1、豬鏈球菌病診斷豬鏈球菌病診斷一、病原分離1 采樣活豬:采樣用滅菌棉拭子擦拭扁桃體病死豬:扁桃體、肺、肝、血液,有腦炎癥狀取腦組織,關節炎可取關節囊液一、病原分離1 采樣2 分離培養(1)培養基:THB培養基、綿羊血或馬血平板(2)培養條件:需氧兼性厭氧、37、pH7、2 豬鏈球菌2性營養要求比馬鏈球菌獸疫亞種低,后者需加3-5%的犢牛血清2 分離培養二、臨床診斷 主要表現為敗血癥、化膿性淋巴結炎、腦膜炎、心內膜炎、關節炎等。 但不同鏈球菌病原引起的癥狀類似,故該診斷不能用于確診。二、臨床診斷 主要表現為敗血癥、化膿性淋巴結炎、腦關節炎癥狀關節炎癥狀敗血癥敗血癥1 染色鏡檢豬鏈球菌2型: 革蘭氏

2、染色陽性、菌體呈圓形或橢圓形,直徑小于2、0m,一般呈短鏈或成雙排列,革蘭氏染色陽性,菌體表面能形成莢膜。 二、微生物學診斷1 染色鏡檢二、微生物學診斷馬鏈球菌獸疫亞種: 革蘭氏陽性球菌,直徑0、51um,液體培養基中呈長鏈,菌體表面能形成莢膜。營養要求較高,在5%犢牛血清生長良好。依照類M蛋白抗原性的差異,該菌至少有15個血清型。馬鏈球菌獸疫亞種:馬鏈球菌獸疫亞種 豬鏈球菌2型菌( 溶血)馬鏈球菌獸疫亞種 圖2 豬鏈球菌2型 (ZY05719)豬鏈球菌病診斷-課件ATCC 35246株ATCC 35246株2 培養特性豬鏈球菌2型: 菌落形態 血平板上呈灰白色小菌落,粘稠,2型在綿 羊血平板

3、上呈溶血,馬血平板則呈溶血。2 培養特性馬鏈球菌獸疫亞種: 在血清肉湯培養基中培養該菌,開始時有輕度混濁,繼而變清,于管底形成沉淀。 于5綿羊血瓊脂(THA)培養基上培養24 h,大部分菌株形成34mm的粘液樣大菌落,產生明顯的溶血。小部分呈非粘液樣菌落,大小約1mm左右。馬鏈球菌獸疫亞種:3 生化鑒定豬鏈球菌2型: 發酵乳糖、海藻糖、水揚苷,部分菌株發酵 棉實糖、菊糖;不發酵甘露醇、山梨醇3 生化鑒定馬鏈球菌獸疫亞種: 能水解精氨酸,發酵乳糖、水揚苷、山梨醇產酸。不能發酵菊糖、甘露醇、棉子糖與海藻糖。V-P試驗陰性,不產生靛基質,不還原硝酸鹽,不液化明膠。馬鏈球菌獸疫亞種:三、免疫學診斷1

4、玻板凝集實驗 用于豬鏈球菌2型快速定型,但要求抗體效價高;馬鏈球菌獸疫亞種只能用于定群 2 乳膠凝集實驗 敏感性較高,結果容易判斷,但有非特異性三、免疫學診斷1 玻板凝集實驗3 免疫熒光豬鏈球菌2型: 用MRP特異抗體可用于菌體表面其分布的觀察,但需用激光共聚焦顯微鏡。馬鏈球菌獸疫亞種:用類M蛋白特異抗體可用于菌體表面其分布的觀察3 免疫熒光MRP單抗介導FITC標記SS2表面MRP的激光共聚焦圖像 MRP單抗介導FITC標記SS2表面MRP的激光共聚焦圖像MRP單抗介導FITC標記SS2表面MRP的激光共聚焦圖像 SS2多抗介導FITC標記的SS2的激光共聚焦圖像 SS2多抗介導FITC標記

5、的SS2的激光共聚焦圖像 ELISA 常用鏈球菌多克隆抗體包被,以MRP或類M蛋白的單克隆抗體夾心,敏感性高,特異性較強。ELISA四、分子診斷1多酶電泳法: 原理:不同型豬鏈球菌,胞內酶分子的氨基酸有差異,因而電荷有差異,在電場中,其遷移率有差異。用于不同型鏈球菌的分析四、分子診斷1多酶電泳法:2 限制性酶切圖譜分析 原理:不同種或亞種鏈球菌基因不同,因而用限制性內切酶酶切后,其電泳圖譜不同。 用于分離株變異分析,亦可用于不同種或型的鑒定2 限制性酶切圖譜分析 隨機擴增多態DNA分析(RAPD) 用多對隨機引物進行PCR擴增,可得到不同的產物,且產物具有多態性。 可用于種或型的鑒定或分離株變

6、異分析隨機擴增多態DNA分析(RAPD)PCR豬鏈球菌2型: mrp、ef、 cps2、orf2以及溶血素基因均可作為靶基因進行檢測 cps2具有型特異性PCRbp970744622557 mrp, ef, sly, CPS 2 1 2 3 4 51: HA9801; 2: ZY05719;3: Marker; 4,5: 陰性對比bp970744622557 mrp, ef, sly250bp 500bp750bpM 1 22000bp1000bpMaker 1、HA 9801(cps2)2、 ZY05719 (cps2)cps2250bp 500bp750bpM 1 250bp 500bp750bp2000bpM 1 2 3 4ef, mrp, gdh,orf2Maker1、 ef(626 bp) 2、 mrp(316 bp)3、 gdh(688 bp)4、orf2 (858 bp)、250bp 500bp750bp2000bpM 1 250bp 500bp750bp1000bp2000bp250bp 500bp750bp100