1、免疫電泳詳細教程免疫電泳詳細教程7.1.4.1簡單免疫電泳 簡單免疫電泳只追求單純的定性分析。它尤其適用于在復雜樣品中同時檢測多種抗原。對抗原的分離是基于其電荷的差異，因此該技術提供了更好的解決方法。因為抗原在免疫電泳的過程中擴散占用了較大的空間，所以它的靈敏性不是太高。免疫電泳詳細教程27.1.4.1簡單免疫電泳 簡單免疫電泳只追求單純的定性分析將抗原溶液加入到加樣槽中，在電流作用下電泳分離過程就開始了。根據分子所帶凈電荷的不同，分子量大小的差異，在瓊脂糖凝膠中進行電泳時分子的遷移速率和方向也不同，這樣電泳就會將不同抗原分子在瓊脂糖凝膠中分離成若干區帶。然后與電泳方向平行挖一小槽，加入抗血清

2、（含抗體），通過免疫擴散，抗體與已經分離的抗原在瓊脂糖凝膠中雙向擴散，二者特異性結合在比例合適處形成弧形沉淀線。免疫電泳詳細教程3將抗原溶液加入到加樣槽中，在電流作用下電泳分離過程就開始了。免疫電泳詳細教程4免疫電泳詳細教程4和瓊脂平板法相似，簡單免疫電泳的各種沉淀線也代表著抗原的同一性、部分同一性和非同一性。如果電泳分離的兩抗原其沉淀線距離很遠相互沒有接觸，那電泳的時間就要減少一下了。如果要驗證一個已知抗原的話，可以將樣品和參考標準抗原平行加樣進行電泳。然后將抗血清加入到兩者之間的加樣槽中進行免疫擴散即可。免疫電泳詳細教程5和瓊脂平板法相似，簡單免疫電泳的各種沉淀線也代表著抗原的同一7.1.

3、4.2交叉免疫電泳交叉免疫電泳是簡單免疫電泳的一種提高。相似的，樣品中的抗原依據電荷不同經電泳后被分離，然后使已經分開的抗原成分與原電泳方向呈90角的方向在含有抗體的瓊脂糖凝膠中進行二向電泳?？乖涂贵w根據各自所帶電荷的不同在膠中進行遷移。 免疫電泳詳細教程67.1.4.2交叉免疫電泳交叉免疫電泳是簡單免疫電泳的一種提由于大多數抗體的等電點大約為中性pH值范圍，因此利用中性緩沖液體系進行電泳時，抗體分子不動或者移動很小。因為抗原在膠中的遷移是根據其帶的凈電荷，所以它們的等電點必須與緩沖液體系的pH值有較大的差異。如果這些條件都滿足了，如帶負電的抗原其與抗體結合的沉淀線便會在適當的區域產生并快速

4、向正極移動（形成逐漸向正極移動的沉淀峰）。除非再也沒有抗原可以進行擴散，這時沉淀峰的移動才會停止。免疫電泳詳細教程7由于大多數抗體的等電點大約為中性pH值范圍，因此利用中性緩沖免疫電泳詳細教程8免疫電泳詳細教程8免疫電泳詳細教程9免疫電泳詳細教程9利用膠中連續的抗體濃度，峰的最大高度是和提供的抗原的濃度呈比例的。根據已知濃度的各種標準抗原，交叉免疫電泳可以定性和定量的分析抗原。除了可以進行定量分析，交叉免疫電泳相對于簡單免疫電泳仍有很多的優勢：它提供了更好的解決方案，并且可以明顯的快速進行。第一向分離抗原的電泳大約需要3小時，而接下來的擴散需要30-90分鐘就可以了。免疫電泳詳細教程10利用膠

5、中連續的抗體濃度，峰的最大高度是和提供的抗原的濃度呈比7.1.4.3火箭免疫電泳火箭免疫電泳只追求對抗原進行定量分析?？梢跃_、簡單、快速的定量分析0.5-2g的抗原。在這個過程中，我們在1-2%的瓊脂糖凝膠中（厚約1.5mm）打上幾個大約3-8mm長的小洞，待測樣品和稀釋不同程度的標準抗原被加入這樣的小洞以建立標準曲線。和交叉免疫電泳的第二步類似，抗原在含有抗體的膠中進行電泳，很快火箭樣的沉淀線形成并向著電極的方向移動直到穩定下來。免疫電泳詳細教程117.1.4.3火箭免疫電泳火箭免疫電泳只追求對抗原進行定量分免疫電泳詳細教程培訓課件在抗體濃度恒定的膠中沉淀線的最大的遷移距離和抗原濃度的關系

6、是線性的。由已知濃度的標準抗原溶液可以得到標準曲線，沉淀線的遷移距離和凝膠中抗血清的濃度是成反比的。因此降低膠中抗血清的濃度可以增加該方法的敏感性。只有在抗原和抗體具有不同的等電點并且伴隨不同的遷移速率，火箭電泳才能進行。如果不滿足這個條件，可以由氨甲?；乖瓉斫档推涞入婞c，方法是這樣的：一體積抗原溶液和一體積KCNO(2mM)在45孵育30min。待冷卻以后，該混合液用電泳緩沖液調整到要求的濃度，然后加入到膠中即可。 免疫電泳詳細教程13在抗體濃度恒定的膠中沉淀線的最大的遷移距離和抗原濃度的關系是7.1.5其局限性及其重要性經典的免疫沉淀的方法已經從實驗室里逐漸的消失了。簡單免疫電泳基本被W

7、estern Blot方法所替代，定量分析方法比如放射免疫擴散、火箭免疫電泳越來越多的被更靈敏的方法如ELISA、RIA所代替了。主要原因除了其靈敏性低，還有一個原因就是其反應時間較長。如果實驗對敏感性沒有特殊的要求，并且如果不是要檢測半抗原，可以考慮這些經典免疫沉淀方法。它們操作簡單，并且不會造成大量的物質消耗，不需要昂貴的ELISA等儀器。免疫電泳詳細教程147.1.5其局限性及其重要性經典的免疫沉淀的方法已經從實驗室7.2當今的免疫沉淀 免疫沉淀現在更多的被用作一種分析方法。利用該技術，細胞大家族里面的某些特定抗原能夠被檢測出來。另外，單克隆抗體的抗原特異性也可以用免疫沉淀的方法來測得。

8、利用現代免疫技術，不需要考慮抗原表位與抗體互補位間的平衡，而這在傳統方法里是相當重要的?？贵w通常被加到過量的抗原中。另外單克隆抗體也可以用此方法。因為抗體被交聯到了一個固定相上，如瓊脂糖凝膠，免疫沉淀復合物可以通過簡單的離心而分離，然后便可以對其進行分析。免疫電泳詳細教程157.2當今的免疫沉淀 免疫沉淀現在更多的被用作一種分析方法。7.2.1沉淀基質我們用什么來沉淀復合物呢？在免疫學的研究中，經常會用到IgG與細菌蛋白A、蛋白G的特異性結合。這些細菌蛋白目前已經商品化用作與瓊脂糖凝膠結合。它們非常好用，因為只需要電泳就可以完成免疫電泳。IgG分子與這些蛋白的結合是通過其Fc端，因此其抗原結合

9、位點都是可用的。這種方法在靈敏性及檢測量上都有很明顯的提高。將瓊脂糖凝膠提前活化了，例如抗小鼠IgG瓊脂糖凝膠以及EupergitC1Z就是很好的例子。免疫電泳詳細教程167.2.1沉淀基質我們用什么來沉淀復合物呢？在免疫學的研究中由于磁珠的普遍應用，現在不再依賴于各種不同的瓊脂糖凝膠了，越來越多的人開始利用蛋白A和蛋白G的磁珠，或者預活化的磁珠。在這些方法的幫助下，利用一個磁化的平臺，所需免疫復合物可以很輕松的從樣品中分離出來。Brymora等人在2001年發明將沉淀基質加入到一個旋轉的柱子中，這樣可以減少基質在漂洗過程中的流失，使得免疫沉淀基質可以多次復利用。免疫電泳詳細教程17由于磁珠的

10、普遍應用，現在不再依賴于各種不同的瓊脂糖凝膠了，越如果要節省開支的話，這里還有一點好的建議。因為使用各種各樣的蛋白A和蛋白G確實不太經濟，可以從staph A 中分離出非活化的固定細胞來用，這是最原始的沉淀基質。它的缺點是用staph A來做基質的時候會有更多的非特異性蛋白沉淀。免疫電泳詳細教程18如果要節省開支的話，這里還有一點好的建議。因為使用各種各樣的7.2.2減少非特異性沉淀蛋白免疫沉淀的過程似乎很簡單：首先將抗原特異性抗體加入到沉淀基質中，然后將此體系與樣品（待測抗原）共孵育，最好將反應產物離心即可。但是在分析沉淀抗原時，我們經常會得到很不理想的結果，一些非特異性沉淀的蛋白會影響到結

11、果的分析，或者從結果中得不出任何的結論。下面是一點建議：免疫電泳詳細教程197.2.2減少非特異性沉淀蛋白免疫沉淀的過程似乎很簡單：首先一種可能的污染是，蛋白和沉淀基質的非特異性連接，和瓊脂糖凝膠、磁珠、蛋白A或蛋白G等。當將樣品和不含任何抗體的基質提前共孵育一段時間后再用的話，這種背景就會被減少了；將含有結合蛋白的基質換掉，然后將其與新鮮的含有抗體的基質共孵育，也可以消除這種干擾。免疫電泳詳細教程20一種可能的污染是，蛋白和沉淀基質的非特異性連接，和瓊脂糖凝膠當然，蛋白也可能會非特異性的結合到抗體上，或者它們具有和抗原表位相似的結構，也可以結合到抗體的互補位上。它們的這種結合力通常會比正確的

12、抗原-抗體結合力弱。通過將非離子型去垢劑（如Triton X-100, NP-40，Tween -20）和NaCl加入到緩沖液中，這種弱的結合力會被降低到最小。非離子型去垢劑（1-10%）是通過降低它們之間的疏水作用來起作用的，而加入NaCl是為了減少靜電作用 。免疫電泳詳細教程21當然，蛋白也可能會非特異性的結合到抗體上，或者它們具有和抗原Doolittle 等發明用兩級免疫沉淀法，用SDS來減少非特異性沉淀蛋白的干擾。在第一次沉淀過程結束后，免疫沉淀物用SDS變性。在加入新鮮沉淀基質之前SDS的作用用Triton X-100來覆蓋。這樣的預處理是為了將抗體和變性的抗原結合進行二次沉淀。如果

13、用多克隆抗血清的話一般不會有什么問題了。尿素、氯化鎂以及氫氧化鈉都可以用來減少非特異性沉淀蛋白的出現。免疫電泳詳細教程22Doolittle 等發明用兩級免疫沉淀法，用SDS來減少非如果來自細胞裂解液的抗原要進行免疫沉淀，胞質中的蛋白如肌動蛋白就會成為干擾。因為肌動蛋白非常容易結合到抗體上然后對實驗造成很大的干擾。通過加入10mM ATP到裂解緩沖液以及洗滌緩沖液中，肌動蛋白帶來的問題就會解決了。免疫電泳詳細教程23如果來自細胞裂解液的抗原要進行免疫沉淀，胞質中的蛋白如肌動蛋7.2.3免疫沉淀的結果分析大多數情況下，SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳也可以用做免疫沉淀。免疫沉淀復合物被溶解在SDS緩沖液

14、中。該緩沖液中通常含有還原劑（巰基乙醇等），并且SDS用于減弱二硫鍵的作用。把樣品加熱以使蛋白完全變性。而沉淀基質可以通過不同的離心方法進行分離，含有抗原和抗體的上清液加到凝膠上即可。免疫電泳詳細教程247.2.3免疫沉淀的結果分析大多數情況下，SDS聚丙烯酰胺凝根據顯色方法的不同，抗體可能對實驗沒有什么影響，也可能帶來很大麻煩。如果對樣品進行了放射性特異標記，通過熒光自顯影只能檢測到樣品中有信號的蛋白。在這種情況下，抗體不會造成什么影響；如果抗原的顯色是通過蛋白染色劑來完成，而抗體的鏈與抗原或其某一個亞基具有相似的分子質量，那么抗體有可能會造成很大的干擾。如果抗體的量遠遠比抗原多，那么抗體的條帶就有可能會完全覆蓋抗原而影響到結果的分析。這時，抗體若能和基質有