表體細胞無性系變異的當代和自交以后的世代.現在，這兩種表述方式在體細胞無性系變異研究中均有應用.離體條件下的體細胞無性系變異的篩選有以下一些明顯的優點：（1）由于篩選可以在離體條件下進行,從而可以在小空間內對大量個體進行選擇.（2）細胞突變體的篩選可以在幾個細胞周期內完成，且不受季節限制，因此篩選效率高.（3）因為試驗是在人工設計的培養條件下進行的,因此誘變和篩選條件可以根據需要進行調節和控制，從而提高了試驗的重復性.（4）由于變異是在單細胞水平上進行的，因此，一個突變體就是來自一個細胞，不會有非突變細胞的干擾，避免了整體植株水平上無性變異常呈現出的嵌合體，因而可以省去變異分離的麻煩.（5）在細胞培養系統中，理化誘變劑可較均勻地接觸細胞，因此可以引起培養細胞相對較高頻率地發生突變，增加了選擇機會.一、體細胞變異誘導材料的選擇選擇起始材料需根據試驗目標確定，一般需考慮以下幾方面的問題：其一，目標性狀的可行性.體細胞突變的頻率雖然較高，但對于某一個體來講，變異的性狀是個別的，因此選擇綜合性狀良好的植物品種材料，通過誘變改變個別不良性狀，是體細胞突變系選擇的目的.其二，必需充分考慮試驗植物的細胞培養技術水平，只有對起始材料有良好的培養技術，才有可能制定完滿的誘變及選擇方案.如果起始細胞的培養技術不成熟，不能再生整株，則不能進行后續的各項操作.其三，適當的細胞類型亦是提高體細胞突變系篩選效率的重要條件.二、培養細胞的自發變異離體培養的植物細胞會出現較高頻率的自發變異，離體培養中體細胞自發突變所產生的變異往往比較穩定，沒有人工誘變的后續干擾，有利于分離和選擇.育種家們應用自發突變的這些優點，已選育出一些新品種，如美國RNA植物技術公司已從番茄體細胞無性系變異中選育出新品種，臺灣的育種家也從甘蔗體細胞無性系再生植株變異中選育出新品種簡述超低溫保存的概念及常用的超低溫保存方法。答：-80°C以下低溫下，活細胞的物質代謝和生命活動幾乎完全停止，而恢復到常溫后，植物仍能進行正常的生命活動的離體保存方式稱為超低溫保存。常用保存方法：冷凍誘導保護性脫水的超低溫保存和玻璃化處理的超低溫保存。簡述體細胞雜交中雜種細胞的選擇方法，及雜種植株的鑒定方法。答：植物體細胞雜交是在原生質體培養技術的基礎上，借用動物細胞融合方法發展起來的一門新型生物技術。植物體細胞雜交的過程包括原生質體的制備，原生質體融合的誘導，雜種細胞的篩選和培養，以及雜種植株的再生與鑒定等環節。下面以煙草和大豆的體細胞雜交為例，簡要介紹植物體細胞雜交的過程。原生質體制備選取煙草植株上的幼嫩葉片和培養好的大豆細胞，用酶解法制備原生質體。煙草的原生質體呈綠色，大豆的無色，在顯微鏡下很容易將二者區別開來。原生質體融合取等量的煙草和大豆的原生質體混合后，加入聚乙二醇溶液。在顯微鏡下觀察，可以看到原生質體相互黏集在一起。隔一段時間后，加入高鈣、高pH的溶液，這時原生質體才開始融合。原生質體融合包括膜融合和核融合兩個過程。誘導融合只能誘導細胞膜的融合，兩個核的融合是在雜種細胞第一次有絲分裂時進行的。雜種細胞的篩選和培養煙草與大豆的原生質體融合后，將原生質體轉移到適當的培養基上培養，使原生質體再生出細胞壁。這時，在細胞混合物中，不僅有煙草一大豆雜種細胞，還有煙草細胞、大豆細胞、煙草一煙草細胞、大豆一大豆細胞。雜種細胞的篩選，可以用機械方法，也可以用生理學或遺傳學的方法。以機械方法為例，根據兩種親本細胞在形態、色澤上的差異，將細胞分別接種在帶有小格的培養皿中，每個小格中約放1?3個細胞。在顯微鏡下找出雜種細胞，并且標定位置。等雜種細胞分裂成細胞團時，轉移到培養皿中，培養成愈傷組織。雜種植株的再生與鑒定雜種植株的再生是指從愈傷組織培養出雜種植株的過程。由于煙草和大豆分別屬于茄科和豆科，二者的原生質體融合后，至今只能長成雜種愈傷組織，還不能分化，因此談不上雜種植株的再生和鑒定。對于能夠再生出雜種植株的，如煙草一海島煙草、白菜一甘藍、胡蘿卜一羊角芹等，長出的植株究竟是不是雜種，還需要經過鑒定才能確定下來。雜種植株的鑒定方法有形態學方法、生化方法（如電泳）、細胞學方法（如染色體組型分析）、分子生物學方法（如分子雜交）等簡述真核生物細胞周期調控的分子機理。答:真核生物細胞中存在有復雜的調節細胞周期的關鍵分子，它們通過相互制約或偶聯形成復雜而精確的細胞周期調控網絡。在這些關鍵分子中，cyclin（細胞周期蛋白）和CDK（cyclin-dependentkinase，周期蛋白依賴激酶）是兩類主要的調控分子。細胞周期運行的動力主要來自CDK，其活性則主要通過cyclin調節。CDK的活性還受另外一類蛋白質的負向調節，這類蛋白質被稱為CKI（cydin-dependentkinaseinhibitor，周期蛋白依賴激酶抑制子）。因此，科學家形象地把CDK比作引擎，而cyclin則是油門，CKI是剎車（吳家睿，2002）。植物細胞周期的調控主要有兩類CDK（CDK-a、CDK-b）和兩類細胞周期蛋白（CycB、CycD）。在環境或激素等外界條件作用下，CycD基因首先表達生成CycD，在相關調節因子的幫助下，CycD與CDK-a結合形成CDK-a-CycD復合體使CDK-a活化，進而對Rb（G1期限制點調控分子）磷酸化，使細胞通過“限制點”進入分裂周期。當細胞進入分裂周期后，則由CDK-b與CycB以及相關的調節蛋白完成從S期到M期的調控。植物激素是離體培養中所必需的條件，因此，與植物激素相關的基因表達被認為是啟動細胞脫分化的關鍵。在細胞脫分化和促進細胞分裂的過程中，PSKa可能介導了與生長素和細胞分裂素密切相關的信號轉導途徑。6、簡述動物細胞培養技術的原理、方法和應用價值。答：動物細胞培養就是從動物機體內取出相關的組織，將它分散成單個細胞，然后，放在適宜的培養基中，讓這些細胞生長和增殖。動物細胞培養通常選擇動物胚胎或幼齡動物的組織、器官，它們細胞增殖能力強，分裂旺盛，分化程度低，容易培養。在進行動物細胞培養時，用胰蛋白酶分散細胞，說明細胞間的物質主要是蛋白質。動物細胞培養適宜的PH為7.2—7.4，此環境下胃蛋白酶（2.0）沒有活性，而胰蛋白酶（7.2-8.4）的活性較高。通常使用液體懸浮培養。動物細胞培養條件在無菌、無毒的環境；培養基營養含有葡萄糖、氨基酸、無機鹽、維生素、動物血清等（添加一定量的抗生素，定期更換培養液）；溫度在36.5+（-）0.5度；氣體環境有02和CO2（95%空氣和5%CO2）。動物細胞培養技術的應用主要：（1）生產蛋白生物制品：病毒疫苗、干擾素、單克隆抗體等。（2）獲得大量自身的皮膚細胞，用于植皮。（3）用于檢測有毒物質。（4）用于生理、病理、藥理等方面的研究，為治療和預防疾病提供理論依據7、建立細胞懸浮培養體系有哪些關鍵環節？如何調控？答：二、論述建立細胞懸浮培養體系，一般采用愈傷組織作為起始細胞來源，以愈傷組織為起始細胞的懸浮培養技術，其關鍵主要包括愈傷組織誘導、懸浮系的建立與繼代培養、細胞生長狀態調控等幾個環節。愈傷組織誘導以愈傷組織作為細胞懸浮培養的細胞來源，首先就必須誘導出適宜的愈傷組織。誘導愈傷組織，首先必須選擇適宜的植物外植體材料其次，培養基的附加成分對建立疏松易散的愈傷組織具有較大的影響，特別是生長素的濃度至關重要。除了生長素外，配合一定濃度的細胞分裂素也是十分必要的。還需附加一定濃度的水解酪蛋白、脯氨酸、谷氨酰胺等有機物質。培養基的蔗糖濃度也會影響愈傷組織的形態。在繼代培養中不斷選擇那些疏松性好、細胞狀態好的細胞不斷繼代培養，才能獲得大量均勻一致、疏松易碎、適合于建立懸浮細胞系的愈傷組織。另外，縮短繼代培養的時間間隔，可以有效提高疏松愈傷組織的誘導率。懸浮系的建立與繼代培養在培養初期，懸浮細胞培養物可能呈現黏稠狀，影響細胞生長，因此每隔3天左右要更換一次新鮮培養基。連續繼代培養一段時間后，這種情況可自行消失。為了保持懸浮細胞一直處于一個相對穩定的良好狀態，一般每隔1?2周甚至更短的時間就要繼代一次。每次繼代時均要進行選擇，篩選細胞生活力好的細胞繼代，淘汰過大和生理狀態不好的細胞和細胞團。篩選方法一般采用蔗糖梯度離心法，有時為了簡便也可米用過濾法。懸浮細胞的生長動態懸浮培養系統中，細胞數量隨著培養時間的變化，其擴增生長呈S形曲線。在細胞接種最初的時間內細胞很少分裂，經過一個延遲期（lagphase），然后進入指數生長期（exponentialgrowthphase）和細胞迅速增殖的直線生長期（lineargrowthphase），接著是細胞增殖減慢的減緩期（progressivedecelerationalphase）和停止生長的靜止期（stationaryphase）。靜止期的細胞數量和質量均會下降，如果繼代不及時，長期處于停止期的細胞往往會出現死亡和生活力下降，從而影響整個懸浮細胞系的狀態。因此，在通常情況下，當細胞生長進入減緩期時就要及時繼代。接種初期的細胞密度過低往往使延遲期加長，因此，根據培養目的的不同，懸浮細胞的起始密度一般可在每毫升（0.5-2.5）X105個細胞間進行調整。如果只是一般繼代培養，則可適當選擇低密度接種，以延長培養周期，減少繼代培養的操作。但如果希望在較短時間內獲得大量活躍生長的細胞，則可適當提高接種密度，這樣可縮短繼代培養時間。起始密度通常通過細胞計數的方法確定。二：論述題（請選擇1道題作答，共16分）現有小鼠及其骨髓瘤細胞、破傷風桿菌抗原，設計一個實驗無限生產破傷風桿菌單克隆抗體，并說明實驗中使用的技術的應用價值及意義。如果有一品質和產量不好的植物，希望通過轉基因的方法轉入能改良其品質和產量的基因，請根據細胞工程中農桿菌介導的方法闡述其轉基因的原理、方法、步驟及可能出現的問題等。答：可以通過轉基因方法（農桿菌介導的方法）轉入改良品質和產量的基因，整合