1、 尿中反反式粘糠酸苯巰基尿酸和8羥基脫氧鳥苷的測定苯是一種廣泛存在于工業(yè)和生活環(huán)境中的化學(xué)污染物。基于苯對人體的危害性，世界諸多發(fā)達(dá)國家均制訂了工作場所相應(yīng)的職業(yè)衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)以保護(hù)職業(yè)苯接觸工人的身體健康，但由于作業(yè)環(huán)境苯濃度的監(jiān)測數(shù)據(jù)并不能完全客觀地反映個(gè)體接觸的實(shí)際情況和個(gè)體易感性，尤其不能反映機(jī)體體內(nèi)蓄積作用（內(nèi)暴露劑量），用于對長期低劑量職業(yè)苯接觸工人的危險(xiǎn)度評價(jià)有一定的局限性。苯的生物標(biāo)志物因其靈敏度高，特異性強(qiáng)，更能客觀、全面、準(zhǔn)確反映工人的實(shí)際接苯狀況，因此更適合作為職業(yè)苯接觸工人暴露水平檢測健康監(jiān)護(hù)、暴露危害性評價(jià)。生物標(biāo)志物根據(jù)性質(zhì)不同可分為接觸標(biāo)志物、效應(yīng)標(biāo)志物。目前研究較多的

2、苯接觸標(biāo)志物有反-反式粘糠酸（tt-MA）與苯巰基尿酸（S-PMA）。表1為2種接觸標(biāo)志物的比較。進(jìn)入機(jī)體的苯約2%-25%通過體內(nèi)代謝酶的作用轉(zhuǎn)化為tt-MA，但食品中的防腐劑山梨酸回產(chǎn)生正干擾，目前通用的檢測技術(shù)是液相色譜-紫外檢測法，能夠滿足我國衛(wèi)生限值3.0mg/g肌酐對檢測的要求。S-PMA轉(zhuǎn)化比例低，為0.1%-0.5%,但有更長的生物半減期和更高的特異性，該化合物的檢測必須要使用質(zhì)譜檢測器才能滿足美國衛(wèi)生限值25昭/g肌酐（我國尚無衛(wèi)生限值）對檢測檢出限的要求。總之，S-PMA生物監(jiān)測的應(yīng)用價(jià)值明顯優(yōu)于tt-MA，但對檢測技術(shù)的要求更高。表12種接觸標(biāo)志物的比較代謝物名稱苯轉(zhuǎn)化比

3、例特異性檢測技術(shù)限值反-反式粘糠酸2%-25%有干擾HPLC-UV3.0mg/g肌酐苯巰基尿酸0.1%.0.5%無干擾HPLC-MS25ug/g肌酐8-羥基脫氧鳥苷（8-OHdG）是研究最的早期效應(yīng)標(biāo)志物。8-OHdG是主要的DNA氧化產(chǎn)物之一，是評價(jià)DNA氧化損傷的通用指標(biāo)。雖不是苯暴露的特異性標(biāo)志物（除苯暴露外，如多環(huán)芳烴類和丁二烯等也可誘導(dǎo)DNA氧化損傷），但可以通過8-OHdG反映DNA損傷情況來間接評價(jià)苯暴露情況。目前報(bào)道的檢測方法為液相色譜電化學(xué)檢測法，尿液中8-OHdG的含量0-15ng/ml。目前國內(nèi)為尚沒有對尿中反-反式粘糠酸、苯巰基尿酸和8-羥基脫氧鳥苷3種物質(zhì)同時(shí)檢測的報(bào)

4、道。本文報(bào)道了尿中8-羥基脫氧鳥苷（8-OHdG，DNA氧化損傷后代謝產(chǎn)物）、反-反式粘糠酸（tt-MA，苯接觸者尿中代謝標(biāo)志物）、苯巰基尿酸（S-PMA，苯接觸者尿中代謝標(biāo)志物）含量測定的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法。1范圍本方法適用于尿中8-羥基脫氧鳥苷、反-反式粘糠酸、苯巰基尿酸的同時(shí)測定。本檢測方法的最低檢出濃度：-羥基脫氧鳥苷為0.3gg/L，反-反式粘糠酸為9yg/L,苯巰基尿酸為0.15gg/Lo2原理尿樣經(jīng)解凍、離心、調(diào)節(jié)pH、C固相萃取柱富集凈化后，用液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法進(jìn)行測定和確證，外標(biāo)法定量。測定結(jié)果用尿肌酐進(jìn)行校正。試劑和材料3.4甲醇溶液（10%）：90ml水中加入1

5、0ml甲醇，混合，超聲脫氣，用于配置標(biāo)準(zhǔn)溶液。3.5甲酸銨溶液（1mol/L）：準(zhǔn)確稱取6.3g甲酸銨于100ml燒杯中，用水溶解，轉(zhuǎn)移到100容量瓶，定容至刻度，混勻后冷藏備用。3.6甲酸-甲酸銨溶液I：10ml1mol/L甲酸銨溶液，2ml甲酸，88ml水混合而成。用于樣品上SPE小柱前對樣品進(jìn)行pH調(diào)節(jié)。3.7甲酸-甲酸銨溶液II：2.5ml1mol/L甲酸銨溶液，0.5ml甲酸，500ml水混合而成。此溶液作為流動(dòng)相中的水相。3.8甲酸-甲酸銨-甲醇溶液：甲酸-甲酸銨溶液II/甲醇=90/10（V/V）,此溶液作為樣品上機(jī)前的溶劑。3.9標(biāo)準(zhǔn)品：8-羥基脫氧鳥苷，反-反式粘糠酸，苯巰基

6、尿酸3種標(biāo)準(zhǔn)品的純度大于98%。3.10標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（100昭/ml）：精密稱取10mg標(biāo)準(zhǔn)品于100ml容量瓶中，用10%甲醇溶液作溶劑定容。冷藏避光保存，此溶液可以使用3個(gè)月。3.11混合標(biāo)準(zhǔn)中間液（8-羥基脫氧鳥苷1gg/ml、反-反式粘糠酸10gg/ml、苯巰基尿酸1gg/ml）：取適量標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于1.0ml進(jìn)樣小瓶中，用10%甲醇溶液作溶劑稀釋而成，冷藏避光保存，此溶液可以使用1周。3.12固相萃取柱：填料為苯磺酸化的聚苯乙烯-二乙烯基苯高聚物，鍵合相為C18，規(guī)格為60mg/3mL。使用前依次用3mL甲醇、3mL水活化平衡。儀器（略）樣品處理試樣凈化前的準(zhǔn)備冷凍尿樣室溫解凍。用移液器

7、移取2ml到子彈頭塑料離心管中，12000rpm離心10分鐘。移取1ml上清液于另一只子彈頭塑料離心管中。加入甲酸-甲酸銨溶液I0.2ml，混勻，靜置10分鐘后進(jìn)行凈化。樣品凈化-上樣將5.1中的待凈化液用移液器全部轉(zhuǎn)移至已經(jīng)活化的固相萃取柱中。待樣液吸附在柱床后，用洗耳球吹去柱床中的液體，上樣過程中小柱流出的液體棄去。5.2樣品凈化-洗脫用移液器精密移取1.0ml甲醇到小柱中，收集洗脫液于小試管中，待柱床上部甲醇流完后，用洗耳球吹凈柱床中的甲醇。把小試管置于氮吹儀上，在溫度50C加熱下用小流速氮?dú)獯蹈桑瑲埩粑铮ㄏ喈?dāng)于1.0ml樣品）中加入1.0mL甲酸-甲酸銨-甲醇溶液，超聲1分鐘使溶解，用

8、手震搖混勻或渦旋半分鐘，轉(zhuǎn)移到子彈頭離心管，12000rpm離心15分鐘，用移液器轉(zhuǎn)移到進(jìn)樣小瓶，上機(jī)測定。儀器測定液相色譜參考條件色譜柱：WaterssymettyC柱（5.0gm、2.1mmi.d.x150mm）。柱溫：40C。6.1.3進(jìn)樣體積：20gLo6.1.4流速：0.40mL/min。6.1.5流動(dòng)相：A液為甲醇，B液為甲酸-甲酸銨溶液II，梯度洗脫，洗脫程序如表2所示。表2液相色譜流動(dòng)相梯度洗脫程序時(shí)間/min甲醇/%甲酸-甲酸銨溶液II/%010901.510907.090109.090109.210901510906.2質(zhì)譜參考條件：四種目標(biāo)物的特征離子見表3。表3參考質(zhì)譜

9、條件化合物保留時(shí)間母離子（m/z）錐孔電壓子離子（m/z）碰撞能量/eV/V/min8-OHdG2.3284.2ESI+80168.01097.01tt-MA3.5141.0ESI-6053.04S-PMA7.5238.1ESI-7010916注：表2中8-OHdG與S-PMA只有一個(gè)子離子。6.3基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制基質(zhì)空白尿液很難獲取，所以取劉華良2010-08-05尿液作為基質(zhì)尿液，按照5進(jìn)行處理。用所得的樣品溶液將混合標(biāo)準(zhǔn)中間液逐級(jí)稀釋得到的濃度為0、0.001（0.01）、0.005（0.05）、0.01（0.1）、0.05（0.5）、0.1（1.0）Rg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液（其中括號(hào)中

10、為反-反式粘糠酸的濃度，比其余2種化合物濃度大10倍），濃度由低到高進(jìn)樣檢測，以定量子離子峰面積（y）-濃度（x）作圖，得到基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程。基質(zhì)匹配加標(biāo)的樣品LC-MS/MS多反應(yīng)監(jiān)測質(zhì)量色譜圖參見圖1、圖2、圖3。6.4結(jié)果計(jì)算由于劉華良2010-08-05尿液并非完全空白基質(zhì)，所以，由線性回歸方程計(jì)算得到的質(zhì)量濃度要加上劉華良2010-08-05尿液的質(zhì)量濃度（由線性方程計(jì)算，Y=0時(shí)，X值即為劉華良尿液中待測物濃度），兩者之和用肌酐校正后（WS/T97-1996尿中肌酐分光光度測定方法），以Rg/L為單位報(bào)結(jié)果，保留一位小數(shù)且不超過三位有效數(shù)字。計(jì)算公式略。空白實(shí)驗(yàn)用水代替尿樣，其

11、余同樣品檢測過程進(jìn)行。理論上空白試驗(yàn)應(yīng)為未檢出。回收率添加濃度為10Rg/L時(shí)，8-羥基脫氧鳥苷、苯巰基尿酸的平均回收率為85.1%、85.6%；添加濃度為100Rg/L時(shí)，8-羥基脫氧鳥苷、苯巰基尿酸的平均回收率為97.4%、97.2%；添加濃度為100Rg/L時(shí)，反-反式粘糠酸的平均回收率為93.7%；添加濃度為1000Rg/L，反-反式粘糠酸的平均回收率94.1%。允許差對不同濃度的基質(zhì)加標(biāo)溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次得到儀器方法精密度，用相對標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，見表4。表4儀器方法相對標(biāo)準(zhǔn)偏差濃度8-OHdGtt-MAS-PMA10Rg/L1.2%-0.8%100Rg/L0.8%5.2%0.8%1000Rg/L-1.2%-210+MRM(2&4.1-16S.0)42.d22.22A2甫2SAiiquisilEibhTime(riiiin)22.22432.8AjcquilionTirhe(rhin)圖18-羥基脫氧鳥苷的質(zhì)量色譜圖（左圖濃度為lOOg/L；右圖濃度為l.Og/L,S/N=10）-(141叮宀97.052MJ1出匚FI0O33.4363.3412趾4Acqui&rtonTima(min)MRM(1I41bQ97.D)4?.di.2ajJAcquirbon