1、 尿中反反式粘糠酸苯巰基尿酸和8羥基脫氧鳥苷的測定苯是一種廣泛存在于工業和生活環境中的化學污染物。基于苯對人體的危害性，世界諸多發達國家均制訂了工作場所相應的職業衛生標準以保護職業苯接觸工人的身體健康，但由于作業環境苯濃度的監測數據并不能完全客觀地反映個體接觸的實際情況和個體易感性，尤其不能反映機體體內蓄積作用（內暴露劑量），用于對長期低劑量職業苯接觸工人的危險度評價有一定的局限性。苯的生物標志物因其靈敏度高，特異性強，更能客觀、全面、準確反映工人的實際接苯狀況，因此更適合作為職業苯接觸工人暴露水平檢測健康監護、暴露危害性評價。生物標志物根據性質不同可分為接觸標志物、效應標志物。目前研究較多的

2、苯接觸標志物有反-反式粘糠酸（tt-MA）與苯巰基尿酸（S-PMA）。表1為2種接觸標志物的比較。進入機體的苯約2%-25%通過體內代謝酶的作用轉化為tt-MA，但食品中的防腐劑山梨酸回產生正干擾，目前通用的檢測技術是液相色譜-紫外檢測法，能夠滿足我國衛生限值3.0mg/g肌酐對檢測的要求。S-PMA轉化比例低，為0.1%-0.5%,但有更長的生物半減期和更高的特異性，該化合物的檢測必須要使用質譜檢測器才能滿足美國衛生限值25昭/g肌酐（我國尚無衛生限值）對檢測檢出限的要求。總之，S-PMA生物監測的應用價值明顯優于tt-MA，但對檢測技術的要求更高。表12種接觸標志物的比較代謝物名稱苯轉化比

3、例特異性檢測技術限值反-反式粘糠酸2%-25%有干擾HPLC-UV3.0mg/g肌酐苯巰基尿酸0.1%.0.5%無干擾HPLC-MS25ug/g肌酐8-羥基脫氧鳥苷（8-OHdG）是研究最的早期效應標志物。8-OHdG是主要的DNA氧化產物之一，是評價DNA氧化損傷的通用指標。雖不是苯暴露的特異性標志物（除苯暴露外，如多環芳烴類和丁二烯等也可誘導DNA氧化損傷），但可以通過8-OHdG反映DNA損傷情況來間接評價苯暴露情況。目前報道的檢測方法為液相色譜電化學檢測法，尿液中8-OHdG的含量0-15ng/ml。目前國內為尚沒有對尿中反-反式粘糠酸、苯巰基尿酸和8-羥基脫氧鳥苷3種物質同時檢測的報

4、道。本文報道了尿中8-羥基脫氧鳥苷（8-OHdG，DNA氧化損傷后代謝產物）、反-反式粘糠酸（tt-MA，苯接觸者尿中代謝標志物）、苯巰基尿酸（S-PMA，苯接觸者尿中代謝標志物）含量測定的高效液相色譜-串聯質譜法。1范圍本方法適用于尿中8-羥基脫氧鳥苷、反-反式粘糠酸、苯巰基尿酸的同時測定。本檢測方法的最低檢出濃度：-羥基脫氧鳥苷為0.3gg/L，反-反式粘糠酸為9yg/L,苯巰基尿酸為0.15gg/Lo2原理尿樣經解凍、離心、調節pH、C固相萃取柱富集凈化后，用液相色譜-質譜/質譜法進行測定和確證，外標法定量。測定結果用尿肌酐進行校正。試劑和材料3.4甲醇溶液（10%）：90ml水中加入1

5、0ml甲醇，混合，超聲脫氣，用于配置標準溶液。3.5甲酸銨溶液（1mol/L）：準確稱取6.3g甲酸銨于100ml燒杯中，用水溶解，轉移到100容量瓶，定容至刻度，混勻后冷藏備用。3.6甲酸-甲酸銨溶液I：10ml1mol/L甲酸銨溶液，2ml甲酸，88ml水混合而成。用于樣品上SPE小柱前對樣品進行pH調節。3.7甲酸-甲酸銨溶液II：2.5ml1mol/L甲酸銨溶液，0.5ml甲酸，500ml水混合而成。此溶液作為流動相中的水相。3.8甲酸-甲酸銨-甲醇溶液：甲酸-甲酸銨溶液II/甲醇=90/10（V/V）,此溶液作為樣品上機前的溶劑。3.9標準品：8-羥基脫氧鳥苷，反-反式粘糠酸，苯巰基

6、尿酸3種標準品的純度大于98%。3.10標準儲備液（100昭/ml）：精密稱取10mg標準品于100ml容量瓶中，用10%甲醇溶液作溶劑定容。冷藏避光保存，此溶液可以使用3個月。3.11混合標準中間液（8-羥基脫氧鳥苷1gg/ml、反-反式粘糠酸10gg/ml、苯巰基尿酸1gg/ml）：取適量標準儲備液于1.0ml進樣小瓶中，用10%甲醇溶液作溶劑稀釋而成，冷藏避光保存，此溶液可以使用1周。3.12固相萃取柱：填料為苯磺酸化的聚苯乙烯-二乙烯基苯高聚物，鍵合相為C18，規格為60mg/3mL。使用前依次用3mL甲醇、3mL水活化平衡。儀器（略）樣品處理試樣凈化前的準備冷凍尿樣室溫解凍。用移液器

7、移取2ml到子彈頭塑料離心管中，12000rpm離心10分鐘。移取1ml上清液于另一只子彈頭塑料離心管中。加入甲酸-甲酸銨溶液I0.2ml，混勻，靜置10分鐘后進行凈化。樣品凈化-上樣將5.1中的待凈化液用移液器全部轉移至已經活化的固相萃取柱中。待樣液吸附在柱床后，用洗耳球吹去柱床中的液體，上樣過程中小柱流出的液體棄去。5.2樣品凈化-洗脫用移液器精密移取1.0ml甲醇到小柱中，收集洗脫液于小試管中，待柱床上部甲醇流完后，用洗耳球吹凈柱床中的甲醇。把小試管置于氮吹儀上，在溫度50C加熱下用小流速氮氣吹干，殘留物（相當于1.0ml樣品）中加入1.0mL甲酸-甲酸銨-甲醇溶液，超聲1分鐘使溶解，用

8、手震搖混勻或渦旋半分鐘，轉移到子彈頭離心管，12000rpm離心15分鐘，用移液器轉移到進樣小瓶，上機測定。儀器測定液相色譜參考條件色譜柱：WaterssymettyC柱（5.0gm、2.1mmi.d.x150mm）。柱溫：40C。6.1.3進樣體積：20gLo6.1.4流速：0.40mL/min。6.1.5流動相：A液為甲醇，B液為甲酸-甲酸銨溶液II，梯度洗脫，洗脫程序如表2所示。表2液相色譜流動相梯度洗脫程序時間/min甲醇/%甲酸-甲酸銨溶液II/%010901.510907.090109.090109.210901510906.2質譜參考條件：四種目標物的特征離子見表3。表3參考質譜

9、條件化合物保留時間母離子（m/z）錐孔電壓子離子（m/z）碰撞能量/eV/V/min8-OHdG2.3284.2ESI+80168.01097.01tt-MA3.5141.0ESI-6053.04S-PMA7.5238.1ESI-7010916注：表2中8-OHdG與S-PMA只有一個子離子。6.3基質標準曲線的繪制基質空白尿液很難獲取，所以取劉華良2010-08-05尿液作為基質尿液，按照5進行處理。用所得的樣品溶液將混合標準中間液逐級稀釋得到的濃度為0、0.001（0.01）、0.005（0.05）、0.01（0.1）、0.05（0.5）、0.1（1.0）Rg/mL的標準工作液（其中括號中

10、為反-反式粘糠酸的濃度，比其余2種化合物濃度大10倍），濃度由低到高進樣檢測，以定量子離子峰面積（y）-濃度（x）作圖，得到基質標準曲線回歸方程。基質匹配加標的樣品LC-MS/MS多反應監測質量色譜圖參見圖1、圖2、圖3。6.4結果計算由于劉華良2010-08-05尿液并非完全空白基質，所以，由線性回歸方程計算得到的質量濃度要加上劉華良2010-08-05尿液的質量濃度（由線性方程計算，Y=0時，X值即為劉華良尿液中待測物濃度），兩者之和用肌酐校正后（WS/T97-1996尿中肌酐分光光度測定方法），以Rg/L為單位報結果，保留一位小數且不超過三位有效數字。計算公式略。空白實驗用水代替尿樣，其

11、余同樣品檢測過程進行。理論上空白試驗應為未檢出。回收率添加濃度為10Rg/L時，8-羥基脫氧鳥苷、苯巰基尿酸的平均回收率為85.1%、85.6%；添加濃度為100Rg/L時，8-羥基脫氧鳥苷、苯巰基尿酸的平均回收率為97.4%、97.2%；添加濃度為100Rg/L時，反-反式粘糠酸的平均回收率為93.7%；添加濃度為1000Rg/L，反-反式粘糠酸的平均回收率94.1%。允許差對不同濃度的基質加標溶液，連續進樣6次得到儀器方法精密度，用相對標準偏差表示，見表4。表4儀器方法相對標準偏差濃度8-OHdGtt-MAS-PMA10Rg/L1.2%-0.8%100Rg/L0.8%5.2%0.8%1000Rg/L-1.2%-210+MRM(2&4.1-16S.0)42.d22.22A2甫2SAiiquisilEibhTime(riiiin)22.22432.8AjcquilionTirhe(rhin)圖18-羥基脫氧鳥苷的質量色譜圖（左圖濃度為lOOg/L；右圖濃度為l.Og/L,S/N=10）-(141叮宀97.052MJ1出匚FI0O33.4363.3412趾4Acqui&rtonTima(min)MRM(1I41bQ97.D)4?.di.2ajJAcquirbon