1、文檔編碼 : CS1E10B6G9J3 HC7F10L1M7H2 ZZ6H1V5U9E2細胞培養(yǎng)板的選擇與常見問題解答 細胞培養(yǎng)板依底部形狀的不同可分為平底和圓底（U 型和 V 型）；培養(yǎng)孔的孔數(shù) 有 6、12、24、48、96、384、1536 孔等；依據(jù)材質(zhì)的不同有 Terasaki板和一般細胞培養(yǎng)板； 具體選擇時依據(jù)培養(yǎng)細胞的類型、而定；所需培養(yǎng)體積及不同的試驗?zāi)康模?）平底和圓底（ U 型和 V 型）培養(yǎng)板的區(qū)分和選擇：貼壁細胞一般用平底培養(yǎng)板；懸浮型細胞的培養(yǎng)一般用 V 型；U 型培養(yǎng)板亦多用于培養(yǎng)懸浮型細胞 驗；V 型培養(yǎng)板有時用做免疫學血凝集的實不同型狀的板子自然有不同用途； 平

2、底的什么類型的細胞都可用 但當細胞數(shù)目較少 如做克隆時 就用 96 孔平底板 另外 做 MTT 等試驗時 無論貼壁和懸浮細胞 一般均用平底板； 至于 U 或 V 型板 一般在某些特殊要求時才使用；如在免疫學方面 當做兩種不同淋巴細胞混合培養(yǎng)時 需要二者相互接觸以刺激 因此 一般需要 U 型板 因細胞會由于重力的作用而集合在一個很小的范圍內(nèi)；V 型板的用途更少 一般用于細胞殺傷試驗時 為了使效靶細胞緊密接觸 常使用 V 型板 但這種試驗也可用 是養(yǎng)細胞的話, 通常是選用平底的,TC Treated就是養(yǎng)細胞用的；U 型板替代 加入細胞后 低速離心 假如另外要特殊留意材質(zhì),標示Tissue Cul

3、ture 圓底的好像沒聽說過拿來養(yǎng)細胞；圓底的通常是拿來做分析,化學反應(yīng),或是儲存樣品用的,由于圓底比較好將液體吸得干凈,假如用平底的就不好吸了；不過, 假如你是要測吸光值的話,確定要買平底的才行； 大部分細胞培養(yǎng)都用平底培養(yǎng)板,便于鏡下觀測、有明確的底面積、細胞培養(yǎng)液面高度相對一樣,仍 便于 MTT 檢測；圓底培養(yǎng)板主要用于同位素摻入的試驗,需要用細胞收集儀收 集細胞的培養(yǎng),如“ 混合淋巴細胞培養(yǎng)” 等；（2）細胞培養(yǎng)常見問題與解答問：我看到培養(yǎng)板有4、6、12、24、48、96 孔幾種規(guī)格,但不知道到底什么實驗用哪種規(guī)格；答：要依據(jù)你具體的試驗要求,流式一般用 一般用 24 孔等,要具體依

4、據(jù)你試驗來定；6 孔,MTT 一般用 96 孔,細胞爬片問：請問哪位高手知道 Terasaki 板是什么培養(yǎng)板,與一般細胞培養(yǎng)板有什么區(qū)別？答：Terasaki plate主要是用于晶體學爭論,產(chǎn)品設(shè)計便于對晶體的觀看與結(jié)構(gòu)分析；有兩種 sitting 和 handing drop兩種方法, 兩種方法應(yīng)用產(chǎn)品的形狀結(jié)構(gòu)也不同；材料上選擇 crystal class polymer ,特殊的材料有利觀看晶體結(jié)構(gòu)；細胞培養(yǎng)板主要是 PS 材料；材料是 treated sufface；便于細胞貼壁生長與伸展；當然仍有浮游細胞的生長材料,同時仍有 料上的應(yīng)用與對材料的選擇；low binding su

5、rface,有關(guān)更多試驗材問：我想測吸光度用酶標儀,用多孔細胞培養(yǎng)板行嗎？請問酶標板 多孔細胞培養(yǎng)板有什么區(qū)分？答：用多空細胞培養(yǎng)板測吸光度確定可以拉,和 MTT 檢測；我們經(jīng)常用它來做樣品的蛋白定量區(qū)分：酶標板一般要比細胞培養(yǎng)板貴,細胞板主要做細胞培養(yǎng), 但也可以用來測蛋白濃度； 酶標板包括包被板和反應(yīng)板,一般不能用做細胞培養(yǎng), 它主要做免疫酶聯(lián)反應(yīng)后的蛋白檢測, 它需要更高的要求仍需要特定的酶標工作液；常用不同培養(yǎng)板的孔底面積及舉薦加液量：不同孔板所加培養(yǎng)液的液面都不宜太深,一般在 2-3mm 范疇,結(jié)合不同孔的底面積就可算出各培養(yǎng)孔的適宜加液量；如加液量過多會影響氣體（氧氣）交換,而且在

6、搬動過程中易溢出造成污染；具體所加細胞密度依試驗的目的不同靈敏把握；3細胞培養(yǎng)板的密閉和污染問題細胞培養(yǎng)板的加樣和操作： 細胞培養(yǎng)板在進行細胞操作時同樣遵循嚴格無菌的原就,各項操作要保證規(guī)范、科學,不對細胞的生長造成額外的影響；這其中最常見的問題就是如何保證加樣后細胞的均勻和盡量削減換液對細胞生長狀態(tài)的影響；問： 96,24 孔培養(yǎng)板或培養(yǎng)皿的蓋子都很松,這樣是便利了透氣,但是細菌、霉菌等污染物會不會也隨著溜進去呢？答：1.蓋子很松,屬于半開放培養(yǎng),這樣的目的是透氣（實際上是為了使培養(yǎng)皿外的 co2 能夠與培養(yǎng)皿充分交換,保護培養(yǎng)基的 pH 值）；2.凡事有利必有弊,這樣當然增加了污染的可能性

7、；此外這樣仍會使培養(yǎng)皿內(nèi)的液體蒸發(fā), 這對于精確定量的藥物來說就顯得值得留意了；所以以下二條措施是必需的 a培養(yǎng)箱內(nèi)空氣必需清潔 （定期紫外線照, 酒精擦洗,盡量少開關(guān)培養(yǎng)箱）b 培養(yǎng)箱內(nèi)的濕度必需始終保持為100%（培養(yǎng)箱內(nèi)放置無菌蒸餾水的水槽） ；就好像培養(yǎng)皿,也是一個蓋倒扣的容器,也不會污染；主要是由于蓋子“L” 型邊緣產(chǎn)憤慨流負壓的緣故, 灰塵上面才附著有微生物, 而氣流攜帶的灰塵是無法通過產(chǎn)生負壓的蓋邊緣的； 而透氣作用只是通過空氣的擴散,不會產(chǎn)憤慨流, 所以只會透氣不會透菌；我使用 24 孔板,在其中的某些孔中有操作在超凈臺內(nèi) ,而其它孔中仍有細胞要培養(yǎng) .我很擔憂這樣會污染,不知

8、道要留意什么 .大家不知道有什么好的建議；在超凈臺內(nèi)假如操作規(guī)范的話應(yīng)當可以的,我想你可以充分利用培養(yǎng)版的蓋子,盡量只暴露要操作的孔, 將其它孔用蓋子蓋起來； 這是我的一點粗淺的見解, 拋 磚引玉吧！使用前綜合考慮一下, 充分使用所以的孔； 假如只需要使用少數(shù)的孔可以只用一 邊的,其余用蓋子蓋住,我習慣于先用右側(cè)的孔（右手加樣便利）；其實自己感覺只要留意無菌操作,一般是不會污染的； 操作時用幾塊玻片把板子一側(cè)墊高,不要把蓋子全打開,一般沒問題；4細胞分布不均及解決方法 問：我的細胞接種培養(yǎng)板, 細胞總是集合在周邊部分, 該如何處理啊？我看園子 里有的戰(zhàn)友的細胞卻是集合在中間,是不是板子的質(zhì)量問

9、題啊？答：請問你的細胞是如何混勻的？是滴管吹打仍是振蕩培養(yǎng)板？假如是后者,而且是轉(zhuǎn)圈搖勻的話, 很有可能由于離心力的作用使細胞甩到周邊部分,導致細胞中間少,四周多！自己可是試試！周邊一般是相對會多一點,但是中間的數(shù)量也不會很少啊 有特異去振蕩培養(yǎng)板； 鋪板的時候我也沒大致是板子的質(zhì)量問題吧或者是不是鋪板時候的細胞密度太低了？我用的 corning 的板 ；一個好方法： 在你培養(yǎng)種板之前, 把培養(yǎng)板放入培養(yǎng)箱里進行幾個小時的飽和后 再取出,種入細胞時力氣要輕, 可實行用滴頭在培養(yǎng)板孔的側(cè)面慢慢加入讓細胞 懸液流入板孔中, 培養(yǎng)的細胞基本是均勻生長； 記住千萬不要用振蕩器振蕩,否 就你的細胞就會想

10、你說得那樣聚積在一起；我今日把培養(yǎng)板放入培養(yǎng)箱里幾個小時,適當?shù)陌鸭毎芏燃哟罅艘幌? 另外多加了一點培養(yǎng)液,今晚看細胞鋪的挺好的；我認為有兩種可能解決你問題的辦 法:1.加入前吹打均勻 ;2.從多孔板側(cè)邊或底邊緩慢加入；問：我在做原代培養(yǎng)時也遇到過這種情形,我始終以為培養(yǎng)皿鋪膠不均勻會導致這種現(xiàn)象, 由于混勻的血管段加入到培養(yǎng)皿中時,在相差顯微鏡下血管段均勻分 布在培養(yǎng)皿中, 24h 后貼壁的血管段就是周邊多,中間相對少些；下次我要試試 hkqu 戰(zhàn)友的方法看能否轉(zhuǎn)變這種現(xiàn)象；答：這種現(xiàn)象很正常呀, 不知你仔細觀看過沒有, 孔直徑愈小, 這個現(xiàn)象越明顯,我試過, 24、96 孔板這種現(xiàn)象不行

11、防止,由于液體的附壁使得孔內(nèi)培養(yǎng)液不是 成一個平面, 而是周邊高, 就像凹鏡一樣, 而使用這兩種孔板由于需要加干預(yù)等 緣由而不能加足量培養(yǎng)液,使得細胞隨培養(yǎng)液一起顯現(xiàn)“ 邊集” 現(xiàn)象,假如為了 使孔中心也有均勻細胞而增加接種細胞數(shù)量的話,這要看你需要觀看何種指標,假如是 MTT ,免疫組化的話會由于細胞成層而影響結(jié)果；56 孔板接種和換液問題：問：我的細胞傳代很正常,但一種到六孔板里（不管加藥和對比）,總有兩三個 孔（隨機）細胞長得不好,很小,像破裂了；有人遇到過這種情形嗎？到底是啥 緣由呢？請各位指點 答：可能跟你加液的溫度有關(guān)； 假如你細胞剛剛拿出來換液加液,培養(yǎng)基也是從 4 度冰箱拿出來

12、不久,很簡潔細胞就會凍死了；建議你最好把培養(yǎng)基先在培養(yǎng)箱 里邊孵育 15min 先；另外,跟你細胞的生長狀態(tài)也有關(guān)； 加藥之前的細胞可以用高點的血清濃度培養(yǎng)；保證細胞狀態(tài)良好；或者放在 37 度水浴鍋里孵育也可以,或者是培養(yǎng)板本身的問題,你再換換其它 培養(yǎng)板試試看；再有可能就是細胞狀態(tài)問題了,種板時的血清濃度調(diào)高試一下問：最近幾天,我用六孔培養(yǎng)板接種細胞,培養(yǎng)24 小時后更換培養(yǎng)基,在更換培養(yǎng)基之前,顯微鏡觀看到細胞貼壁,狀態(tài)特殊的好,更換了培養(yǎng)基后,馬上用 顯微鏡觀看, 發(fā)覺每個孔中都近乎有一半的細胞表現(xiàn)出近乎死亡的狀態(tài)；細胞變 得特殊小, 產(chǎn)生大量的碎片, 而另一半的細胞一切正常, 反常細

13、胞與正常細胞之間存在一條分水嶺,上半個圓是好的,下半個圓就不好,這是怎么一回事？答：你可以看一下是不是培養(yǎng)板沒放水平；有一回我也顯現(xiàn)過這種情形；你的培養(yǎng)液如何, 假如培養(yǎng)液過期, 細胞就不會貼壁； 換一點新配制的培養(yǎng)液試 一試；我也經(jīng)常遇到,我想可能是板的問題, 換一個牌子的板或換用培養(yǎng)瓶就沒問題了；不知樓主所需換液的培養(yǎng)板多不多,換培養(yǎng)基的時候假如沒有留意風機的影響,特殊是所需換液的培養(yǎng)板很多時, 簡潔使細胞因風吹失水而干縮破裂； 假如如此,換液時應(yīng)當逐個培養(yǎng)板進行,別怕鋪張吸管,留意操作的效率！624 孔板接種問題：問：把細胞消化接種到 24 孔板之后, 已經(jīng)四天了, 老是每孔的中間部分長

14、不滿,每天換液時都用 PBS 清洗,其次天換液時都顯現(xiàn)同樣的情形,每孔的邊緣長的 很好,中心大量死細胞？答：我是選擇孔內(nèi)鋪蓋玻片,在玻片上種植；每次換液都用 PBS 洗,必要的步 驟嗎？另外,也有可能和細胞種類有關(guān)或者和培養(yǎng)液有關(guān)？我想你的培養(yǎng)液可能加的太少了；由于表面張力的作用, 培養(yǎng)板的邊緣液體會向上走,造成培養(yǎng)液面顯現(xiàn)一個凹面（就像量筒的液體凹面一樣）,中心的細胞正 好在凹面的最低處,培養(yǎng)液少,細胞的養(yǎng)分不夠,甚至干枯掉,空氣中的氧氣也 會造成損耗,即使有增值過來的細胞也會死掉；另外,檢查一下培養(yǎng)箱底部的水是否少了,假如少了,箱內(nèi)的空氣濕度不夠,會 造成培養(yǎng)液揮發(fā)加快,這樣即使剛加的液體

15、不少,過一段時間,由于蒸發(fā),液體 量會削減, 造成中心干枯； 并且這樣會轉(zhuǎn)變了培養(yǎng)液的成分濃度,造成滲透壓過 高；個人體會認為這是物理問題:24 孔板小,細胞接種進去后是很難搖均勻的,結(jié)果導致細胞重貼壁后顯現(xiàn)四周密中間稀的狀況 .至于中間較多死細胞,假如是懸浮狀的話,也一樣是物理問題； 接種后比較粗暴的碰撞, 好像對搖均勻細胞有確定成效 . 在為多孔板培養(yǎng)的細胞換液時確定要留意,不要把培養(yǎng)基吸得太干, 假如完全吸取,很簡潔造成細胞干枯, 這樣的話細胞會很快死亡； 我有一段時間總是遇到這 個問題,一個板子中總有一兩個孔顯現(xiàn)細胞大量死亡,后來發(fā)覺是上面的緣由；現(xiàn)在我做的時候假如必需把液體吸干,我會

16、一個一個空來吸取, 最多一次不超過3 孔,然后馬上加入液體,同時在作轉(zhuǎn)染時,我會在吸液和加液時將風機關(guān)掉,這樣基本上會防止細胞死亡；同時你所說的細胞四周密而中間稀疏,大約有如下緣由：1.培養(yǎng)液加得太少；主要是由于液體張力的問題；2.細胞接種后震蕩太厲害了；由于離心力作用導致細胞分布到四周；細胞分布均勻與否有一點很關(guān)鍵,即每種細胞是有個體差異的, 別人的細胞操作不愿定適合于你 .所以要靠自己摸索,且找出專屬于自己細胞的一套規(guī)律,有如 下體會：1.全部待接種的細胞懸液在種板前確定要用吸管混勻；2.按資料記載, 24 孔板的液體量為 1ml,個人也覺得 1ml 的量足矣；3.接種時,要慢慢加樣,且記得略微旋轉(zhuǎn)槍頭