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定設計性實驗方案^、綜述：淀粉酶是淀粉降解酶。它們廣泛存在于微生物、植物和動物體中。它們將淀粉及相關的聚合物分解為帶有具體淀粉分解酶特征的產品。淀粉酶廣泛存在于動植物和微生物中，是最早用于工業生產并且迄今仍是用途最廣、產量最大的酶制劑產品之一。淀粉酶種類繁多，特點各異,可應用于造紙、印染、釀造、果汁和食品加工、醫藥、洗滌劑、工業副產品及廢料的處理、青貯飼料及微生態制劑］等多種領域。在釀造發酵工業如酒精生產、啤酒制造、發酵原料液化及糖化工藝過程中均有重要價值，如添加淀粉酶分布非常廣泛，是人們經常研究的一種酶。從紡織工業到廢水處理，這些酶都有不同規模的應用【1】。常見產淀粉酶的主要為芽孢桿菌屬。其中的常見產淀粉酶的芽孢桿菌菌種有：地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌和納豆芽孢桿菌【2】、凝結芽孢【3】。由于芽孢桿菌屬是一類好氧或兼性厭氧、產生抗逆性內生抱子的桿狀細菌，許多為腐生菌，主要分布于土壤和植物體表面及水體中【4】。所以此次實驗從土壤中分離產淀粉酶的芽孢桿菌。二、 實驗目的要求了解生物分離提純的原理和方法技術掌握從土壤中篩選產淀粉酶菌株的原理和方法掌握微生物搖瓶培養方法及淀粉酶活力測定的原理和方法培養學生的綜合應用微生物實驗方法的能力培養學生自行設計實驗流程、綜合分析問題解決問題和判斷實驗結果的能力。三、 實驗原理自然界中，土壤是微生物生活最適宜的環境。土壤具有微生物進行生長繁殖和生命活動中所需的各種條件。土壤中微生物的數量因土壤類型、季節、土層深度與層次等不同而異。一般地說，在土壤表面，由于日光照射及干燥等因素的影響，微生物不易生存，離地表10cm?30cm的土層中菌數最多，隨土層加深，菌的數量減少【5】。從混雜微生物群體中獲得只含有某一種或某一株微生物的過程稱為微生物分離與純化。平板分離法普遍用于微生物的分離與純化。其基本原理是選擇適合與待分離微生物的生長條件，如營養成分、酸堿度、溫度和氧等要求，或加入某種抑制劑造成只利于該微生物生長，而抑制其他微生物生長的環境，從而淘汰一些不需要的微生物。值得指出的是，從微生物群體中經分離生長在平板上的單個菌落并不一定保證是純培養。因此，純培養的確定除觀察其菌落特征外，還要結合顯微鏡檢測個體形態特征后才能確定，有些微生物的純培養要經過一系列分離與純化過程和多種特征鑒定才能得到。芽孢桿菌屬的共同特征是：革蘭氏陽性；接觸酶陽性；水解淀粉；VP試驗陽性；不產生吲噪；苯甲氨酸不脫氨；分解酪素；不分解酪氨酸；不產生二羥丙酮；營養體的最高生長溫度大約從25°C到75°C以上；最低生長溫度大約5°C到45C；生長最低pH值，從7.5—8到2左右；耐鹽范圍從低于2%的NaCl到25%NaCl；營養明膠（22C）7天內液化1厘米或1厘米以上。枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌在糖發酵試驗用阿拉伯糖，木糖和甘露糖代替葡萄糖可產酸；作為營養生長的最低限培養基是無維生素的，但含有葡萄糖、檸檬酸鹽和一個氨態鹽作為唯一的碳源和氮源【6】。細菌特性繁殖快速:代謝快、繁殖快，四小時增殖10萬倍，標準菌四小時僅可繁殖6倍。生命力強:無濕狀態可耐低溫-60C、耐高溫+280C，耐強酸、耐強堿、抗菌消毒、耐高氧（嗜氧繁殖）、耐低氧（厭氧繁殖）。體積大:體積比一般病源菌分子大四倍數，占據空間優勢，抑制有害菌的生長繁殖。四、實驗材料和用具4.1土樣采集：采集廣大植物園內的有機土壤，和生化樓下花壇的有機土壤4.2營養瓊脂（%）:蛋白胨1牛肉膏0.3氯化鈉0.5瓊脂1.5?2.0蒸餾水將除瓊脂以外的各成分溶解于蒸餾水內，加入15%氫氧化鈉溶液約2mL，校正pH至7.2?7.4。加入瓊脂，加熱煮沸，使瓊脂溶化。4.3淀粉牛肉膏蛋白胨培養基（%）:可溶性淀粉0.2牛肉0.3蛋白1.0氯化鈉0.5瓊脂1.5?2.0校正pH至7.2?7.44.4發酵培養基（%）:玉米粉2黃豆餅粉1.5CaCl0.02MgSO40.02NaCl0.25K2HPO40.2檸檬酸鈉0.2硫酸氨0.075（溶解后加）Na2HPO40.2校正pH值7.04.5葡萄糖蛋白胨培養基（V.P試驗用）（%）:葡萄糖0.5蛋白胨0.5K2HPO40.2校正pH7.2?7.44.6蛋白胨水培養基（吲噪試驗用）（%）:蛋白胨1%氯化鈉0.5%校正pH7.2?7.44.7西蒙氏檸檬酸鹽培養基（%）:氯化鈉0.5硫酸鎂（MgSO4?7H2O）0.02磷酸二氫銨0.1磷酸氫二鉀0.1檸檬酸0.5瓊脂2漠麝香草酚藍溶液4酚紅試劑校正pH6.8先將鹽類溶解于水中，校正pH，再加入瓊脂，加熱融化，然后加入指示劑，混勻后分裝試管，121°C高溫滅菌15min。4.8配制營養明膠培養基（%）:蛋白胨0.5、牛肉膏0.3、明膠1.2，調pH6.8~7.04.9耐鹽培養基（%）:=1\*GB3①蛋白胨1牛肉膏0.3氯化鈉2瓊脂1.5?2.0蒸餾水=2\*GB3②蛋白胨1牛肉膏0.3氯化鈉10瓊脂1.5?2.0蒸餾水=3\*GB3③蛋白胨1牛肉膏0.3氯化鈉20瓊脂1.5?2.0蒸餾水=4\*GB3④蛋白胨1牛肉膏0.3氯化鈉25瓊脂1.5?2.0蒸餾水加入15%氫氧化鈉溶液約2mL,校正pH至7.2?7.4。加入瓊脂,加熱煮沸，使瓊脂溶化。4.10溶液或試劑染料革蘭氏染色：草酸銨結晶紫染色液、盧戈氏碘液、95%乙醇；芽孢染色：5%孔雀綠溶液，石炭酸復紅液；香柏油、二甲苯吲噪試驗：乙醚、吲噪試劑V.P.試驗：40%NaOH溶液、a-奈酚，淀粉酶活力測定：1%3,5-二硝基水楊酸試劑4.11儀器或其它用具無菌玻璃涂棒無菌吸管接種環無菌培養皿土樣三角瓶燒杯洗瓶玻棒試管酒精燈擦鏡紙接種環酒精燈載玻片吸水紙等。恒溫搖床恒溫培養箱高壓蒸汽滅菌箱超凈工作臺水浴箱紫外燈照射箱磁力攪拌器玻璃珠移液管涂布器顯微鏡五、實驗方法及步驟1、初篩方法制菌懸液：兩個土樣分別取5g，放入各自裝有45mL無菌水的三角瓶，振蕩10min,即為稀釋10-1的土壤懸浮液。每個環境的土樣裝1個錐形瓶，共2個，同時將其分為4組，編號AB。加熱篩選有芽孢的菌：將2個錐形瓶加塞、包扎、搖勻（無菌室里），利用恒溫水浴裝置100°C左右水浴，水浴鍋溫度恒定后維持15min（制懸液時就應先開始加熱），制成10-1g/ml的土壤懸液梯度稀釋菌懸液：再分別另取裝有9mL無菌水試管5支，用記號筆編上10-2、10-3、10-4、10-5。取已稀釋成10-1土壤液，振蕩后靜止0.5min，用無菌的移液器吸取1mL土壤懸液加入10-2的無菌水的試管中，并在試管內輕輕反復吹吸數次，使之充分混勻，即成10-2土壤稀釋液。同法從10-2的試管中吸取1mL稀釋液加入編號為10-3的無菌水試管中，混勻后即為10-3土壤稀釋液，依次連續稀釋為10-4、10-5土壤稀釋液。在土壤稀釋過程中，用相同的移液槍頭由濃到稀來稀釋。涂布平板用一支新的無菌槍頭，由低濃度開始，從各濃度土壤稀釋液中各吸取100ul，對號較均勻地放入已寫好稀釋度的牛肉膏蛋白胨培養基平板上，用灼燒冷卻后的無菌玻璃涂棒涂勻。每個濃度做3個平板（重復）°37°C下恒溫培養24h。2、 復篩方法【1】劃線接種（分區劃線法）：在上述不同稀釋度培養基中挑取不同形態的單菌落進行分區劃線，先在平板培養基的一邊作第1次平行劃線3~4條，再轉動培養皿約60。角，并將接種環上剩余物燒掉，待冷卻后通過第1次劃線部分作第2次平行劃線，再用同法通過第2次平行劃線部分作第3次平行劃線和通過第3次平行劃線部分作第4次平行劃線（如右圖）。劃線完畢，蓋上皿蓋，倒置于28~29°C溫室中培養約20h.。再繼續分區劃線2-3次，以獲得較純的菌種。將純化得到的單菌落分為兩部分，其中一部分接種到培養基內，用以保存菌種，另一部分用來做染色實驗。3、 獲得產淀粉酶芽孢桿菌純種：上述劃線接種后的菌落中各挑取形態特征不一致的點接于倒好的淀粉牛肉膏培養基中，一個土樣取8個平板兩兩標記同一位置同序號標記，一平板分5個區域，點接重復兩次，在37C培養箱中培養24h。上述點接后的平板中取出一組四個分好區域的淀粉牛肉膏培養基平板于實驗室，其他置于無菌室。實驗室里，四個平板均加入碘液，立即觀察記錄陽性和陰性菌落所在位置，并可同時記錄透明圈的大小。根據所記錄的陽性菌的編號，利用另一組中的營養瓊脂平板上其對應的菌落繼續劃線接種，培養后將出現的形態特征不一致的菌落進行編號，然后挑取部分出來進行革蘭氏染色鏡檢，若發現視野內出現形態、大小、顏色一致且為桿菌的菌體，則將其對應的菌種劃線接種到新的營養瓊脂平板上，標記，37°C下培養24h。否則繼續進行劃線分離，培養后再經革蘭氏染色鏡檢直至得到純種桿菌后進行芽孢染色。篩選出芽孢純種后進行斜面接種。革蘭氏染色步驟：涂片、干燥及固定初染：在做好的涂面上滴加草酸銨結晶紫染液，染1分鐘，傾去染液，流水沖洗至無紫色。媒染：先用新配的路哥氏碘液沖去殘水，而后用其覆蓋涂面1分鐘，后水洗。脫色：除去殘水后，滴加95%酒精進行脫色約15—20秒，后立即用流水沖洗。復染：滴加番紅染色液，染3—5分鐘，水洗后用吸水紙吸干。鏡檢：油鏡觀察染色結果。芽孢染色染色鏡檢：?取37C培養18?24h的枯草芽孢桿菌涂片，干燥，固定。?于涂片上滴人3?5滴5%孔雀綠水溶液。?用試管夾夾住載玻片在火焰上用微火加熱，自載玻片上出現蒸汽時，開始計算時間約4?5min。加熱過程中切勿使染料蒸干，必要時可添加少許染料。?傾去染液，待玻片冷卻后，水沖洗至孔雀綠不再褪色為止。?用石炭酸復紅液復染lmin，水洗。?制片干燥后用油鏡觀察。芽孢呈綠色，菌體紅色。（注：觀察芽孢的形狀和位置，查伯杰細菌手冊）斜面保存菌種?貼標簽取各種無菌斜面試管數支，將注有菌株名稱和接種日期的標簽貼上，貼在試管斜面的正上方，距試管口2?3cm處。（每種菌接3管，標上相同編號也要與平板上菌落編號相對應）。進行斜面接種操作，加塞、包扎好到37°C培養箱里培養24h。5、菌種的鑒定5.1所得的斜面菌種接種到新的平板上培養以觀察篩選出的產淀粉酶芽孢桿菌菌落的大小、顏色、干濕情況、形態、高度、透明程度、邊緣、是否易被挑起、氣味等。然后進行一系列的鏡檢一一革蘭氏染色、芽孢染色（具體步驟同上）觀察是否符合附表中芽孢桿菌的指標5.2生理生化試驗溫度對菌種培養的影響；淀粉水解試驗；溫度對菌種的影響；明膠液化試驗；糖發酵試驗；乙酰甲基甲醇試驗（V.P試驗）；吲噪試驗；耐鹽性試驗；檸檬酸鹽利用試驗。?溫度對微生物生長的影響將牛肉膏蛋白胨培養基熔化倒平板。（培養基厚度為一般培養基的1.5到2倍）取30套牛肉膏蛋白胨平板，分別進行標號。 在上述各平板中分別劃線接種不同的菌種，每個菌種重復接種六個平板。各取每個菌種兩套平板倒置于4C（冰箱）、37C（或者室溫），60C下保溫培養24小時，觀察細菌的生長狀況。（“一”不生長，"+”生長較差， "++”生長一般，"+++”生長良好。?淀粉水解實驗以18-24h的純培養物，涂布接種于淀粉瓊脂斜面或平板（一個平板可分區劃"+“字接種，）或直接移種于淀粉肉湯中，于36±1C培養24-48h，或于20C培養5天。然后將碘試劑直接滴浸于培養表面，若為液體培養物，則加數滴碘試劑于試管中。立即檢視結果，陽性反應（淀粉被分解）為瓊脂培養基呈深藍色、菌落或培養物周圍出現無色透明環、或肉湯顏色無變化。陰性反應則無透明環或肉湯呈深藍色。淀粉水解系逐步進行的過程，因而試驗結果與菌種產生淀粉酶的能力、培養時間，培養基含有淀粉量和pH等均有一定關系。培養基pH必須為中性或微酸性，以pH7.2最適。淀粉瓊脂平板不宜保存于冰箱，因而以臨用時制備為妥。?糖類發酵試驗（葡萄糖、木糖和乳糖發酵）用小砂輪輕輕切割發酵管沒有標簽和標識的另外一端，注意保留標簽和糖的名稱。用接種針將各種桿菌分別接種于兩種發酵管內，每種發酵管重復兩次，標記，要與斜面菌種標記相對應。兩種發酵管各設一支不接種，作為空白對照。注意接種的整個過程中，不能人為的制造氣泡，若發酵管內有氣泡，則輕輕甩動發酵管直至氣泡消失。若氣泡不能退去，則該管作廢應重做一管。接種后，每一管外包一層無菌紙，以防污染。接種完畢后，將全部發酵管倒置于干凈小燒杯內，37°C培養24h。觀察記錄：與對照管比較，若接種培養液保持原有顏色，其反應結果為陰性，表明該菌不能利用該種糖，記錄用“一”表示；如培養液呈黃色，反應結果為陽性，表明該菌能分解該種糖產酸，記錄用“+”表示。培養液中的杜氏小管內有氣泡為陽性反應，表明該菌分解糖能產酸并產氣，記錄用“+”表示；如杜氏小管內沒有氣泡為陰性反應，記錄用“一”。?乙酰甲基甲醇試驗（V.P試驗）標記試管：取裝有葡萄糖蛋白胨培養液的試管，編號。接種培養以無菌操作分別接種少量菌苔至以上相應試管中，空白對照管不接菌，置37C恒溫箱中，培養24h。觀察記錄取出以上試管，充分振蕩2min。每管分別加入40%Na0H溶液10?20滴，并加等量a-奈酚，振蕩試管，以使空氣中的氧溶入，置37C恒溫箱中保溫15?30min后，若培養液呈紅色，記錄為V.P.試驗陽性反應（用“+”表示）；若不呈紅