1、 八、目的基因在受體細胞中的表達基因表達：結構基因在生物體內的轉錄、翻譯以及所有加工過程。基因工程中基因的高效表達：外源基因在生物體內的轉錄、翻譯以及所有加工過程 八、目的基因在受體細胞中的表達基因表達：結構基因在生物體內真核基因在原核細胞中表達的困難細菌RNA聚合酶不能識別真核基因的啟動子mRNA的SD序列不能與核糖體結合真核蛋白易被細菌蛋白酶破壞真核基因在原核細胞中表達的困難細菌RNA聚合酶不能識別真核基幾種常見的表達系統原核表達系統真核表達系統大腸桿菌枯草桿菌酵母哺乳動物細胞昆蟲細胞植物細胞幾種常見的表達系統原核表達系統真核表達系統大腸桿菌枯草桿菌酵（一） 原核細胞表達體系大腸桿菌：最常

2、用的表達形式。大腸桿菌表達外源基因的優勢全基因組測序，共有4405個開放型閱讀框架基因克隆表達系統成熟完善繁殖迅速、培養簡單、操作方便、遺傳穩定被美國FDA批準為安全的基因工程受體生物（一） 原核細胞表達體系大腸桿菌：最常用的表達形式。大腸桿菌大腸桿菌表達外源基因的劣勢大腸桿菌不存在信號肽，產物為胞內產物，提取時需裂解細胞，導致產物含大量雜質；蛋白產物常為包涵體，需經過復性才能恢復蛋白活性；缺乏對真核生物蛋白質的修飾加工系統，不適用于需糖基化修飾的蛋白質；內源性蛋白酶降解空間構象不正確的異源蛋白；翻譯常從AUG開始，目的蛋白的N端常多一個甲硫氨酸殘基，會引起免疫反應；細胞周質內含有種類繁多的內

3、毒素。大腸桿菌表達外源基因的劣勢1、影響目的基因在大腸桿菌中表達的因素外源基因的劑量外源基因的表達效率啟動子的強弱：容易被RNA聚合酶識別并能夠穩定結合；核糖體結合位點的有效性；消除相關二級結構。SD序列和起始密碼的間距；密碼子組成；選擇大腸桿菌偏愛的密碼子。表達產物的穩定性組建融合基因；利用內源或外源信號肽將產物運送到胞間漿周質；改變真核蛋白質二級結構；采用蛋白酶缺陷型大腸桿菌。Ion-營養缺陷型大腸桿菌不能合成黃嘌呤核苷，從而不能合成蛋白酶。1、影響目的基因在大腸桿菌中表達的因素D 細胞的代謝負荷外源基因的表達產物可能本身對宿主菌有毒性，或因消耗其氨基酸等營養物質對宿主菌產生間接毒害。解決

4、方案：將細胞的生長和外源基因的表達分為兩個階段；將細胞的生長與質粒的表達分開；蛋白質以包涵體形式存在。E 工程菌的培養條件pCP3擁有一個溫度可誘導型的復制子，在28時，每個細胞的質粒拷貝數為60在42時，拷貝數迅速增至300 600。D 細胞的代謝負荷2 真核基因在大腸桿菌中的表達形式 以融合蛋白的形式表達藥物基因蛋白質在菌體內比較穩定；融合蛋白本身不能做注射用藥；可以通過特殊設計，將兩類蛋白分開。凝血因子Xa專一識別 Ile-Glu-Gly-Arg;CNBr專一性切割甲硫氨酸。NHCOOH原核序列真核序列2 真核基因在大腸桿菌中的表達形式 以融合蛋白的形式表 以非融合蛋白的形式表達藥物基因

5、外源基因的表達產物不含細菌多肽序列。易被細菌蛋白酶降解；常含有甲硫氨酸，用藥時易引起免疫反應。外源基因的結構細菌啟動子SD序列AUG結 構 基 因終止密碼 以非融合蛋白的形式表達藥物基因細菌啟動子SD序列AUG以分泌型表達蛋白藥物的基因外源基因的表達產物在胞質內合成，后被運輸至細胞周質，信號肽被信號肽酶識別、切割。避免被細菌蛋白酶降解；產物不含有甲硫氨酸；產量不高；信號肽不切割或切割位置不正確。外源基因的結構細菌啟動子SD序列AUG結 構 基 因終止密碼信號肽以分泌型表達蛋白藥物的基因細菌啟動子SD序列AUG結 構 基因工程藥物指南課件3 枯草芽孢桿菌優勢：分泌能力強，將蛋白質產物分泌到細胞液

6、中，故不產生包涵體；局限性：具有極強的胞外蛋白酶，對產物進行不同程度的降解；能進行產物的糖基化。3 枯草芽孢桿菌優勢：分泌能力強，將蛋白質產物分泌到細胞液4 鏈霉菌優勢：非致病，使用安全；分泌能力強，不形成包涵體；具有糖基化能力；已構建了一系列的表達載體；下游培養工藝成熟。新的外源基因表達體系4 鏈霉菌優勢：新的外源基因表達體系（二） 真核細胞表達體系酵母：最有效的單細胞真核微生物。 常用啤酒酵母。動物（哺乳動物和昆蟲）植物細胞（二） 真核細胞表達體系酵母：最有效的單細胞真核微生物。酵母表達外源基因的特點：全基因組測序，基因表達調控機理比較清楚，遺傳操作簡便；大規模發酵歷史悠久、技術成熟、工藝

7、簡單、成本低廉；成功建立了幾種有分泌能力的表達系統；表達產物可以進行糖基化；具有原核細菌無法比擬的真核蛋白翻譯后加工系統；不含有特異性的病毒、不產內毒素；酵母菌是最簡單的真核模式生物。酵母表達外源基因的特點：酵母菌的結構酵母菌的結構酵母菌中的野生型質粒釀酒酵母中的2m環狀質粒幾乎所有的釀酒酵母中都含有2m雙鏈同源重組REP1RAFSTBoriREP2FLPIRIRAB環狀質粒，拷貝數達50至100個。IRs 反向重復序列，600 bp，重組FLP 編碼產物驅動IRs的同源重組REP 編碼產物控制質粒的穩定性STB REP的結合位點接合酵母屬中的pSR1和pSB1，以及克魯維酵母屬中的pKD1等

8、均與2m質粒類似。酵母菌中的野生型質粒釀酒酵母中的2m環狀質粒幾乎所有的釀酒酵1 載體的分類：根據載體的復制序列分為四類：（1）YEp類：復制序列為酵母天然的2m-雙鏈環狀質粒成分。拷貝數可高達100-200。（2）YRp類：非2m-來源的自主復制序列（ARS）。拷貝數5-10。（3）YCp類：非2m-來源的自主復制序列（ARS）。含酵母染色體中心粒成分，拷貝數1。（4）YIp類：含有可與酵母染色體重組的序列，整合到酵母染色體中，隨酵母染色體一起復制，穩定性好。拷貝數1 。1 載體的分類：根據載體的復制序列分為四類：（1）YEp類：質粒轉化酵母通常有兩種方式：堿金屬離子（Li)介導的酵母菌完整

9、細胞的轉化酵母菌電擊轉化法鑒于從大腸桿菌轉化和制備質粒比酵母容易的多，可向酵母載體中引入大腸桿菌的起始和抗生素篩選標記，此類克隆載體即可以在細菌中，又可以在酵母中進行質粒復制和表型選擇。2 克隆載體質粒轉化酵母通常有兩種方式：2 克隆載體3 表達載體啤酒酵母表達系統乳酸克魯維酵母表達系統巴斯德畢赤酵母表達系統3 表達載體啤酒酵母表達系統乳酸克魯維酵母表達系統巴斯德畢赤影響目的基因在酵母菌中表達的因素1 外源基因的劑量：高拷貝數質粒常會引起細胞生長量降低。2 外源基因的表達效率：（1）啟動子：組成型啟動子：在各個生長時期表達誘導型啟動子：受誘導物或誘導條件的影響釀酒酵母PHO5啟動子在培養基中游

10、離磷酸鹽耗盡時才能打開;PHO4基因編碼產物是PHO5啟動子的正調控因子，PHO4溫度敏感型突變基因pho4TS的編碼產物在35時失活，因此，裝在pho4TS-PHO5啟動子下游的外源基因在35時關閉，23誘導表達.影響目的基因在酵母菌中表達的因素1 外源基因的劑量：高拷貝數（2）分泌信號的效率：（3）終止序列的影響：終止序列保證了轉錄產物（mRNA）在適當部位終止，并加上polyA尾巴。常用的終止子有：ADH1, CYC1, MF1，PGK。信號肽+前導肽表達產物的運輸表達產物的修飾（2）分泌信號的效率：信號肽+前導肽表達產物的運輸表達產物的3 外源蛋白的糖基化外源蛋白在酵母細胞中存在兩種糖

11、基化形式：N-糖苷鍵（天冬酰胺連接）和O-糖苷鍵（絲氨酸或蘇氨酸連接），與天然狀態下相同。酵母細胞能夠識別這兩種糖基化信號，使外源蛋白正確折疊，產生與天然狀態相同的蛋白，分泌到胞外。3 外源蛋白的糖基化外源蛋白在酵母細胞中存在兩種糖基化形式：第三節 基因工程菌的不穩定性一、質粒的不穩定性1 質粒的不穩定分為分裂不穩定和結構不穩定2 質粒的不穩定性產生的原因（1）工程菌的質粒由于分裂的原因而不穩定；工程菌分裂時會產生不含質粒的子代菌，造成質粒的丟失；兩種菌的比生長速率有差異。（2）工程菌質粒結構的不穩定是由于DNA從質粒上丟失、重排、缺失導致工程均性能的改變。第三節 基因工程菌的不穩定性一、質粒

12、的不穩定性二、提高質粒穩定性的方法1 選擇合適的宿主菌；2 選擇合適的載體；3 添加選擇壓力；對結構不穩定質粒和大規模生產無效。藥物和食品生產時禁止使用抗生素4 分階段控制培養；為提高培養過程中質粒的穩定性，一般采用兩階段法，第一階段先使菌體生長至一定密度，第二階段誘導外源基因的表達。在培養基中加入選擇性壓力如抗生素等，以抑制質粒丟失菌的生長，也是提高質粒穩定性的方法。二、提高質粒穩定性的方法1 選擇合適的宿主菌；5 控制培養條件；采用適當的操作方式可使工程菌生長速率具有優勢，并使工程菌和質粒丟失菌生長競爭趨于極端化。可調控的環境參數為溫度、pH、培養基組分和溶解氧濃度。通過間隙供氧和改變稀釋

13、速率都可以提高質粒的穩定性。6 固定化：固定化載體有海藻酸膠、卡拉膠、明膠、甲殼素等。固定化培養大腸桿菌W3110（pTG201）240代沒有測到質粒丟失。二、提高質粒穩定性的方法培養基組成：限制培養基比豐富培養基更有利于穩定培養溫度： 較低的培養溫度有利于重組質粒的穩定5 控制培養條件；二、提高質粒穩定性的方法培養基組成：限制培固定化方法酶的固定化方法有下述4種：吸附法，包埋法，共價鍵結合法，交聯法EEEEEEEEEEEEEEEEEEE吸附法共價結合法交聯法包埋法固定化方法EEEEEEEEEEEEEEEEEEE吸附法共價結固定化菌體概念：把菌體細胞中特定的酶不經過分離提純直接用適當的方法將菌

14、體加以固定來催化各種特定的生物化學反應。優點：不需提制酶，可保持酶的活性。反復使用，成 本低與固定化酶比較制備方法：與固定化酶相同，有包埋法、載體結合法、交聯法、熱處理法、射線處理法。其中包埋法是最理想的方法。固定化菌體概念：把菌體細胞中特定的酶不經過分離提純優點：不需一 包埋法1 原理 在菌體細胞本身不發生化學反應的情況下，將其 包進半透性的多聚物膜內。小分子的底物和產物均可 自由出入，而菌體細胞卻不會漏出。2 方法常用的包埋材料是：聚丙烯酰胺凝膠、明膠、瓊脂以制備含天門冬氨酸的大腸桿菌細胞為例將菌體細胞預先用生理鹽水懸浮，向懸浮液中加入聚丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺，然后加入催化劑過硫酸胺和加

15、速劑四甲基乙二胺，混勻后放置一定時間聚合。將得到的凝膠破碎即得到固定化細胞。收率達72.5一 包埋法1 原理2 方法常用的包埋材料是：聚丙烯酰胺凝膠、包埋法制備固定化菌體應用舉例包埋材料菌種酶系用途 瓊脂大腸桿菌大腸桿菌谷氨酸脫羧酶青霉素酰胺酶制造-酪蛋白 生產6-氨基青霉烷酸(6-APA)明膠戊二醛短乳桿菌鏈霉菌葡萄糖異構酶從葡萄糖生產高果糖漿聚丙烯酰胺大腸桿菌天門冬氨酸酶醋酸纖維素大腸桿菌青霉素酰胺酶（裂解）青霉素酰胺酶（合成）生產6APA生產半合成青霉素包埋法制備固定化菌體應用舉例包埋材料菌種酶系用途 瓊脂大腸桿二 載體結合法（吸附法）1 原理 微生物細胞表面帶有電荷，在適當的條件下可以

16、 與載體的離子交換基團形成絡合物或吸附在載體上。2 常用載體離子交換纖維素。陰離子樹脂、DEAE纖維素。3 優缺點 優點：方法簡單、載體易于再生。 缺點：結合力弱，菌體細胞易脫落。二 載體結合法（吸附法）1 原理2 常用載體離子交換纖維素。載體結合法制備固定化菌體舉例載體菌體酶用途離子交換纖維素絲狀菌孢子轉化酶蔗糖的轉化陰離子樹脂放線菌葡萄糖異構酶制造果糖DEAE-纖維素巨大芽孢桿菌青霉素酰胺酶制造6APA載體結合法制備固定化菌體舉例載體菌體酶用途離子交換纖維素絲狀基因工程制藥上游技術基因分離基因連接基因轉化篩選基因表達從基因組中直接分離cDNA文庫PCR法化學合成平末端的連接粘末端的連接抗生

17、素篩選藍白斑篩選序列篩選真核、原核表達系統基因工程制藥上游技術基因分離基因連接基因轉化篩選基因表達從基生理代謝菌種篩選種子培養發酵培養生理代謝種子培養發酵培養基因工程菌的培養設備發酵罐基因工程菌的培養設備發酵罐第四節 基因工程藥物的分離純化生物技術產品一般是活性肽或蛋白質，它們具有如下特點：初始物料中含量低；基體組成復雜；穩定性差；種類多，包括大、中、小分子、結構簡單或復雜的有機化合物，以及結構復雜而又性質各異的生物活性物質；應用面廣，要求質量、純度高，無菌無熱源等。第四節 基因工程藥物的分離純化生物技術產品一般是活性肽一、建立分離純化工藝的根據1、含目的產物的起始物料的特點2、物料中雜質的種

18、類和性質3、目的產物特性4、產品質量要求一、建立分離純化工藝的根據1、含目的產物的起始物料的特點二、分離純化的基本過程一般包括如下幾個方面的過程：細胞破碎、固液分離、濃縮與初步純化、高度純化直至得到純品以及成品加工。二、分離純化的基本過程一般包括如下幾個方面的過程：細胞破碎、 基因工程藥物分離純化的一般流程發酵液細胞分離胞內產物胞外產物細胞破碎固液分離包含體細胞碎片分離變 性復 性濃 縮初步分離高度純化制 劑產 品 基因工程藥物分離純化的一般流程發酵液分離純化要求：條件溫和、選擇性好收率高、兩個技術之間能直接銜接以及整個過程要快，能滿足高生產率的要求。1、細胞破碎與固液分離：收集破碎固液分離：

19、離心、萃取、膜技術等2、目的產物的分離純化：色譜方法3、非蛋白質類雜質的去除：主要是DNA、熱原質和病毒。分離純化要求：條件溫和、選擇性好收率高、兩個技術之間能直接銜三 細胞的破碎方法外力使用與否：機械法，非機械法屬性：物理法、化學法、生物法滲透沖擊物理法化學法生物法勻漿法珠磨法超聲法增溶法酶溶法三 細胞的破碎方法外力使用與否：機械法，非機械法滲透沖擊物理方法技術原理效果成本舉例化學法滲透沖擊滲透壓破壞細胞溫和便宜血紅細胞的破壞酶消化法細胞壁被消化，使細胞破碎溫和昂貴增溶法表面活性劑溶解細胞壁溫和適中膽鹽作用于大腸桿菌脂溶法有機溶劑溶解細胞壁并使之失穩適中便宜甲苯破碎酵母細胞堿處理法堿的皂化作

20、用使細胞壁融解劇烈便宜細胞化學破碎法方法技術原理效果成本舉例化學法滲透沖擊滲透壓破壞細胞溫和便宜方法技術原理效果成本舉例機械法勻漿法（片型）細胞被攪拌器劈碎適中適中動物組織及動物細胞研磨法細胞被研磨物磨碎適中便宜超聲波法用超聲波的空穴作用使細胞破碎適中昂貴細胞懸浮液小規模處理勻漿法（孔型）須使細胞通過的小孔，使細胞受到剪切力而破碎劇烈適中細胞懸浮液大規模處理珠磨破碎法細胞被玻璃珠或鐵珠搗碎劇烈便宜細胞懸浮液和植物細胞的大規模處理細胞物理破碎法方法技術原理效果成本舉例機械法勻漿法（片型）細胞被攪拌器劈碎JJ-2組織搗碎勻漿機 JJ-2組織搗碎勻漿機 2. Ultrasonication 超聲波超

21、聲波破碎儀 2. Ultrasonication 超聲波超聲波破碎儀 WSK臥式高效全能珠磨機3. Crushing in ball mill 珠磨法 WSK臥式高效全能珠磨機3. Crushing in balZM系列臥式密閉珠(砂)磨機ZM系列臥式密閉珠(砂)磨機生物破碎法生物破碎法四固液分離離心沉淀萃取：聚乙二醇無機鹽雙水相萃取膜過濾微濾：分離細胞、細胞碎片、包涵體、蛋白質沉淀物。超濾：濃縮蛋白質、多糖、核酸等大分子物質。反滲透：脫去抗生素、氨基酸等小分子中的水分。四固液分離離心沉淀根據分子大小不同的純化方法（透析和超濾） 透析 超濾根據分子大小不同的純化方法（透析和超濾） 透析雙水相現

22、象是當兩種聚合物或一種聚合物與一種鹽溶于同一溶劑時，由于聚合物之間或聚合物與鹽之間的不相容性，當聚合物或無機鹽濃度達到一定值時，就會分成不互溶的兩相。因使用的溶劑是水，因此稱為雙水相，在這兩相中水分都占很大比例(85一95)，活性蛋白或細胞在這種環境中不會失活，但可以不同比例分配于兩相，這就克服了有機溶劑萃取中蛋白容易失活和強親水性蛋白難溶于有機溶劑的缺點。雙水相萃取 (Aqueous Two Phase Extraction)雙水相現象是當兩種聚合物或一種聚合物與一種鹽溶于同一溶劑時，基因工程藥物指南課件五重組蛋白質的分離純化產物特性及在分離純化中的作用基因工程藥物在生產過程中常用的分離純化

23、方法五重組蛋白質的分離純化產物特性及在分離純化中的作用（一）離子交換層析離子交換層析（IonExchangeChromatography簡稱為IEC）是以離子交換劑為固定相，依據流動相中的組分離子與交換劑上的平衡離子進行可逆交換時的結合力大小的差別而進行分離的一種層析方法。1848年，Thompson等人在研究土壤堿性物質交換過程中發現離子交換現象。本世紀40年代，出現了具有穩定交換特性的聚苯乙烯離子交換樹脂。50年代，離子交換層析進入生物化學領域，應用于氨基酸的分析。目前離子交換層析仍是生物化學領域中常用的一種層析方法，廣泛的應用于各種生化物質如氨基酸、蛋白、糖類、核苷酸等的分離純化。（一）

24、離子交換層析離子交換層析（IonExchan平衡離子能與溶液中其它的離子基團發生可逆的交換反應。平衡離子帶正電的離子交換劑能與帶正電的離子基團發生交換作用，稱為陽離子交換劑；平衡離子帶負電的離子交換劑與帶負電的離子基團發生交換作用，稱為陰離子交換劑。1 離子交換層析的基本原理固定相（離子交換劑）載體（惰性高分子聚合物基質,形成骨架結構）（共價結合于載體上的荷電基團,功能基團）（以離子鍵與活性基團連接，平衡離子）活性基團活性離子平衡離子能與溶液中其它的離子基團發生可逆的交換反應。平衡 在稀溶液中，離子交換劑與各種水合離子(離子在水溶液中發生水化作用形成的)的結合力與離子的電荷量成正比，而與水合離

25、子半徑的平方成反比。 所以，離子價數越高，結合力越大。 在離子間電荷相同時，則離子的原子序數越高，水合離子半徑越小，結合力亦越大。離子交換的原則 在稀溶液中，離子交換劑與各種水合離子(離子在水溶液中因此在稀溶液中離子發生水化時，各種陰離子和陽離子結合力大小的排列序次如下： 一價陽離子：Li+Na+K+Rb+Cs+(對陽離子交換劑) 一價陰離子：FClBrI(對陰離子交換劑) 不同價陽離子：Na+Ca2+A13+Ti4+ (對陽離子交換劑)因此在稀溶液中離子發生水化時，各種陰離子和陽離子結合力大小的+-+ -+ + + + + + + + -平衡緩沖溶液洗脫緩沖溶液1 離子交換層析的基本原理+基

26、因工程藥物指南課件2 離子交換層析的基本操作正吸附：目的產物離子化負吸附：雜質離子化（1）離子交換劑的選擇：強酸或強堿型離子交換劑適用的pH范圍廣，常用于分離一些小分子物質或在極端pH下的分離。由于弱酸型或弱堿型離子交換劑不易使蛋白質失活，故一般分離蛋白質等大分子物質常用弱酸型或弱堿型離子交換劑。 2 離子交換層析的基本操作正吸附：目的產物離子化（1）離子交離子交換劑基質：聚苯乙烯等疏水性離子交換劑常用于分離小分子物質，如無機離子、氨基酸、核苷酸等。纖維素、葡聚糖、瓊脂糖等親水性離子交換劑，適合于分離蛋白質等大分子物質。離子交換劑顆粒：一般來說顆粒小，分辨率高，但平衡離子的平衡時間長，流速慢；

27、顆粒大則相反。所以大顆粒的離子交換劑適合于對分辨率要求不高的大規模制備性分離，而小顆粒的離子交換劑適于需要高分辨率的分析或分離。離子交換劑基質：（2）離子交換劑的預處理、再生和保存：預處理：新啟用的離子交換劑膨化水浮選酸處理清洗至中性堿處理清洗加電荷再生：處理使用過的離子交換劑，使其恢復原有性狀。水沖洗酸處理清洗至中性堿處理清洗加電荷保存：洗去雜質，加防腐劑，4保存。（2）離子交換劑的預處理、再生和保存：預處理：新啟用的離子交離子交換層析要根據分離的樣品量選擇合適的層析柱。離子交換用的層析柱一般粗而短，不宜過長。直徑和柱長比一般為1:10到1:50之間；層析柱安裝要垂直；裝柱時要均勻平整，不能

28、有氣泡。（3）層析柱：離子交換層析要根據分離的樣品量選擇合適的層析柱。（3）層析（4）平衡緩沖液 平衡緩沖液是指裝柱后及上樣后用于平衡離子交換柱的緩沖液。平衡緩沖液的離子強度和pH的選擇首先要保證各個待分離物質如蛋白質的穩定；使各個待分離物質與離子交換劑有適當的結合，并盡量使待分離樣品和雜質與離子交換劑的結合有較大的差別。一般是使待分離樣品與離子交換劑有較穩定的結合。而盡量使雜質不與離子交換劑結合或結合不穩定。在一些情況下（如污水處理）可以使雜質與離子交換劑有牢固的結合，而樣品與離子交換劑結合不穩定，也可以達到分離的目的。另外注意平衡緩沖液中不能有與離子交換劑結合力強的離子，否則會大大降低交換

29、容量，影響分離效果。（4）平衡緩沖液 平衡緩沖液是指裝柱后及上樣后用于（5）上樣離子交換層析的上樣時應注意樣品液的離子強度和pH值，上樣量也不宜過大，一般為柱床體積的15為宜，以使樣品能吸附在層析柱的上層，得到較好的分離效果。（5）上樣離子交換層析的上樣時應注意樣品液的離子強度（6）洗脫梯度洗脫：改變離子強度或pH值階段洗脫：用不同的洗脫緩沖液洗脫速度洗脫液的流速也會影響離子交換層析分離效果，洗脫速度通常要保持恒定。一般來說洗脫速度慢比快的分辨率要好 。（7）濃縮、脫鹽離子交換層析得到的樣品往往鹽濃度較高，而且體積較大，樣品濃度較低。所以一般離子交換層析得到的樣品要進行濃縮、脫鹽處理 。（6）洗脫梯度洗脫：改變離子強