1、棉花 COL家族基因的鑒定、表達(dá)與進(jìn)化分析棉花是全球性的重要經(jīng)濟(jì)作物之一, 植物學(xué)分類屬于被子植物門(Angiospermae) 、雙子葉植物綱 (Dicotyledoneae)、錦葵目 (Malvales)、錦葵科(Malvaceae) 、棉族 (Gossypieae) 、棉屬 (Gossypium) 。棉屬共 50 個(gè)種 , 包括 45個(gè)二倍體及 5 個(gè)四倍體種。四倍體棉種包括 3 個(gè)野生棉 , 即毛棉、黃褐棉及達(dá)爾文氏棉 , 此外陸地棉和海島棉是目前世界上栽培面積最廣的兩個(gè)栽培種。栽培種由野生種馴化而成, 由于長(zhǎng)期栽培、馴化及選擇作用, 野生棉伴隨著對(duì)光周期敏感的多年生短日照生長(zhǎng)習(xí)性轉(zhuǎn)變

2、為光周期不敏感的一年生生長(zhǎng)習(xí)性。發(fā)掘棉花光周期相關(guān)基因, 研究光周期開花途徑的作用機(jī)制, 對(duì)于棉花適應(yīng)多樣性的環(huán)境及種植面積的擴(kuò)展十分有益。CO(CONSTANS)及 COL(CONSTANS-LIKE)基因是調(diào)控植物光周期開花的一個(gè)重要轉(zhuǎn)錄因子。CO受上游生物鐘相關(guān)基因 (GIGANTEA)G1的影響 , 并激活下游的成花素FT(FLOWERING LOCUST)的表達(dá) . 對(duì)于特定基因或位點(diǎn)的選擇作用, 會(huì)導(dǎo)致栽培種群體內(nèi)核酸多樣性水平降低、 基因頻率的降低或升高而偏離中性期望及連鎖不平衡的增加。目前水稻中已經(jīng)證明COL基因是選擇的靶標(biāo)基因。鑒于 COL家族基因在光周期開花途徑中的保守功能

3、, 棉花中 COL家族基因信息的局限性以及馴化選擇中作用未知。本研究根據(jù)擬南芥、 水稻的 COL家族基因信息從全基因組水平分離棉花的COL家族基因 , 對(duì)其進(jìn)行分類、結(jié)構(gòu)特征、定位、組織表達(dá)、晝夜節(jié)律表達(dá)及分子進(jìn)化等系統(tǒng)分析, 主要研究結(jié)果如下 :1. 利用比較基因組學(xué) , 根據(jù)擬南芥、水稻的COL家族基因信息 , 比較雷蒙德氏棉數(shù)據(jù)庫(kù) , 鑒定了 23 個(gè)棉花 COL家族基因。根據(jù)系統(tǒng)進(jìn)化分析 , 該家族基因分為 3 類 , 其中類基因包括COL1-8,均含有兩個(gè)外顯子和一個(gè)內(nèi)含子。AA分析顯示有 2 個(gè) B-box 及 1 個(gè) CCT結(jié)構(gòu)域 (COL8除外 ); 類基因包括 COL9-11

4、,也包含兩個(gè)外顯子和一個(gè)內(nèi)含子, 有 1 個(gè) B-box 及1 個(gè) CCT結(jié)構(gòu)域 ; 類基因包括 COL12-23,該類基因包含一個(gè)完整的B-box, 一個(gè)分化的鋅指結(jié)構(gòu)及一個(gè)CCT結(jié)構(gòu)域。該類基因結(jié)構(gòu)比較多變 , 包括 2 個(gè)或 3 個(gè)內(nèi)含子。 2. 利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù) , 研究了 20 個(gè) COL家族基因在棉花TM-1 根、莖、葉、花藥、花瓣等不同組織及 0DPA、10DPA及 20DPA纖維發(fā)育不同階段的表達(dá)特性。結(jié)果顯示 , 類中的八個(gè)基因中 ,COL1-5,COL8等六個(gè)基因在葉中高表達(dá) ,COL6和 COL7在花中優(yōu)勢(shì)表達(dá)。此外 ,COL2-5 在纖維中表達(dá)也較高。類中三個(gè)

5、基因均在葉中優(yōu)勢(shì)表達(dá)。類中九個(gè)基因, 除 COL14、COL20及COL22分別在莖、葉及纖維中優(yōu)勢(shì)表達(dá)外, 其余六個(gè)基因均是組成型表達(dá)。在 LD 或 SD條件下 , 分別處理陸地棉 TM-1 及海島棉 H7124,連續(xù) 48h 取三葉一心期葉片進(jìn)行 COL家族基因表達(dá)特征分析。結(jié)果顯示已分析的 20 個(gè)基因中有 18 個(gè)基因的表達(dá)表現(xiàn)為晝夜節(jié)律性 , 表明棉花 COL家族基因參與棉花光周期調(diào)控的開花途徑 , 在棉花的光周期開花途徑中起重要作用。選擇包括野生棉、陸地棉及海島棉等 25 個(gè)棉材料及外類群長(zhǎng)梗肖槿為研究材料 , 對(duì) CO/Hd1所在的類中 8 個(gè)基因進(jìn)行分子進(jìn)化相關(guān)分析。 通過(guò)各基

6、因基因組與 cDNA進(jìn)行多序列比對(duì)分析 , 結(jié)果表明這 8 個(gè) COL基因非常保守 , 均含有兩個(gè)外顯子和一個(gè)內(nèi)含子。8 個(gè) COL基因其 DNA全長(zhǎng)變異范圍為 1,030bp-1,611bp,內(nèi)含子長(zhǎng)度的變異范圍為 77bp-680bp。通過(guò)比較不同棉種間同一亞組其同源基因的變異發(fā)現(xiàn) ,COL2,COL6,及 COL8在供試材料間的內(nèi)含子或外顯子區(qū)發(fā)生插入/ 缺失 , 導(dǎo)致長(zhǎng)度變異。而同一材料其 A-及 D亞組部分同源基因的結(jié)構(gòu)變異表明,COL4和 COL7在外顯子或外顯子發(fā)生插入/ 缺失 , 導(dǎo)致 At 及 Dt 間長(zhǎng)度變異。5. 系統(tǒng)進(jìn)化分析表明 ,A 組供體阿非利加棉與異源四倍體棉A

7、亞組聚在一起 ,D 組供體與異源四倍體棉 D 亞組聚為一類。184 個(gè)成對(duì)比較中 , 其 A vs.D 、 At vs.Dt成對(duì)比較的進(jìn)化速率高于A vs.At及 D vs.Dt 進(jìn)化速率占到 98.37%。進(jìn)一步分析證明 A vs.D 與 At vs.Dt 進(jìn)化速率之間表現(xiàn)極高的正相關(guān) , 最小的相關(guān)系數(shù) r 值為 0.797 。說(shuō)明異源四倍體中 ,8 個(gè) COL家族基因的 A-及 D-亞組間是獨(dú)立進(jìn)化的。 6. 通過(guò)成對(duì)比較 8 個(gè) COL家族基因組合 , 以及每個(gè)基因在所有四倍體棉種及A、D 基因組間的核酸多樣性 ( ) 。結(jié)果表明 8 個(gè)基因組合中 ,D vs Dt核酸多樣性 (0.0

8、1051),顯著大于 A vs At的核酸多樣性 (0.00586)(P=4.9E-21)。單個(gè)基因分析表明 ,COL2-COL5,COL7及COL8這 6 個(gè)基因在 Dt 中的進(jìn)化速率顯著快于At,COL6 是在 At 的進(jìn)化速率顯著快于 Dt, 而 COL1基因的進(jìn)化速率在At 和 Dt 之間無(wú)顯著差異。綜上所述 ,8 個(gè) COL家族基因在 At 及 Dt 間的進(jìn)化速率不同 , 大部分基因其 Dt的進(jìn)化速率快于At 。7. 分別分析野生棉、陸地棉及海島棉的8 個(gè) COL基因位點(diǎn)其核酸多樣性 total,結(jié)果顯示野生棉的 total,顯著高于陸地棉 (0.00369 vs0.00139)(P

9、=0.001) 及海島棉 (0.00369 vs 0.00035)(P=7.3E-7),表明陸地棉及海島棉在馴化過(guò)程中存在瓶頸效應(yīng)。進(jìn)一步比較 B-box,Var 及 CCT這三個(gè)結(jié)構(gòu)域在不同棉種中的核酸多樣性, 發(fā)現(xiàn) B-box(0.00284 vs 0.00119,P=0.028)及 Var(0.00243 vs 0.00119,P=0.014)結(jié)構(gòu)域的核酸多樣性顯著高于CCT結(jié)構(gòu)域 ,B-box 及 Var 結(jié)構(gòu)域間的核酸多樣性無(wú)顯著差異。說(shuō)明B-box 及 Var 結(jié)構(gòu)域在進(jìn)化過(guò)程中發(fā)生較大變異, 而 CCT結(jié)構(gòu)域在不同棉種間高度保守, 功能上也比較保守。8. 通過(guò)對(duì) 8 個(gè) COL家族基因進(jìn)行 Tajima s D,Fu and Li s D 和 F 中性檢驗(yàn) , 表明陸地棉在 COL1及 COL2中存在大量的低頻率位點(diǎn) , 這與陸地棉最近發(fā)生的正選擇作用相一致。