ICS65.020.20B16

DB45廣西壯族自治區地方標準DB45/T2180—2020甘蔗黃葉病毒檢測技術規程Technicalcriterionfordetectionofsugarcaneyellowleafvirus2020-10-292020-11-30廣西壯族自治區市場監督管理局發布DD4/122前言本文件按照GB/T1.1—2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結構和起草規則》的規定起草。本文件由廣西壯族自治區糖業辦公室提出并監督實施。本文件由廣西糖業標準化技術委員會歸口。本文件起草單位：廣西壯族自治區農業科學院甘蔗研究所、廣西甘蔗遺傳改良重點實驗室。本文件主要起草人員：魏春燕、覃振強、韋金菊、宋修鵬、張小秋、李德偉。IIDD4/122DD4/1225組織免疫印跡法檢測甘蔗黃葉病毒檢測技術規程1范圍本文件規定了甘蔗黃葉病毒檢測技術規程的樣品采集與存放，組織免疫印跡法檢測和一步法RT-PCR檢測的原理、儀器與設備、試劑、操作步驟和檢測結果的判定。本文件適用于甘蔗黃葉病毒的快速檢測。2規范性引用文件下列文件中的內容通過文中的規范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682—2008分析實驗室用水規格和試驗方法3術語和定義下列術語和定義適用于本文件。下列術語和定義適用于本文件。3.1+1葉topvisibledewlapleaf甘蔗植株最高可見肥厚帶葉。4樣品的采集與存放4.1采樣工具砍刀、剪刀、鑷子等采樣工具應經1211.1×10Pa高壓滅菌15min或經1602h。采樣方法采樣前和采樣過程中應避免樣本交叉污染，采樣及樣品前處理過程中應戴一次性手套。甘蔗植株采樣：取甘蔗植株的+115cm甘蔗蔗種采樣：取中部種莖，編號保存備用。4.3運送和存放4.3.12℃～8運送；運到實驗室后應在47d。4.3.2RT-PCR2℃～8424801原理將待測的樣品印跡在固相載體硝酸纖維素膜上，用病毒的特異性抗體與吸附在固相載體上的病毒進行特異性反應，再與堿式磷酸酶標記的第二抗體進行反應，最后用堿式磷酸酶的反應底物硝基酚磷酸片進行顯色反應，根據顏色的變化，確定病毒的感染程度。儀器與設備圓周式搖床：可調振蕩速50rpm～300rpm。普通光學顯微鏡：放大倍數范40X～1600X。電子天平：0.1g。硝酸纖維膜、酒精燈、手術刀、載玻片、培養皿。試劑除另有規定外，所用試劑均為分析純或生化試劑；實驗室用水GB/T6682二級水指標，其中涉PCR符合一級水指均用滅菌的容器分裝配制好的4℃條件下保存。甘蔗黃葉病毒單克隆抗體。堿性磷酸酯酶標二抗。硝基酚磷酸片（BCIP/NBT）。TBS-T（pH三羥甲基氨基氯化g，吐溫-20（Tween-20）5mL,用蒸餾水溶解并定容1000mL，pH7.5進行高溫滅菌，冷卻后保存備用。2％脫脂奶粉TBS-T封閉液：稱2g100mLTBS-T緩沖液配制2％脫脂奶粉的TBS-T封閉液，現配現用。1％脫脂奶粉TBS-T緩沖液：稱1g50mLTBS-T緩沖液配制2％脫脂奶粉的TBS-T封閉液，現配現用。標準樣品：——陽性對照：用已知含甘蔗黃葉病毒的樣品作陽性對照；——陰性對照：用已知不含甘蔗黃葉病毒的樣品作陰性對照。5.4操作步驟樣品制備從4℃冰箱中取出材料75％酒精進行葉片表面消選取葉中脈火焰消毒的解剖刀切葉中脈并把新鮮切口垂直印在硝酸纖維膜上，保持5s～6s至硝酸纖維膜出現清晰完整的印跡，每個3次重復印跡，印好的膜在室溫下自然風干10min～15min后置于4℃冰箱保存備用。將印好的硝酸纖維膜置于盛有2％脫脂奶粉的TBS-T封閉液的培養皿封閉液的用維膜為宜，置培養皿于轉速為50rpm的水平搖床，室溫下孵育40min～60min。2第一次洗滌用TBS-T緩沖液洗膜3每次5在50rpm的水平搖床上進行證膜可以完全洗脫干凈5.4.2.3第一次孵育將清洗后的膜轉入含有1％脫脂奶粉的TBS-T緩沖液的培養皿中，同時在緩沖液中加入特異性抗體（抗體稀釋比例為1:7000），在室溫下孵育3h或4℃靜置過夜，室溫孵育時在轉速為50rpm的水平搖床上進行。同5.4.2.2。第二次孵育將清洗后的膜轉入含有1％脫脂奶粉的TBS-T緩沖液的培養皿中，同時在緩沖液中加入含有堿式磷酸酶標記的二抗（抗體稀釋比例為1:2000），在室溫下孵育3h，孵育時在轉速為50rpm的水平搖床上進行。同5.4.2.2。顯色和終止將清洗將清洗后的膜轉入顯色液（每片硝基酚磷酸片溶于10mL蒸餾水）中，在5min～10min內觀察，待陽性對照顯示清晰的紫藍色時，將膜轉入蒸餾水中使之終止反應。5.5檢測結果的判定5.5.1判定依據檢測過程中分別設定陽性對照和陰已知含有甘蔗黃葉病毒的樣品作陽已知含甘蔗黃葉病毒的樣品作陰性對照，判定依據如下：——陰性對照：樣品印跡在膜上未顯示有任何紫藍色；——陽性對照：樣品印跡在膜上顯示有清晰的藍紫色。5.5.2陰性樣品印跡在膜上未顯示有任何紫藍色，表示樣品中不含甘蔗黃葉病毒。5.5.3陽性樣品印跡在膜上顯示有清晰的藍紫色，表示樣品中含甘蔗黃葉病毒。6一步法RT-PCR檢測3DD4/122DD4/122原理經反轉錄酶的作用從RNA合成cDNA，再以cDNA為模板，擴增合成目的片段。RT-PCR可以一步法或RT-PCR反轉錄和PCR在同時為反轉錄和PCR的優在同一支管中順次進行。儀器與設備普PCR電子天平：0.01g。高速臺式冰凍離心機：最15000g。組織研磨儀。水平電泳系統。凝膠成像系統。6.2.7微量移液μL～2.5μL～10μL～100μL～200μL～1000μL6.2.8RNA的離心管、PCR反應管、硝酸纖維膜、手術刀、載玻片、酒精燈。6.2.9冰箱：2℃～4℃，-20℃，-80℃。試劑植RNA提取試劑盒。RT-PCR擴增試劑盒。6.3.3DNA分子量標準物（100bp～2000bp）。DNA樣緩沖液（6×DNALoadingBuffer）。檢測引物:物SCYLVf1：5’-GACAGACTCGGCCAGTGGTCGTG-3’；物SCYLVr1：5’-GTAAGCCATTGTTGAACGCTGCG-3’；——擴增片段大小為219bp。50×TAE取三羥甲基氨基甲烷（Tris）242.2g300mL水加熱攪拌溶解后，加100mL500mM/L乙二胺四乙酸（EDTA）的水溶液（pH8.0），用冰乙pH8.0，用蒸餾水定容到1000mL。1×TAE50×TAE儲液直接用蒸餾水50倍稀釋即得1×TAE，現配現用。6.3.8標準樣品:同5.3.7。操作步驟總RNA取與組織研磨儀配套使用且內含2mL無RNA，并對每個管進行編號。取出冰箱中存放的樣品材料剪碎混勻后稱1g樣品（蔗莖樣品要去除表皮）轉至離心管，并0.9mL提取試劑盒中配RNA提取液。將離心管置于組織研磨儀上震蕩粉2min，取出離心管并置4℃、12000g10min吸取上清液至另一不含2mL無RNARNA提取試劑盒推薦的操作方法完RNA的提取，提取完RNA于冰上RNA應2hRT-PCR擴增；若需長期保存，應放置-80℃冰箱。4PCR以樣品、陰性和陽RNA，并以超純水為空白對照模板；選RT-PCR試劑盒在同PCR反應管內進行反轉錄PCR擴增，具體步驟按照試劑盒推薦的操作方法進行。6.4.2.2從試劑盒RT-PCR反應液，在冰上融化后，2000g5s。每個測試樣本反應混合液配制參見表1。表1每個測試樣本反應混合液配制的組分及使用量試劑使用量25μL反應體系終濃度5×反應緩存液5.00μL1×10mmol/LdNTPs0.50μL0.2mmol/LSCYLVf1（10μM）1.00μL0.4μmol/LSCYLVr1（10μM）1.00μL0.4μmol/L10U/μLRNAase抑制劑0.25μL2.5U/25μLDEPC水15.25μL/RT-PCRMix1.00μL/模板RNA1.00μL/總體積25μL/根據測試樣品的數量計算好各試劑的使用量，全部加完后，充分混合均勻，2000g5s，向每個做好標記PCR管中各分24.0μL。向各個標記好PCR管中分1.0μLRNA蓋緊管蓋微g30s將加PCR管放PCRPCR反應條件后開始程序。PCR反應程序為：50℃進行cA成3in5℃預變性5in進行5次擴增（9℃變性1in1火1mn72℃延30s）；7210min。反PCR反應管并4℃條件下保存。擴增產物的電泳檢測稱取適量瓊脂糖加入1×TAE緩沖液中，加熱至完全溶解，配制成1.5％的瓊脂糖溶液；稍適冷卻后倒板，室溫下凝固成瓊脂糖凝膠。分別2μL6×上樣緩沖液5μLPCR擴增產物到PCR管，振蕩混勻，2000g5s。分別將5μL的DNA分子量標準物和PCR產物混合液依次加入瓊脂糖凝膠的點樣孔后進行電泳電泳使用的電壓80V，電泳時間30min。凝膠成像分析將瓊脂糖凝膠置于凝膠成像系統成像儀，根據DNA分子量標準物判斷擴增出的目的條帶大小，泳結果用拍照系統拍照形成圖片文件存檔。檢測結果的判定5判定依據檢測過程中分別設定陽陰已知含有甘蔗黃葉病毒的樣品作陽用已知不含甘蔗黃葉病毒的樣品作陰性對照；用等體積的無RNA酶的水代替模板作空白對照，判定依據如下：——空白對照：無任何目的擴增條帶；——陰性對照：219bp小的目的擴增條帶；——陽性對照：出現219bp小的目的擴增條帶。6.5.2陰性無219bp大小的目的擴增條帶，表示樣品中不含甘蔗黃葉病毒。6.5.3