PAGE17/NUMPAGES17生物制藥工藝學實驗生物制藥工藝學實驗指導

（12個實驗，36學時）

焦飛

生物技術教研室

實驗一健胃消食片配方及片劑的制備

一、實驗目的

1.掌握壓片機壓片的方法及影響片劑成型的主要因素；

2.學會片劑處方的調配。

二、實驗材料和儀器

太子參，陳皮，山藥，麥芽（炒），山楂，蔗糖粉，糊精，硬脂

酸鎂，粉碎機，干燥箱，制片機

三、實驗原理

健胃消食片為內科傷食類非處方藥品，主治健胃消食，用于

脾胃虛弱，消化不良，脾胃虛弱所致的食積，癥見不思飲食，暖

腐酸臭，脘腹脹痛。健胃消食片的配方如下，太子參228.6g，陳皮22.9g，山藥171.4g，麥芽（炒）171.4g，山楂114.3g，蔗糖糊精適量，值得片劑為淡棕黃色的片或薄薄膜片，氣略香，味微甜，酸。制作方法：太子參半量與山藥粉碎成細粉，其余陳皮三味藥

及剩余的太子參置于燒杯，加3倍量水，煎煮1小時，濾過，合并兩次煎液，減壓濃縮至浸膏，干燥。將蔗糖粉糊精和生藥粉以

3：1：1的混合粉與浸膏混合制成軟材，軟材的軟硬應適當，以“手握成團，輕壓則散”為宜。采用擠出制粒的方法制成顆粒，

顆粒在60-80攝氏度干燥，干燥時應逐漸升溫，以免因顆粒表面

干燥過快結成硬殼而影響內部水分的蒸發。顆粒整粒后加入1％硬脂酸鎂混合后壓片。

四、實驗步驟

1.稱取太子參2

2.8g，陳皮2.3g，山藥17.1g，山藥17.1g，麥芽

17.1g，山楂11.4g

2.太子參山藥用粉碎機粉成細粉。

3.將上述藥材放入燒杯中，加入3倍量的水，煎煮半小時，重復

兩次，將上清液合并，減壓濃縮至浸膏，將所得浸膏放入烘

箱中80度干燥。

4.將蔗糖粉糊精和干燥后的粉末以3：1：1的比例混合制成顆粒

軟材，將軟材放入烘箱中逐漸升溫干燥。

5.干燥后的軟材加入1％硬脂酸鎂放入壓片機中壓片。

實驗二溶菌酶結晶的制備

一、實驗目的

1.掌握鹽析法提取蛋白質的原理和過程；

2.學會溶菌酶的結晶和精制方法。

二、實驗材料與儀器

新鮮雞蛋，氯化鈉，1氫氧化鈉溶液，醋酸緩沖液，燒杯，玻璃棒，布氏漏斗，干燥箱。

三、實驗原理

溶菌酶又稱細胞壁質酶或N—乙酰胞壁質聚糖水解酶，是一種國內外很緊銷的生化物質，廣泛應用于醫學臨床。具有多種藥理作用，能抗感染、消炎、消腫、增強體內免疫反應等，有抗菌

的作用，常用于五官科多種粘膜炎癥，皮膚帶狀瘡疹等疾病。是

優良的天然防腐劑，可用于食品的防腐保鮮。尤其重要的是近年來溶菌酶已成為基因工程及細胞工程必不可少的工具酶。

四、實驗步驟

（1）收集雞蛋清將新鮮雞蛋兩端各敲一個小洞，使蛋清流出（最好是新生的雞蛋、值不得低于8，否則不能使用），按其體積的兩倍量加入水，輕輕攪拌5，使蛋清溶液的稠度均勻，注意在攪拌過程中不能起泡，攪拌不宜過快、攪拌棒應光滑等，以防

蛋白質變性而影響溶菌酶產品的得率及質量，最后用雙層細紗布濾除蛋清溶液中的臍帶塊及碎蛋殼等。

（2）加入氯化鈉按每100蛋清溶液加入2g.氯化鈉的比例，白蛋清溶液中慢慢加入氯化鈉細粉，邊加邊攪拌，促使氯化鈉細粉及時溶解，以避免局部濃度過高或沉淀于容器底部，否則會引起蛋白質的變性而產生大量的白色沉淀。

（3）粗制溶菌酶加完氯化鈉細粉后，再用1的氫氧化鈉溶液小心地將上述蛋清溶液的值調節到10.8。在用氫氧化鈉溶液調節蛋清溶液值時，用膠頭滴管將其逐漸滴入并不斷攪拌以免局

部過堿而導致蛋白質的變性，從而影響溶菌酶的得率和質量。為加速溶菌酶的結晶過程，可再加入適量的溶菌酶結晶體作為晶種。低溫下靜置數天，溶菌酶結晶將慢慢析出，于72~96h達到最高產率。待結晶完全后，傾去上清液并用布氏漏斗濾出結晶，即可

得到粗制的溶菌酶晶體。

（4）精制溶菌酶將制得的粗結晶用值4.6的醋酸溶解，然后

讓酶液靜置2h，接著過濾除去不溶物，收集濾液并量出體積，

按100濾液加5g氯化鈉的比例加入（加入方法與第二步加入氯

化鈉的方法相同）。然后用1的氫氧化鈉溶液緩慢地將其值調節

到10.8后，低溫下靜置結晶。為加速結晶過程可向酶液中加入

溶菌酶晶種，待結晶完全后再傾去上清液，用布氏漏斗過濾可得

溶菌酶結晶，如純度不夠，可重復操作提純，直至達到所需要的

純度為止，結晶于30~40°:烘干后即得溶菌酶產品。

（5）包裝存貯產品應裝于玻璃或陶瓷容器中，置于陰冷處

保存，以免溶菌酶受熱后失去活性。

注意事項

（1）整個過程只能在玻璃或陶瓷容器中進行，不可用金屬容

器，以免酶失活而影響產品的得率及質量。

（2）操作的全過程要在低溫下進行（10°以下），防止原料變質和酶失活。

（3）第三步中加入溶菌酶晶種的具體操作是將溶菌酶晶體均

勻地懸浮于少量的值為10.8，濃度為5%氯化鈉溶液中，取幾滴

加入到調好的值和氯化鈉濃度的蛋清液內，再置低溫處結晶。

實驗三纖維素酶活力的測定

一、實驗目的

1.了解纖維素酶的種類和測定原理，以及纖維素酶的作用特性；

2.掌握3,5-二硝基水楊酸（）法測定纖維素酶活力的原理和方法。

二、實驗原理

纖維素酶是一種多組分酶，包括4種組分：內切β-1,4-葡聚糖酶、外切β-1,4-葡聚糖酶、纖維二糖水解酶和纖維二糖酶（又稱

β-葡聚糖苷酶）。在各種酶組分的協同作用下，能降解纖維素，

使之變成纖維寡糖、纖維二糖和葡萄糖等還原糖。這些還原糖能

將堿性條件下的3,5-二硝基水楊酸（）還原，生成紅棕色的氨基

化合物，在540波長處有最大光吸收，在一定范圍內還原糖的量

與反應液的顏色強度呈比例關系。利用比色法測定其還原糖的量

就可測定纖維素酶的活力。

由不同底物測得的酶活力分別稱為（濾紙糖酶活力）和

（羧甲基纖維素酶活力）。為了統一標準，目前通常用濾紙作為

纖維素酶作用的底物。

纖維素酶在一定溫度和條件下，將纖維素底物(濾紙)水解，釋放出還原糖。在堿性、煮沸條件下，3,5-二硝基水楊酸(試劑)與還原糖發生顯色反應，其顏色的深淺與還原糖(以葡萄糖計)含量成

正比。通過在540測其吸光度，可得到產生還原糖的量，計算出

纖維素酶的濾紙酶活力。濾紙酶活力()指固體酶(或1液體酶)，在(50士0.1)℃,指定條件下(酸性纖維素酶4.8，中性纖維素酶6.0),水解濾紙底物，產生出相當于l葡萄糖的還原糖量，為1個酶活

力單位，以(或)表示。

三、實驗器材和試劑

水浴鍋、分光光度計、計時器、比色皿、移液管、吸耳球

試劑、檸檬酸緩沖液、葡萄糖標準儲備溶液、快速定性濾紙

四、實驗內容

1.葡萄糖標準曲線的繪制：

取7支具塞刻度試管，編號，按照表一規定的量，分別吸取

葡萄糖標準液、緩沖溶液和試劑于各管中，混勻。將標準管同時

置于沸水浴中，反應10，取出，迅速冷卻至室溫，用水定容至25，蓋塞，混勻。在540處測量吸光度，以葡萄糖量為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線，獲得線性回歸方程。

表一葡萄糖標準曲線

管號葡萄糖標準使用溶液緩沖液

吸取量（）

試劑吸

取量（）

濃度（）吸取量()

00.00.0023.0

11.00.501.53.0

21.50.501.53.0

32.00.501.53.0

42.

50.501.53.0

53.00.501.53.0

63.50.501.53.0

2.待測酶液的制備

（1）稱取酶樣1.0g，用檸檬酸緩沖液溶解至100（100倍），

之后分別做200倍、400倍和800倍稀釋,混勻。準確定容放置10，待測。

（2）濾紙條的準備

濾紙條事先干燥，水分平衡后，將濾紙折成寬1，質量為5±0.5的濾紙條，折成M型備用。

（3）酶活力的測定

取四支具塞試管，將折成M型的濾紙條分別放入每支試管底部，其中一支試管空白，分別向四支試管中加入緩沖液1.5，待測酶液0.5（空白管不加），使管內溶液浸沒濾紙，蓋塞。

將四支試管同時置于50℃水浴中，準確計時60，取出，立即向各管中加入試劑3.0。再于空白管中準確加入稀釋好的待測

酶液0.5，搖勻。將四支管同時放入沸水浴中，加熱10，取出，迅速冷卻至室溫，加水定容至25，搖勻。

以空白管（對照液）調儀器零點，在540下，測量三支平行管中樣液的吸光度，取平均值。以平均值查標準曲線或用回歸方

程求出還原糖含量。

（4）酶活力的計算

纖維酶活力按以下公式計算：

×1/0.5×ｎ

式中，樣品的濾紙酶活力，；根據吸光度在標準曲線上查得

的還原糖量，；酶樣的稀釋倍數。

實驗四金銀花、黃芩、川芎和連翹浸膏的制備

一、實驗目的

1．掌握提取方法及操作要點。

2．熟悉提取率的測定方法。

3.了解總浸膏量中總黃酮量和總有機酸量的測定方法。

二、實驗原理

浸膏劑指用適宜溶劑與方法提取中藥中有效成分，蒸去全部

溶劑，調整濃度至規定標準所制成的膏狀或粉狀的固體制劑。除另有規定外，浸膏劑毎1g相當于原有藥材的2~5g。浸膏劑一般用煎煮法或滲漉法制備。煎煮法指將藥材加水煎煮取汁的方法，

一般過程為取規定藥材，切碎或粉碎成粗粉，置適宜煎器中，加

水浸沒藥材，浸泡適宜時間后，加熱至煮沸，保持微沸一定時間，分離煎出液，藥渣依法煎出數次（一般為2~3次），至煎液味淡為止，合并各次煎出液，濃縮至規定濃度。煎煮法適用于有效成

分能溶于水，且對濕、熱均穩定的藥材。滲漉法是將適度粉碎的

藥材置滲漉筒中，由上部不斷添加溶劑，溶劑滲過藥材層向下流動過程中浸出藥材成分的方法。適用于貴重藥材、毒性藥材及高濃度制劑。

三、實驗材料與器材

金銀花、黃芩、川芎、連翹、酚酞試劑、滴定液、0.6()2甲醇溶液

索氏提取儀、回流冷凝管、加熱套、水浴鍋

四、實驗內容

1.金銀花提取

取最粗粉金銀花、黃芩、川芎、連翹各20g，加入200蒸餾水，按煎煮法，煎煮3次，每次30，取上清液或過濾取濾液。2.浸膏制備：將濾液濃縮至稀糖漿狀，靜置2周，過濾，即得浸膏。

3.質量檢查

（1）觀察浸膏的外觀性狀，本品在水浴上蒸干后，在105℃干燥3小時，至恒定，測定測定總浸膏量。

（2）含量測定

①總有機酸的測定：在供試品溶液中加入酚酞試劑2滴，用標定好的0.0749的滴定液滴定至溶液顯粉色。毎1滴定液相當于9.916的水楊酸，總有機酸量以水楊酸計。

②總黃酮的測定：按《中藥化學》中蘆丁測定方法，0.6()2甲醇溶液為參比，于510處測定各溶液吸光值。

實驗五金銀花、黃芩、川芎和連翹浸膏的純化及丸劑的制備

一、實驗目的

1.掌握泛制法、塑制法制備丸劑的方法與操作要點。

2.熟悉水丸、蜜丸、滴丸對藥料和輔料的處理原則及各類丸劑的

質量要求。

二、實驗原理

丸劑是根據中醫辨證論治的原則組方。碾研成細末，混合均

勻后，根據處方用蜜、水、黃酒、醋、面糊、米糊、蜂蠟、藥汁、流浸膏、糖漿等為粘合劑，制成圓球形的內服固體劑型，如蜜丸、水丸、糊丸、蠟丸、濃縮丸等，以治療疾病的一種療法。丸劑的

制法有泛制法、塑制法和滴制法。泛制法適用于水丸、水蜜丸、

糊丸、濃縮丸的制備，其工藝流程為：原、輔料的準備→起模→

成型→蓋面→干燥→選丸→質量檢查→包裝。塑制法適用于蜜丸、濃縮丸、糊丸、蠟丸等的制備，其工藝流程為：原、輔料的準備

→制丸塊→制丸條→分粒、搓圓→干燥→質量檢查→包裝。供

制丸用的藥粉應為細粉或極細粉；起模、蓋面、包衣的藥粉，應

根據處方藥物的性質選用。丸劑的賦形劑種類較多，選用恰當的潤濕劑、黏合劑，使之既有利于成型，又有助于控制溶散時限，

提高藥效。

水丸制備時，根據藥料性質、氣味等可將藥粉分層泛入丸內，

掩蓋不良氣味，防止芳香成分的揮發損失，也可將速效部分泛于外層，緩釋部分泛于內層，達到長效的目的。一般選用黏性適中

的藥物細粉起模，并應注意掌握好起模用粉量。如用水為潤濕劑，必須用8小時以內的涼開水或蒸餾水。水蜜丸成型時先用低濃度

的蜜水，然后逐漸用稍高濃度的蜜水，成型后再用低濃度的蜜水

撞光。蓋面時要特別注意分布均勻。

泛制丸因含水分多，濕丸粒應及時干燥，干燥溫度一般為80℃左右。含揮發性、熱敏性成分，或淀粉較多的丸劑，應在60℃

以下干燥，。丸劑在制備過程中極易染菌，應采取恰當的方法加

以控制。5.滴丸的冷卻劑必須對基質和主藥均不溶解，其比重

輕于基質，但兩者應相差極微，使滴丸滴入后逐漸下沉，給予充

分的時間冷卻。否則，如冷卻劑比重較大，滴丸浮于液面；反之

則急劇下沉，來不及全部冷卻，滴丸會變形或合并。

三、實驗材料與儀器

金銀花、黃芩、川芎、連翹、蜂蜜、純化水

培養皿、小型制丸機

四、實驗內容

1.水丸的制備：金銀花、黃芩、川芎、連翹以上4味，各取5g，混合粉碎成細粉，混勻。①起模：即起母子。可采用藥匾手

工法或包衣鍋機械法。手工法是以小掃帚蘸少許開水，或其他粘合劑均勻地刷在藥匾上，然后撒上少量藥粉，轉動藥匾，使藥粉

全部濕潤，再用干燥棕刷輕輕將藥粉刷離，經過再刷水，加藥粉，旋轉藥匾，如此反復多次，使顆粒逐漸呈圓形而增大，過藥篩選

取均勻的顆粒作為母子。機械法則以包衣鍋代替藥匾起模，其操作方法與手工法基本相同。逐漸加大制成符合要求的丸劑。手工法泛丸是母子的基礎上②泛丸：將篩選的母子。繼續用藥匾，經

過噴水，撒藥粉，利用旋轉、推拉、揉滾、翻擺等操作，反復進行，使藥丸加大到一定水平，過篩，即可制成均勻光滑一致的水

泛丸。機器泛丸基本操作與手工法相同。③干燥：水丸制成后應

將其攤布容器中，于陰涼通風處及時干燥，并應隨時加以翻動。

或用低溫烘干。

2.蜜丸:將藥材細粉用蜂蜜為粘合劑制成的丸劑。分為大蜜丸

及小蜜丸兩種。蜜丸操作主要為煉蜜、丸塊及丸條制備、丸劑分

割與搓圓、干燥、包衣等幾個步驟。①煉蜜：將蜂蜜置于鍋中加

熱熬煉。撈出漂浮物及浮沫以去除其中的雜質，并可殺死微生物，破壞酵素，適當減少水分含量，增加粘合力，以適合制丸要求。

煉蜜依據熬煉時間長短；分為嫩蜜、中蜜(亦稱煉蜜)老蜜3種二煉蜜水平按藥物性質和季節而定，嫩蜜、煉蜜適用于粘性較強的藥材，老蜜則適用于粘性差的礦物或纖維性較多的藥材；冬季多用嫩蜜，夏季多用老蜜。加入煉好的蜂蜜②丸塊及丸條制備：少

量制備時將藥物細粉置于清潔的容器內。混合均勻，制成軟硬適宜的可塑性丸塊，然后搓制成粗細一致的丸條。大量生產時，則

用機械完成丸塊及丸條制備。可以手工制丸或機械制丸。手工制丸按預定規格將丸條掐成均勻顆粒⑧丸劑分割與搓圓：丸條制成后。搓圓即成。機械制丸是丸條制成后自動切割，搓揉，滾圓。干燥方法多用烘干法④干燥：大蜜丸機蜜丸一般應干燥后貯存。

以丸粒互不粘連，不粘手，手捏之不易變形為度。如不需干燥則

以蠟皮包裹貯存。

實驗六植物油/β-環糊精包合物的制備

一、實驗目的

1．掌握飽和水溶液法制備包合物的工藝；用單凝聚法制備微囊

的方法。

2．熟悉β－環糊精的性質及包合物的其他制備方法；熟悉影響

成囊的因素及控制方法。

3．了解β－環糊精包合物的應用。

二、實驗原理

環糊精（，）是一種新型的水溶性包合材料，是淀粉經酶解

得到的一種產物。這些分子中有6~13個葡萄糖分子以α－1，4糖苷鍵連接而成的環筒狀結構的低聚糖化合物，其分子結構中具有一定大小的空穴，有環筒內疏水、環筒外親水的特性。環糊精

包合物是指借助分子間的作用力（包括靜電引力、氫鍵、偶極子

間引力等），藥物分子包含或嵌入環糊精的筒狀結構內形成的超

微粒分散物。形成的包合物服用后在體內經滲透、擴散、競爭性

置換等作用釋放出藥物分子而發揮藥效。環糊精包合能將一種液體物質轉變成一種固體復合物并且固定芳香物質和揮發性物質。

環糊精包合物制備方法很多，有飽和水溶液法、研磨法、噴霧干

燥法、冷凍干燥法等，可根據環糊精和藥物的性質，結合實際生

產條件加以選用。藥物制成包合物后可增加藥物的穩定性，增加難溶性藥物的溶解度與溶出速度，提高藥物的生物利用度，掩蓋藥物的不良嗅味，降低藥物的刺激性，還可使液體藥物粉末化以便制劑，有些包合物還可作為緩釋和靶向制劑的藥物載體。

微型膠囊（簡稱微囊）是利用天然、半合成或合成的高分子

材料（通稱囊材），將固體或液體藥物（通稱囊心物）包裹而成

的微小膠囊。藥物微囊化后，穩定性增加，并

直徑5μm～250μｍ

呈固體粉末狀，可供制備散劑、膠囊劑、片劑、注射劑及軟膏劑

等使用。微囊的制備方法很多，可歸納為物理化學法、化學法及

物理機械法等。本次實驗采用物理化學法中的單凝聚法和復凝聚法。本實驗利用兩種具有相反電荷的高分子材料作囊材，將囊心物分散在囊材的水溶液中，在一定條件下，相反電荷的高分子材料互相交聯形成復合物后，溶解度降低，自溶液中凝聚析出成囊。本實驗所用阿拉伯膠帶負電，而A型明膠在等電點以上帶負電，等電點以下帶正電。如果將待包的藥物先與阿拉伯膠制成乳濁液

或混懸液，然后在一定溫度下與等量明膠溶液混合，用醋酸調在4.0-4.1左右，則明膠帶正電，與帶負電的阿拉伯膠相互凝聚而包

在藥物周圍，成為微囊。

三、實驗儀器與藥品

顯微鏡（10×40倍）、500燒杯、乳缽、溫度計、水浴、布氏漏斗、100量筒、10量筒、蒸發皿、阿拉伯膠、明膠、37%甲醛、10%醋酸、10%氫氧化鈉

四、實驗內容與操作

1.薄荷油β-環糊精包合物

【處方】β-環糊精4g

植物油1（28d）

蒸餾水50

【制法】稱取β－4g，置100錐形瓶中，加入蒸餾水50，加

熱溶解，降溫至50℃，精密滴加植物油1，恒溫攪拌2.5小時。冷藏24小時，待沉淀完全后過濾。用無水乙醇5分三次洗滌沉淀3次，至沉淀表面近無油漬，將包合物置干燥器中干燥，即得。

2.植物油微囊

【處方】

植物油1.0g10%醋酸適量

明膠2.5g20%氫氧化納液

適量

阿拉伯膠2.5g硬脂酸鎂適量

37%甲醛1.25蒸餾水適量

【制法】取阿拉伯膠2.5g，使溶于50蒸餾水中（60℃），加入植物油1.0g于組織搗碎機中乳化1分鐘。將之轉入500燒杯并放入50℃恒溫水浴鍋中。另取明膠2.5g，使溶于60℃50蒸餾水中。將明膠液在攪拌下加入上述乳濁液中，用10%的醋酸調4.1左右，顯微鏡下觀察見到油珠外層有一層薄薄的膜，即已成囊（此時囊形并不圓整，大小不一）。加入蒸餾水200（溫度應不低于30℃），不斷攪拌直到10℃以下。加入37%甲醛1.25（以蒸餾水1.25稀釋），攪拌15分鐘，用20％氫氧化鈉液調8～9，繼續攪拌冷卻半小時，除去懸浮的泡沫，濾過，用水洗滌至無甲醛臭，

中性即可。抽濾，加３％硬脂酸鎂制粒，過一號篩，于50℃烘干，即得。

五、注意事項

1．成囊時調節不要過高或過低，一般調至4.0左右，此時明膠全部帶正電荷。

2.攪拌速度要適宜。速度過快，囊膜易破壞，過慢則微囊易粘連。速度不一，則成囊大小不均勻。

3.加入甲醛使囊膜變性，用量多少直接影響變性程度。用10%氫氧化鈉調8。攪拌30，以增加甲醛與明膠的交聯作用，使凝膠的

網狀結構孔隙縮小。

六、思考題

1.制備包合物的關鍵是什么？

2.本實驗為什么選用β－環糊精為主分子？它有什么特點？

3．除飽和水溶液法外，制備包合物的方法還有哪些？

4．試舉例說明包合物在藥物制劑中的應用。

實驗七植物油/β-環糊精包合物的質量檢查

一、實驗目的

1．掌握β－環糊精包合物和微囊的質量檢測方法。

2．熟悉藥物溶出度的測定方法。

二、實驗原理

影響包合物的因素包括內因和外因。內因：主、客分子的大

小；客分子的極性。外因：溫度、附加劑、等。為獲得最佳制備

工藝，以包合物的收得率、包合物中藥物的含量為評價標準，幾

種質量評價方法：顯微鏡法和電鏡掃描法溶解度和溶出度法、紫外分光光度法、熒光光度法、紅外分光光譜法、差示熱分析法、

X射線衍射法、核磁共振法。通過比較包合前后紫外吸收光譜圖，根據吸收峰的位置和高度來判斷包合是否成功或包合前后主要

成分是否發生變化。

目前微囊的質量評價，除制成的制劑本身要求應符合藥典規

定外，還包括下述內容：（一）形態、粒徑及其分布，可采用光

學顯微鏡、掃描或電子顯微鏡觀察形態并提供照片。微囊形態應為圓整球形或橢圓形的封閉囊狀物，微球應為圓整球形或橢圓形的實體；（二）藥物的含量微囊、微球中藥物含量的測定一般采

用溶劑提取法。溶劑的選擇原則是：應使藥物最大限度地溶出而最小限度地溶解載體材料，溶劑本身也不應干擾測定。（三）藥物的載藥量與包封率，對于粉末狀微囊，先測定其含藥量后計算載藥量；對于混懸于液態介質中的微囊，先將其分離，分別測定

液體介質和微囊的含藥量后計算其載藥量和包封率。

三、實驗儀器與藥品

倍）、溶出儀

電子天平、顯微鏡（10×40

四、實驗內容

1.包合物質量檢查

（1）性狀包合物為白色干燥粉末，無明顯的植物油氣味。

（2）重量：稱量包合物的總質量，計算得率。

2.微囊的質量評價主要檢查膠囊內容物微膠囊的粒度分布、顯

微觀察、總油及表面油。

（1）微膠囊的顯微鏡觀察

一滴固化后的微膠囊溶液，將其放于載玻片上，用顯微鏡觀察并測量其粒徑大小。

（２）溶出度：量取200蒸餾水，注入每一個測定容器內，加熱使溶劑溫度保持在37℃±0.5℃，調整轉速使其穩定，取微囊試樣置于管內，然后進行測定。

實驗八金霉素鏈霉菌培養基的制備

一、實驗目的

1.學會鏈霉菌種子培養基和發酵培養基的配制；

2.掌握實驗室高壓濕熱滅菌的方法。

二、實驗原理

金霉素鏈霉菌（）亦稱“金色鏈霉菌”，放線菌門()，放線菌綱()，放線菌目()，鏈霉菌科()，鏈霉菌屬()。在固體培養基上產生金色色素，故名。其菌落為草帽型,菌落直徑一般為3～5毫米,表面較平坦,中間有隆起。菌落開始為白色，長孢子后變

青色。抗菌素工業上用以生產金霉素。

放線菌是一類介于細菌與真菌之間的單細胞微生物。放線菌

在土壤中分布最多，大多數生活在含水量較低、有機質豐富和微堿性的土壤中。多數情況下，泥土中散發出的“泥腥味”就是由

放線菌中鏈霉菌產生的土腥素造成的。放線菌大都好氧，屬于化能異養，菌絲纖細，分枝，常從一個中心向周圍輻射生長。因其

生長具輻射狀，故名放線菌。放線菌能像真菌那樣形成分枝菌絲，

并在菌絲末端產生外生的分生孢子，有些種類甚至形成孢子囊，

因而曾被誤認是真菌。但其菌落較小而致密，不易挑取。不少菌

種在醫藥、農業和工業上廣泛應用，可產生抗菌素，現已發現和

分離出的由放線菌產生的抗生素多達4000多種，其中，有50多種抗生素已經廣泛地得到應用，如鏈霉素、紅霉素、土霉素、

四環素、金霉素、卡那霉素、氯霉素等用于臨床治療人的多種疾

病；有些可生產蛋白酶、葡萄糖異構酶；有的用于農業生產，如

滅瘟素、井岡霉素、慶豐霉素等。

四環素類抗生素是由鏈霉菌生產或經半合成制取的一類廣譜

抗生素。抗菌譜極廣，包括革蘭氏陽性和陰性菌、立克次體、衣

原體、支原體和螺旋體。品種主要包括金霉素、四環素和土霉素。三、實驗材料與器材

1移液槍、鋁鍋、電爐母液（0.1g／）、母液（0.1g／）、促進劑母液（2.5／）

四、實驗步驟

1．種子培養基

種子培養基(g／L)：可溶性淀粉40，黃豆餅粉20，酵母粉5，

240.25。

蛋白胨5，34，(4)243，4·7H2O0.25，

先稱取黃豆餅粉20g，單獨煮沸10分鐘，加入少量涼水降溫，

4層紗布壓榨取汁，與其它稱好的各成分混合，定容至1L。

每50分裝到250三角瓶中，每組2瓶。

2．定向發酵培養基

發酵培養基(g／L)：可溶性淀粉100，黃豆餅粉40，蛋白胨15，35，酵母粉2.5，(4)243，4·7H2O0.25，α—淀粉酶0.1。

配制方法同種子培養基，配好后分裝到500三角瓶中，每瓶100，分別加入如下成分，比較它們對四環素產量的影響：對照(不加其他成分)；

加入母液至終濃度為2g／L；

加入母液至終濃度為2g／L；

加入母液至終濃度為2g／L及促進劑母液至終濃度為0.025g／L。

每組各配一瓶。

3．滅菌

將封好口的培養基121℃滅菌30。同時滅1剪口移液槍頭。

（總過程：稱量——溶化——定容——分裝——封口——滅

菌）

五、注意事項

1．黃豆餅粉煮沸取汁。

2．培養基封口最好用8層紗布或棉花塞，最好不用橡膠塞，以

增加透氣性。

3．滅菌時鍋內要補足水分。由于滅菌鍋較大，升溫排氣一定要

充分（10）。

六、補充閱讀

工業發酵中利用生產菌發酵得出最終產物是一個逐級放大的

過程，各個不同的階段對于營養成分的要求也各有特點，根據發酵不同階段的要求，培養基可分為孢子培養基、種子培養基和發酵培養基三種。

孢子培養基孢子培養基是供菌種繁殖孢子的一種常用固體培

養基，對這種培養基的要求是能使菌體迅速生長，產生較多優質的孢子，并要求這種培養基不易引起菌種發生變異。所以對孢子培養基的基本配制要求是：第一，營養不要太豐富（特別是有機

氮源），否則不易產孢子。如灰色鏈霉在葡萄糖－硝酸鹽－其它

鹽類的培養基上都能很好地生長和產孢子，但若加入0.5%酵母膏或酪蛋白后，就只長菌絲而不長孢子。第二，所用無機鹽的濃

度要適量，不然也會影響孢子量和孢子顏色。第三，要注意孢子

培養基的和濕度。生產上常用的孢子培養基有：麩皮培養基、小

米培養基、大米培養基、玉米碎屑培養基和用葡萄糖、蛋白胨、

牛肉膏和食鹽等配制成的瓊脂斜面培養基。大米和小米常用作霉菌孢子培養基，因為它們含氮量少，疏松、表面積大，所以是較

好孢子培養基。

種子培養基種子培養基是供孢子發芽、生長和大量繁殖菌絲

體，并使菌體長得粗壯，成為活力強的“種子”。所以種子培養

基的營養成分要求比較豐富和完全，氮源和維生素的含量也要高

些，但總濃度以略稀薄為好，這樣可達到較高的溶解氧，供大量

菌體生長繁殖。種子培養基的成分要考慮在微生物代謝過程中能

維持穩定的，其組成還要根據不同菌種的生理特征而定。一般種子培養基都用營養豐富而完全的天然有機氮源，因為有些氨基酸能刺激孢子發芽。但無機氮源容易利用，有利于菌體迅速生長，

所以在種子培養基中常包括有機及無機氮源。最后一級的種子培養基的成分最好能較接近發酵培養基，這樣可使種子進入發酵培養基后能迅速適應，快速生長。

發酵培養基發酵培養基是供菌種生長、繁殖和合成產物之用。它既要使種子接種后能迅速生長，達到一定的菌絲濃度，又要使長好的菌體能迅速合成需產物。因此，發酵培養基的組成除有菌體生長所必需的元素和化合物外，還要有產物所需的特定元素、

前體和促進劑等。但若因生長和生物合成產物需要的總的碳源、

氮源、磷源等的濃度太高，或生長和合成兩階段各需的最佳條件

要求不同時，則可考慮培養基用分批補料來加以滿足。

實驗九金霉素鏈霉菌的定向發酵

一、實驗目的

1.學習和掌握無菌操作技術。

2.掌握定向發酵四環素的原理。

二、實驗原理

定向發酵是指通過改變培養基組分(加入某些物質)改變微生

物代謝途徑，使發酵按主觀要求產生較多的產物。

金霉素、四環素和土霉素，它們的化學結構極為相似：

R1R2

金霉素H

土霉素H

四環素HH

金霉菌原是產生金霉素（）的菌種，但因金霉素比四環素只

多一個氯離子，所以只要在發酵液中加入某些物質，阻止氯離子進入四環素分子，從而使菌種產生較多的四環素。另外，金色鏈

霉菌在30℃以下時，合成的能力較強；當溫度超過35℃時則只合成。

本實驗中，利用溴離子在生物合成過程中對氯離子有競爭性

抑制劑作用的原理，以及加入2-硫醇基苯并噻唑(即促進劑，分子式：C7H52，通常作為橡膠硫化促進劑)抑制氯化酶的作用，從而增加四環素的產量。

三、實驗材料和試劑

金霉素鏈霉菌（購于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微

生物中心）、促進劑、麩皮、K24、4·7H2O、（4）24、瓊脂

四、實驗步驟

1.配制斜面培養基

（4）243g，（1）麩皮36.0g，K240.2g，4·7H2O0.1g，

瓊脂15～20g，定容至1L，7。

（2）可溶性淀粉20g，31g，K240.5g，4·7H2O0.5g，0.5g，4·7H2O0.01g，定容至1L，7.2~7.5。

2.制備斜面孢子：將保藏的菌種接種于液體培養基中（不加瓊

脂的斜面培養基），28℃下

200振蕩培養，將活化1d后的金霉

5～7天，待孢子長成灰素鏈霉菌種接入斜面培養基，28℃培養

色，于4℃冰箱中保藏。

3.種子培養：將在斜面上生長良好的菌體用接種鏟挑取12左右接入裝有50四環素種子培養基的250錐形瓶中，230、28℃下振蕩培養20～24h。

4.發酵培養：以剪口移液槍頭取10種子液接入裝有100發酵培養液的500錐形瓶中，230、28℃下振蕩培養5d。用于后面的測定效價和薄層層析實驗。

實驗十四環素、金霉素的薄層層析鑒定

一、實驗目的

掌握薄層層析的原理，四環素族抗生素的定性鑒定方法

二、實驗原理

層析（色譜，）是相當重要、且相當常見的一種技術，在把

微細分散的固體或是附著于固體表面的液體作為固定相，把液體（與上述液體不相混合的）或氣體作為移動相的系統中（根據移動相種類的不同，分為液相層析和氣相層析二種），使試料混合

物中的各成分邊保持向兩相分布的平衡狀態邊移動，利用各成分對固定相親和力不同所引起的移動速度差，將它們彼此分離開的定性與定量分析方法，稱為層析，亦稱色譜法。用作固定相的有

硅膠、、氧化鋁、離子交換樹脂、離子交換纖維等，或是在硅藻

土和纖維素那樣的無活性的載體上附著適當的液體。將作為固定相的微細粉末狀物質裝入細長形圓筒中進行的層析稱為柱層析（），在玻璃板上涂上一層薄而均的支持物（硅膠、纖維素和

淀粉等）作為固定相的稱為薄層層析（），或者用濾紙作為固定相的紙上層析。層析根據固定相與溶質（試料）間親和力的差

異分為吸附型、分配型、離子交換型層析等三種類型。但這并不

是很嚴格的，有時常見到其中間類型。此外，近來也應用親和層析，即將與基質類似的化合物（通常為共價鍵）結合到固定相上，再利用其特異的親和性沉淀與其對應的特定的酶或蛋白質。

分配層析在支持物上形成部分互溶的兩相系統。一般是水相

和有機溶劑相。常用支持物是硅膠、纖維素和淀粉等親水物質，

這些物質能儲留相當量的水。被分離物質在兩相中都能溶解，但分配系數不同，展層時就會形成以不同速度向前移動的區帶。一種溶質在兩種互不混溶的溶劑系統中分配時，在一定溫度下達到

平衡后，溶質在固定相和流動相溶劑中的濃度之比為一常數，稱為分配系數。當欲被分離的各種物質在固定相和流動相中的分配

系數不同時，它們就能被分離開。分配系數大的移動快（阻力小）。

薄層層析是以薄層材料為支持物，在密閉容器中，樣品在其

上展開。當斑點不易為肉眼觀察時，可利用適當的顯色劑，或通

過紫外燈下產生熒光的方法進行觀察。通過這種展開操作，各成分呈斑點狀移動到各自的位置上，再根據值的測定進行鑒定。薄層色譜法具有分離與鑒定的雙重功能，通過薄層圖譜與對照品的

圖譜相比較，除了能鑒出有效成分或特征成分外，還以完整的色譜圖作為一個整體對制劑加以鑒別。薄層色譜分析法由于簡便、

快速，能有效地、直觀地反映藥品地真實性、穩定性，現已成為

藥物制劑的鑒別和質量控制的行之有效的方法之一。薄層層析是鑒別抗生素的方法之一，層析后進行顯色，并繪制層析圖譜，根

據層析圖譜對抗生素進行鑒定。本實驗以四環素、金霉素標準品溶液作為對照對發酵液進行鑒定。

三、實驗儀器和設備

玻璃層析缸、層析板、毛細玻璃管或微量注射器、紫外投射儀、四環素、金霉素標準品、正丁醇、醋酸、凡士林

四、實驗步驟

1．層析板處理

層析板105℃烘烤過夜，均勻噴上0.1磷酸鹽緩沖液(4.5)，于空氣中晾干、備用。

2．點樣

選取兩種定向發酵液約1于1.5離心管中，10000，5，備用。

在距層析板底邊2.5~3起始線上(用鉛筆劃線，做出點樣點記號)，用毛細玻璃管在薄層層析板上點四環素標準品和金霉素標準品

溶液3次，發酵液上清點8～10次，點樣點不大于0.4，每次都

要吹干后再點。（一般效價在1000u／以上點3次，500～1000u／點4次，200～500u／點5次）。

3.層析（展開）

用正丁醇：醋酸：水(4∶1∶5)的上相作展開劑。層析前需預先用展開劑預平衡層析缸，可在缸中倒入2高的展開劑，密閉，

一般保持15－30分鐘。然后將層析板置于盛有展開劑的層析缸

中，在室溫下展層6～8h（與溫度有關）。封口不嚴可涂抹凡士

林。

4．熒光顯影

待溶劑前沿展至板的一半以上時將層析板取出，標出溶劑前

沿，于通風櫥中晾干，用氨水熏數秒鐘后即可在紫外燈下顯影，

畫出黃色斑點，分別算出值。（四環素標準品慢和金霉素標準品

快）

無水四環素在波長365下顯黃色熒光，根據與標準對照可定

性測定。

五、注意事項

1.要控制好點樣量，樣品太少，斑點不清楚，難以觀察，但樣

品量太多時往往出現斑點太大或拖尾現象。

2.若因樣品溶液太稀，可重復點樣，但應待前次點樣的溶劑揮

發后方可重新點樣，以防樣點過大，造成拖尾、擴散等現象，而

影響分離效果。

3.點樣時必須注意勿損傷薄層表面。

4.作展開劑中極少量強極性溶劑(0.5％)或值的改變可顯著改善拖尾現象。

實驗十一四環素效價測定

一、實驗目的：

1.了解抗生素效價的表示方法

2.學習抗生素的測定方法

二、實驗原理：

實驗利用比色法測定四環素和金霉素的效價。效價(或)是評價抗生素效能的標準，它代表抗生素對微生物的抗菌效力，也是衡量發酵液中抗生素含量的尺度，人們以1μｇ金霉素或四環素標準品為1個單位，0.6μｇ

青霉素G鈉鹽為1個單位。

四環素和金霉素在酸性條件下，加熱，可產生黃色的脫水金

霉素和脫水四環素，其色度與含量成正比。

在堿性條件下，四環素較穩定，而金霉素則生成無色的異金

霉素：

根據上述原理，可以在酸性條件下，利用比色法測定四環素、金霉素混合液的總效價；而四環素效價的測定可在堿性條件下，

使金霉素生成無色的異金霉素，然后再在酸性條件下，使四環素生成黃色的脫水四環素，經比色測得四環素效價。總效價與四環素效價二者之差即為金霉素的效價。本實驗只測定四環素的效價。

發酵液中，由于雜質的干擾，將影響比色的正確性，因此加

入乙二胺四乙酸二鈉鹽()作為螯合劑，掩飾金屬離子的干擾，改

變四環素脫水條件(降低酸度或延長加熱時間)，可以減少雜質對比色反應的干擾。

三、實驗步驟

取各定向發酵液10于50容量瓶中，加入l濃度為／l00溶液，

加蒸餾水5，再加入5濃度為3／L的，在20~25℃下保溫15后，加入5濃度為6／L的，水浴煮沸15后，冷卻，稀釋至刻度，在分光光度計上于380處測定其吸光度值。

對照樣品（不加誘導劑）的前處理方法與上述步驟一樣，只是在加入后，不加熱，稀釋至刻度，作為測定樣品的空白對照,調

零。

四環素標準品（1000）取1于50容量瓶中，加1濃度為6／L的，水浴煮沸15后，冷卻，稀釋至

50，380測吸光度。（以蒸餾水作為空白測定）

以定向發酵培養基中的對照組作為空白對照，測定其它三個處理組的吸光度。（有時可能因對照組處理不當而使其它組的讀數為負值，這時可以以蒸餾水作為空白。）計算公式：

發酵液A

發

酵

中

四

環

素的效價=A

四

環

素

標

準

實驗十二

人參細胞培養與人參皂苷提取

一、實驗目的1.掌握人參皂甙的提取、精制方法，進一步鞏固和熟悉人參皂甙的性質。

2.熟悉和掌握人參皂甙的水解條件和方法。

3.熟悉和掌握柱層析分離人參皂甙元的原理方法及基本操作技術。

二、實驗原理

人參的主要成分為人參皂苷，總皂苷含量約4％，人參皂苷大多數是白色無定形粉末或無色結晶，味微甘苦，具有吸濕性。

人參皂苷易溶于水，甲醇、乙醇，可溶于正丁醇、乙酸、乙酸乙

酯，不溶于乙醚、苯等親脂性有機溶劑。水溶液經振搖后可產生

大量的泡沫。人參總皂苷無溶血作用，分離后，B型和c型人參皂苷有顯著的溶血作用，而A型人參皂苷有抗溶血作用。

人參中除含有皂苷外，還含有脂溶性成分如揮發油，脂肪、

甾體化合物及大量的糖類等，這些類成分對人參皂苷的分離和精

制有干擾，所以必須除去，方可得到純度較高的皂苷。

人參皂甙元與多個分子糖結合成甙，具有較強的親水性，易溶于水和低級醇類，實驗室采用熱水提取人參皂甙，提取液加堿（）

除雜。再用酸調至