1、重組水蛭素的聚乙二醇修飾李雪芹，候蓓蓓，趙軍，田明玉，修志龍*大連理工大學(xué)環(huán)境與生命學(xué)院 大連 116024摘要：目的的 水蛭素素因血漿半半衰期短短而嚴(yán)重限限制了其其臨床應(yīng)應(yīng)用，聚聚乙二醇醇修飾能能有效地地延長(zhǎng)其半衰期期。本文文通過(guò)比較較不同修修飾位點(diǎn)點(diǎn)、修飾飾方法所所得單修修飾產(chǎn)物物的比率率、純度度及其活活性保留留率，從從而得到修飾飾專一性性強(qiáng)且活活性保留留率較高高的修飾飾策略。方法采用用液相和和固相修修飾方法法,用琥珀酰酰亞胺活活化的PPEG 20kkDa分分別在ppH6.0、8.00的條件件下對(duì)水水蛭素的的Hiss和Lys進(jìn)行行定點(diǎn)修修飾；用SDSS-PAAGE分分析產(chǎn)物物的修飾飾度，并

2、并用離子子交換柱柱對(duì)修飾飾后的產(chǎn)產(chǎn)物進(jìn)行行分離，然然后用凝血酶酶滴定法法測(cè)定水水蛭素單單修飾產(chǎn)產(chǎn)物的體體外抗凝凝活性。另另外用分子動(dòng)動(dòng)力學(xué)模模擬方法法預(yù)測(cè)了pH88.0條條件下PPEG修修飾的位點(diǎn)。結(jié)結(jié)果 在pH66.0、8.00的條件件下，水水蛭素單單修飾率率都高達(dá)達(dá)90%以上，但但二者的的單修飾飾活性保保留率相相差較大大。在ppH6.0時(shí)，液液、固相相單修飾飾活性保保留率為為34%、34.8%；而在ppH8.0時(shí)分分別為555%、96%。結(jié)論 在pH88.0 條件下下，采用 “離子交交換柱輔輔助”固相修飾飾的方法法對(duì)Lys進(jìn)行行定點(diǎn)修修飾能得到較高高產(chǎn)率和較高活活性保留留率的單單修飾產(chǎn)產(chǎn)物

3、。關(guān)鍵詞：重重組水蛭蛭素；SC-mPEGG；抗凝活活力；分分子動(dòng)力力學(xué)模擬擬 PEEGyllatiion of Reccombbinaant HirrudiinLi Xuueqiin，Houu Beibbei，Zhaao Jun，Tiaan MMinggyu，XXiu Zhiilonng*Deparrtmeent of Bioosciiencce aand Biootecchnoologgy,SSchoool of Envviroonmeentaal aand Bioologgicaal SScieencee annd TTechhnollogyy,Daaliaan Uniiverrsitty

4、 oof TTechhnollogyy,Daaliaan 11160024,ChiinaAbstrractt: OBJEECT Hiiruddin is thee moost pottentt innhibbitoor oof tthroombiin ffounnd iin nnatuure. Allthooughh hiiruddin hass thhe sstroongeest antti-tthroombiin aactiivitty iin vvivoo, iits shoort hallf-llifee inn seerumm siigniificcanttly limmitss i

5、tts cclinnicaal aantiicoaagullantt apppliicattionn. CCurrrenttly, PEEGyllatiion is commmonnly useed aas aan eeffeectiive metthodd too prroloong itss haalf-liffe iin sseruum. Ourr obbjecct oof eexpeerimmentt iss too chhoosse tthe besst PPEGyylattionn meethood aaccoordiing to thee monooPEGGylaatedd re

6、coombiinannt hhiruudinns puriity andd thhe aantiicoaagullantt acctivvityy inn viitroo. METHHODSS Soluutioon mmethhod andd soolidd meethood aassiisteed bby “packed-bed” and anion exchange column were used to favor the formation of mono-PEGylated hirudin. The mild acidic and mild alkaline PEGylation s

7、trategy was used to target His residue and Lys residue of hirudin respectively using SC-mPEG 20kDa. The pegylated products were isolated by anion exchange chromatogram. SDSwas used to analyze the purity of PEGylated hirudin. Thrombin method was used to analyze the anticoagulant activity of PEGylated

8、 hirudin. Molecular dynamics modeling was used to judge the probability of PEGylation site. RESULTS The mono-PEGylated product with a purity of more than 90% was obtained at pH6.0 and pH8.0. But a large difference in anticoagulant activity exists: the anticoagulant activity of solution and solid met

9、hods were 34% and 34.8% respectively at pH6.0；55%、96% at pH8.0. CONCLUSION Solid method assisted by anion exchange column at pH8.0 was a better strategy to get mono-PEGylated r-Hirudin.Key wwordds：recoombiinannt hhiruudinn；SCC-mPEGG；antticooaguulannt aactiivitty；moleecullar dynnamiics moddeliing前言 水

10、蛭素是含含65個(gè)氨氨基酸殘殘基與33個(gè)二硫硫鍵的多多肽，分分子量約約70000，是迄今今為止發(fā)發(fā)現(xiàn)的特特異性最最好的凝凝血酶抑抑制劑1,而凝血酶酶誘發(fā)的的血液凝凝固是誘誘導(dǎo)血管管血栓形形成的重重要原因因，因此此水蛭素素對(duì)各種種血栓病病均有療療效。然而水蛭素素有一些顯顯著的藥藥用缺點(diǎn)點(diǎn)，如血血漿半衰衰期較短短，一般般只有660-1100分分鐘，患患者需不不斷注射射才能維維持抗凝凝效果，導(dǎo)導(dǎo)致治療療成本較較高，且且重復(fù)注注射也會(huì)會(huì)引起一一些不良良反應(yīng)2-44。上世紀(jì)700年代以以來(lái)，人人們發(fā)現(xiàn)現(xiàn)一些蛋蛋白經(jīng)過(guò)過(guò)PEGG修飾后后，很多多方面的的藥用特特性大大大改善。之之后，人人們開展展了對(duì)于于水蛭素

11、素的PEEG修飾飾研究。George C.Avgerinos5等人采用基因工程方法對(duì)水蛭素氨基酸進(jìn)行改造，用甲基營(yíng)養(yǎng)酵母 Hansenyla polymorpha特異性表達(dá)了只含兩個(gè)Lys的水蛭素，采用對(duì)硝基碳酸酯活化的PEG 5kDa進(jìn)行修飾，并設(shè)計(jì)了工業(yè)等級(jí)純化步驟。這種對(duì)水蛭素修改的方式可以大大提高修飾產(chǎn)物的專一性，但是研究周期性較長(zhǎng)且須具備一定的科研條件。國(guó)內(nèi)也有關(guān)關(guān)于水蛭蛭素PEEG修飾飾的研究究。于愛(ài)愛(ài)平6等人采采用SPPA-PPEG 5kDDa修飾飾水蛭素素II，采采用Soourcce QQ15離離子交換換柱凝膠膠柱分離離修飾產(chǎn)產(chǎn)物，發(fā)發(fā)現(xiàn)三修修飾產(chǎn)物物活力大大大降低低，為原原蛋

12、白的的33.5%。秦秦海娜7等人采采用羰基基二咪唑唑法活化化的PEEG 55kDaa修飾水水蛭素，采采用凝膠膠色譜方方法崔修修飾產(chǎn)物物進(jìn)行分分離，雖雖水蛭素素可與修修飾產(chǎn)物物分離，但但是修飾飾產(chǎn)物之之間未能能分離開開。本實(shí)驗(yàn)組旨旨在通過(guò)過(guò)比較不不同修飾飾位點(diǎn)、修修飾方法法所得單單修飾產(chǎn)產(chǎn)物的比比率、純純度及其其活性保保留率來(lái)來(lái)找到修飾飾專一性性強(qiáng)且活活性保留留率較高高的修飾飾策略。修修飾位點(diǎn)點(diǎn)選擇了了Hiss和Lys；修修飾方法法選擇了了液相修修飾和 “填料料輔助”、“離子交交換柱輔輔助”兩種固固相修飾飾方法。1 材料 基因因工程重重組水蛭蛭素（rr-Hiir）購(gòu)自大連連高新生生物制藥藥有限公

13、公司；水蛭素素變異體體2購(gòu)自重慶慶科潤(rùn)生生物醫(yī)藥藥有限公公司；SC-mPEEG 20kDDa購(gòu)自自北京鍵鍵凱科技技有限公公司2 實(shí)驗(yàn)方方法2.1 水水蛭素HHis位點(diǎn)的PEGG修飾2.1.11液相修修飾 HVV2與SC-mPEEG 220 kkDa以以摩爾比比 1:1 溶溶于0.2M pH66.0磷磷酸鹽緩緩沖溶液液中（PPBS），在25中中反應(yīng)11.5hh。反應(yīng)產(chǎn)產(chǎn)物用HiTTrapp Q HP進(jìn)進(jìn)行線性性梯度洗洗脫。2.1.22“填料輔助助”的固相修修飾在pH6.0下，將20mmM PPBS與與r-HHir: SCC-mPPEG以以摩爾比比1:33在Q-SSephheroose FF介介質(zhì)

14、中充充分反應(yīng)應(yīng)，反應(yīng)應(yīng)完成后后裝柱、梯梯度洗脫脫。2.2 水水蛭素LLys位位點(diǎn)的PPEG修修飾2.2.11 液相相修飾 HVV2與SC-mPEEG200 kDDa以摩摩爾比 1:33 溶于0.002 MM pHH8.00 PBBS中，在23下反應(yīng)應(yīng)。SC-mPEEG分三三等分三三次加入入，每次次反應(yīng)330miin。反反應(yīng)結(jié)束束后樣品品立即用用HiTTrapp Q HP進(jìn)進(jìn)行線性性梯度洗洗脫。2.2.22 “離子交交換柱輔輔助”的固相修修飾 4 ml 1.55mg/ml HV22 溶液液 (溶于于PBSS 200 mMM, ppH 88 A液液）與溶溶于4 mml 220 mmM, pH 8

15、PPBS 中的 SSC-mmPEGG先后以以1 mml/mmin的的流速上上樣于柱柱中，使使二者在在柱中充充分反應(yīng)應(yīng)后進(jìn)行行在線梯梯度洗脫脫。3 分析方方法 3.1 SSDSPAGGE參考文獻(xiàn)8，15%濃縮膠膠、4%分離膠膠，采用用含5%氯化鋇鋇的0.1M碘碘液對(duì)PPEG進(jìn)進(jìn)行染色色。表11為水蛭蛭素PEEG各修修飾產(chǎn)物物的理論論分子量量，可結(jié)結(jié)合電泳泳圖確定定洗脫組組分成分分。表1 水蛭素PEG修飾產(chǎn)物組分理論分子量Table 1 The estimated molecular weights of the PEGylated hirudin 表1 水蛭素PEG修飾產(chǎn)物組分理論分子量Tabl

16、e 1 The estimated molecular weights of the PEGylated hirudin3.2 生生物活性性測(cè)定參照文獻(xiàn)9的方法法，采用用凝血酶酶滴定法法。3.3 組組氨酸修修飾產(chǎn)物物含量檢檢測(cè)利用SC-mPEEG與r-HHir的的Hiss殘基之之間形成成的氨基基甲酸酯酯鍵對(duì)于于中性羥羥胺的敏敏感性測(cè)測(cè)定組氨氨酸修飾飾位置異異構(gòu)體的的含量。3.4 LLys修修飾位點(diǎn)點(diǎn)預(yù)測(cè)采用溶劑可可及表面面積作為為判定賴賴氨酸殘殘基修飾飾可能性性的判斷斷標(biāo)準(zhǔn)，運(yùn)運(yùn)用分子子動(dòng)力學(xué)學(xué)模擬的的方法分分析和預(yù)預(yù)測(cè)液相相和固相相修飾的的位點(diǎn)。結(jié)果4.1 水水蛭素HHis位點(diǎn)的的PEGG修

17、飾4.1.11 液相相修飾 44.1.1.11 修飾產(chǎn)物物的分離離純化液相方法制制備的PPEG化化水蛭素素采用離離子交換換柱進(jìn)行行分離純純化、SSDS-PAGGE法進(jìn)進(jìn)行組分分鑒定。圖1圖1 陰離子交換色譜分離修飾反應(yīng)混合物（pH6.0）Fig.1 Separation of the PEGylation mixture (prepared at pH6.0) by anion-exchange chromatography 圖2圖2 修飾產(chǎn)物的電泳結(jié)果（15%-5%）Fig. 2 SDSanalysis of PEGylated r-hirudin.結(jié)合表1、圖2可以推推測(cè)出圖圖1中峰 1，

18、2 ，3分別為為二修飾飾產(chǎn)物、單單修飾產(chǎn)產(chǎn)物、單單修飾產(chǎn)產(chǎn)物。通通過(guò)積分分法計(jì)算出圖1中各峰峰的面積，從從而得出出出各產(chǎn)物物的比例例：峰1：峰2：峰3= 4.774%：94.66%：0.666%，可見單單修飾產(chǎn)產(chǎn)物是主主要的修修飾產(chǎn)物物。4.1.11.2 單修飾飾產(chǎn)物的體體外抗凝凝活性測(cè)測(cè)定采用凝血酶酶滴定法法對(duì)修飾飾水蛭素素進(jìn)行活活性檢測(cè)測(cè)。圖3圖3 重組水蛭素以及單修飾重組水蛭素的體外抗凝活性測(cè)定Fig. 3 In vitro anticoagulant activity of r-hirudin and monopegylated r-hirudin 圖圖3顯示峰2相對(duì)于于未修飾飾的r-

19、hirrudiin其抗抗凝活性性保留率率為344%, 而峰3的抗凝凝活性保保留率為為19.2%。峰2具有較較高的抗抗凝活性性保留率率，并且且是修飾飾反應(yīng)的的主產(chǎn)物物（峰2占修飾飾反應(yīng)產(chǎn)產(chǎn)物的994.66%）,因此被選選作本文文的目標(biāo)標(biāo)單修飾飾產(chǎn)物做做進(jìn)一步步的分析析。4.1.11.3 Hiis-修修飾位置置異構(gòu)體體含量測(cè)測(cè)定利用SC-mPEEG與r-HHir的的Hiss殘基之之間形成成的氨基基甲酸酯酯鍵對(duì)于于中性羥羥胺的敏敏感性測(cè)測(cè)定組氨氨酸修飾飾位置異異構(gòu)體的的含量。圖4圖4 組氨酸修飾位置異構(gòu)體含量測(cè)定Fig. 4 The proportion assay of His-pegylated

20、 positional isomer圖4中，峰峰2的79.71%被中性性羥胺斷斷開為rr-Hiirdiin, 表明Hiis-修修飾位置置異構(gòu)體體含量為為79.71%，是在在0.22M ppH6.0 PPBS中中修飾反反應(yīng)的主主要的成成份。4.1.22 “填料輔助助”的固相修修飾 4.1.2.11 修飾飾產(chǎn)物的的分離純純化對(duì)在pH66.0 20mmM PPBS, r-Hirr：SC-mPEEG=11：3反應(yīng)所所得固相相修飾產(chǎn)產(chǎn)物，采采用階段段洗脫的的策略進(jìn)進(jìn)行分離離、SDSS-PAAGE法法進(jìn)行組組分鑒定定。圖5圖5 固相修飾反應(yīng)混合物（pH6.0 20mM PBS, r-Hir: SC-mPE

21、G=1:3）的分離純化Fig. 5 Separation of the solid-phase assisted PEGylation reaction mixture (pH6.0 20mM , r-Hir: SC-mPEG=1:3 )圖6 固相修飾反應(yīng)混合物圖6 固相修飾反應(yīng)混合物(pH6.0 20mM PBS,r-Hir:SC-mPEG=1:3)的純化產(chǎn)物的電 泳圖譜Fig. 6 SDSanalysis of the separation products of the solid-phase assisted PEGylation reaction mixture (pH6.0 20m

22、M PBS, r-Hir: SC-mPEG=1:3 )如圖5所示示，峰11為鹽濃濃度突然然增大造造成的紫紫外吸收收的波動(dòng)動(dòng)，峰22經(jīng)電泳泳檢測(cè),如圖6所示，分分子量為為約277KDaa，推斷斷為單修修飾產(chǎn)物物，峰33經(jīng)高效效凝膠過(guò)過(guò)濾檢測(cè)測(cè)，因其其具有和和標(biāo)準(zhǔn)重重組水蛭蛭素相同同的洗脫脫體積，推推斷其為為未反應(yīng)應(yīng)的水蛭蛭素。4.1.22.2 Hiis-修修飾位置置異構(gòu)體體含量測(cè)測(cè)定利用中性羥羥胺法對(duì)對(duì)修飾位位置異構(gòu)構(gòu)體的含含量進(jìn)行行檢測(cè)。圖7圖7 固相輔助單修飾產(chǎn)物高效凝膠過(guò)濾圖譜Fig. 7 HPSEC analysis of the monoPEGylated product of the

23、 solid-phase assisted PEGylation由圖7可知知，中性性羥胺作作用未能能打開mmPEGG與重組組水蛭素素之間的的連接鍵鍵，所以以修飾反反應(yīng)未發(fā)發(fā)生在HHis551。重重組水蛭蛭素中其其他可能能與mPPEG-SC發(fā)發(fā)生修飾飾的氨基基酸殘基基主要是是Lyss的-氨基基，N-末端氨氨基，文文獻(xiàn)報(bào)道道N-末端端氨基的的pKa 為7.88，而Lyys的- 氨基的的pKaa 為10.1110，由由于隨著著pH的降降低，NN-末端端氨基的的反應(yīng)活活性將大大于Lyys的- 氨基111,112， 所以在在pH66.0的的條件下下，其反反應(yīng)活性性較高，故故推測(cè)修修飾反應(yīng)應(yīng)發(fā)生在在N-末

24、端端氨基。 44.1.2.33單修飾飾產(chǎn)物體體外抗凝凝活性測(cè)定定采用凝血酶酶滴定法法對(duì)修飾飾產(chǎn)物進(jìn)進(jìn)行活性性檢測(cè)。表2 凝血酶滴定法測(cè)固相輔助單修飾產(chǎn)物活性表2 凝血酶滴定法測(cè)固相輔助單修飾產(chǎn)物活性Table 2 Analysis of the monoPEGylated product of solid-phase assisted PEGylation by thrombin titration method由表2知，單單修飾產(chǎn)產(chǎn)物的抗抗凝活性性為原蛋蛋白（rr-Hiir）的的34.85%。該修修飾產(chǎn)物物的活性性保留率率略高于于液相修修飾反應(yīng)應(yīng)所得單單修飾產(chǎn)產(chǎn)物的活活性（334%），由由于

25、pHH6.00,200mMPPBS的的液相修修飾反應(yīng)應(yīng)中799.711%的單單修飾產(chǎn)產(chǎn)物的修修飾位點(diǎn)點(diǎn)為組氨氨酸殘基基，而相相同反應(yīng)應(yīng)條件下下的固相相輔助修修飾的單單修飾產(chǎn)產(chǎn)物的修修飾均未未發(fā)生在在組氨酸酸，這是是兩種單單修飾產(chǎn)產(chǎn)物活性性差異的的主要原原因。 4.2 水蛭素素Lys位點(diǎn)點(diǎn)的PEEG修飾飾4.2.11 液液相修飾飾產(chǎn)物的的分離純純化采用離子交交換柱對(duì)對(duì)SC-mPEEG 220 kkDa的的修飾產(chǎn)產(chǎn)物進(jìn)行行分離純純化、SSDS-PAGGE法對(duì)分離離組分進(jìn)行行鑒定。圖8 SC-mPEG 20kDa液相修飾產(chǎn)物離子交換色譜圖圖8 SC-mPEG 20kDa液相修飾產(chǎn)物離子交換色譜圖Fi

26、g. 8 Ion Exchange Chromatography of the SC-mPEG 20kDa HV 2 prepared in solution phase 圖9 SC-mPEG 20kDa液相修飾產(chǎn)物離子交換洗脫物電泳圖圖9 SC-mPEG 20kDa液相修飾產(chǎn)物離子交換洗脫物電泳圖Fig.9 SDSof peaks collected from Fig.8 結(jié)合表表1、圖9可知，圖圖8中峰 1, 2分分別為二二修飾和和單修飾飾產(chǎn)物。通過(guò)積分法計(jì)算出圖8中各峰的面積，從而得出各產(chǎn)物的比例：峰1:峰2= 9.7%:90.3%，可見單修飾產(chǎn)物是主要的修飾產(chǎn)物。4.2.22 “離子交

27、交換柱輔輔助”的固相修修飾產(chǎn)物物的分離離純化對(duì)用“離子子交換柱柱輔助”的固相相修飾方方法得到到產(chǎn)物，采采用階段段洗脫的的策略進(jìn)進(jìn)行分離離、SDDS-PPAGEE法進(jìn)行行組分鑒鑒定。圖10 SC-mPEG 20kDa固相輔助修飾產(chǎn)物離子交換色譜圖圖10 SC-mPEG 20kDa固相輔助修飾產(chǎn)物離子交換色譜圖Fig.10 Ion Exchange Chromatography of the SC-mPEG 20kDa HV 2 on column modification圖11 SC-mPEG 20kDa固相輔助修飾產(chǎn)物離子交換洗脫物電泳圖圖11 SC-mPEG 20kDa固相輔助修飾產(chǎn)物離子交

28、換洗脫物電泳圖Fig. 11 SDSof peaks collected from Fig.10 洗脫組分鑒鑒定同44.2.1。圖10中峰1，2分別為為SC-mPEEG 220kDDa二修飾和單單修飾產(chǎn)產(chǎn)物。通通過(guò)積分分法得出圖10中各產(chǎn)物物的比例例：峰1：峰2= 3.99%：96.1%。相相比液相相分離在在純度及及修飾專專一性上上都有了了顯著提提高。但但從圖8、11比較較中發(fā)現(xiàn)現(xiàn)固相修修飾的轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化率比比液相要要低。這這可能是是由于固固相修飾飾中，柱柱內(nèi)填充充著的離離子交換換介質(zhì)導(dǎo)導(dǎo)致環(huán)境境復(fù)雜，蛋蛋白和PPEG在在水溶液液中狀態(tài)態(tài)以及分分子大小小差異使使得它們們?cè)谥兄械姆峙渑洳煌轮率狗?/p>

29、應(yīng)應(yīng)物接觸觸幾率降降低。4.2.33 修飾產(chǎn)產(chǎn)物體外外抗凝活活力測(cè)定定采用凝血酶酶滴定法法對(duì)修飾飾水蛭素素進(jìn)行活活性檢測(cè)測(cè)。圖12 各種單修飾水蛭素體外比活圖12 各種單修飾水蛭素體外比活Fig. 12 The specific activity ratios of the mono-PEGylated HV2s in vitro圖12所示示，固相相修飾的的蛋白活活力保留留率顯著著高于液液相修飾飾。固相相修飾提提高修飾飾反應(yīng)的的單一性性，且活活力保留留率比較較高。此此種現(xiàn)象象從另一一個(gè)角度度說(shuō)明固固相修飾飾可以提提高修飾飾專一性性。4.2.44水蛭素素修飾位位點(diǎn)的預(yù)預(yù)測(cè)與分分析 采采用溶劑劑可

30、及表表面積法法對(duì)水蛭蛭素修飾飾位點(diǎn)預(yù)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)現(xiàn)：在液液相修飾飾中除LLys447外其它它三個(gè)賴賴氨酸的的NH2殘基都都比較容容易被修修飾；在在固相修修飾中，Lys 27， Lys 35比Lys 24， Lys 47更易被修飾，又因?yàn)長(zhǎng)ys27位于N域的核心部位，靠近三個(gè)二硫鍵，因此PEG對(duì)K27的修飾會(huì)降低水蛭素的活性。而Lys35位于水蛭素的一個(gè)柔性很大的伸向溶液的環(huán)上，既遠(yuǎn)離水蛭素/凝血酶作用區(qū)，又遠(yuǎn)離水蛭素的N域核心。因此可以推測(cè)，得到的活性較高的PEG修飾產(chǎn)物應(yīng)該修飾在Lys35上。5 討論 目目前用于于修飾蛋蛋白質(zhì)的的活化PPEG種種類較多多,可以以根據(jù)蛋蛋白質(zhì)本本身的特特點(diǎn)和要要求

31、選擇擇不同種種類的活活化PEEG,例例如,專專一性修修飾肽鏈鏈的N端端氨基、半半胱氨酸酸的巰基基、賴氨氨酸的側(cè)側(cè)鏈氨基基等13。所選選擇被修修飾的基基團(tuán)必須須是蛋白白質(zhì)功能能的非必必需基團(tuán)團(tuán),否則則將導(dǎo)致致蛋白質(zhì)質(zhì)活性下下降甚至至完全喪喪失。本本文選擇擇了對(duì)位于非非活性中中心的Hiss和Lys進(jìn)進(jìn)行修飾飾。（1）在ppH6.0的條條件下用用SC-mPEEG 220kDDa對(duì)HHis位點(diǎn)進(jìn)進(jìn)行定點(diǎn)點(diǎn)修飾。液液相修飾飾中得到到了以組組氨酸位位置異構(gòu)構(gòu)體為主主的單修修飾產(chǎn)物物，且目目的單修修飾產(chǎn)物物占修飾飾產(chǎn)物的的94.6%, 是微微酸性條條件下的的主要修修飾產(chǎn)物物，且目的的單修飾飾產(chǎn)物體體外抗凝凝

32、活性保保留率為為34% 。“填料輔輔助”的的固相修修飾中，在pHH6.00 200mM PBSS, rr-Hiir: SC-mPEEG=11:3的的條件下下得到的的單修飾產(chǎn)產(chǎn)物的抗凝活活性保留留率達(dá)34.85%。通過(guò)過(guò)對(duì)檢測(cè)測(cè)修飾產(chǎn)產(chǎn)物中SSC-mmPEGG與重組組水蛭素素的偶聯(lián)聯(lián)鍵的檢檢測(cè)，推推斷修飾飾位點(diǎn)為為N-末末端氨基基。（2）在ppH8.0條件件下，用用SC-mPEEG 220kDDa對(duì)LLys位位點(diǎn)進(jìn)行行定點(diǎn)修修飾。采采用分子子動(dòng)力學(xué)學(xué)模擬法預(yù)預(yù)測(cè)：液液相修飾飾的位點(diǎn)點(diǎn)有Lyys 227、LLys 35和和Lyss 244；Lyys355是固相相修飾的的主要修修飾位點(diǎn)點(diǎn)。在本本實(shí)驗(yàn)

33、條條件下，液相修飾和“離子交換柱輔助”的固相修飾中單修飾產(chǎn)物分別占修飾產(chǎn)物的90.3%、96.1%。活性保留率分別為55%,96%。固、液相修飾專一性及純度與微酸條件下的修飾水平相當(dāng)，但活性保留率有了顯著提高，并且固相修飾明顯優(yōu)于液相修飾。因此在pH8.0 條件下，采用 “離子交換柱輔助”固相修飾的方法對(duì)lys進(jìn)行定點(diǎn)修飾能得到較高比率、純度且較高活性保留率的單修飾產(chǎn)物。 本實(shí)實(shí)驗(yàn)實(shí)現(xiàn)現(xiàn)了修飾飾反應(yīng)與與分離的的偶聯(lián)，減減少了操操作步驟驟，并且且離子交交換輔助助的固相相修飾方方法為水水蛭素的的單修飾飾開辟了了新途徑徑。但也也存在不不足，如如固相修修飾法的轉(zhuǎn)化化率較低低、活化化PEGG易水解解等問(wèn)

34、題題，可嘗嘗試通過(guò)過(guò)不同離離子交換換填料來(lái)來(lái)進(jìn)行分分析研究究。參考文獻(xiàn)：1Maarkwwartt,F.“Thhe ddeveeloppmennt oof hhiruudinn ass ann annti-thrrombbotiic druug”,Thrrombb.Rees.,74,1223(119944).2Ryydell,T.J.,Ravvichhanddrann,K.G.,Tullinssky,A.,Bodde,WW.,HHubeer,RR.,RRoittschh,C.,Feentoon,JJ.W,“Thhe sstruuctuure of a ccompplexx off reecomm

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41、1 Thee esstimmateed mmoleecullar weiightts oof tthe PEGGylaatedd hiiruddinPEGyllateed pprodducttsMW/kDDaDi-PEEGyllateed(220 kkDa)HV2247Mono- PEEGyllateed(220 kkDa)HV2227Tri- PEGGylaatedd(5 kDaa)HVV222Di- PPEGyylatted(5 kkDa)HV2217Mono- PEEGyllateed(55 kDDa)HHV212 表2凝凝血酶滴滴定法測(cè)測(cè)固相輔輔助單修修飾產(chǎn)物物活性Tablee 2 A

42、nnalyysiss off thhe mmonoo-PEGGylaatedd prroduuct of ssoliid-pphasse aassiisteed PPEGyylattionn byy thhrommbinn tiitraatioon mmethhod待滴定樣品品所耗標(biāo)準(zhǔn)酶酶活單位位樣品濃度（mg/ml）單修飾產(chǎn)物物 1155v 00.0111 rr-Hiir(對(duì)照) 300v 00.0001 圖1 陰離離子交換換色譜分分離修飾飾反應(yīng)混混合物（pH6.0）Fig.11 Seeparratiion of thee PEEGyllatiion mixxturre (preeparre

43、d at pH66.0) byy annionn-exxchaangee chhrommatoograaphyy 圖2 修飾飾產(chǎn)物的的電泳結(jié)結(jié)果（115%-5%）Fig.22 SSDS-PAGGE aanallysiis oof PPEGyylatted r-hhiruudinn.注：1:標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)PEEGs；2:圖1中的峰1； 3：圖圖1中的峰2； 4: 圖1中的峰3 圖3 重組組水蛭素素以及單單修飾重重組水蛭蛭素的體體外抗凝凝活性測(cè)測(cè)定Fig.33 Inn viitroo annticcoaggulaant acttiviity of r-hhiruudinn annd mmonoopeggylaatedd r-hirrudiin 圖4 組氨氨酸修飾飾位置異異構(gòu)體含含量測(cè)定定Fig. 4 Thhe ppropportton asssay of Hiss-peegyllateed pposiitioonall issomeer 注注：1:液相單單修飾產(chǎn)產(chǎn)物（圖圖1中的的峰2 經(jīng)中性性羥胺處處理）； 22:液相相輔助單單修飾產(chǎn)產(chǎn)物（圖圖1中的的峰2）； 3: r-HHiruudinn(對(duì)照) 圖5 固相相修飾反反應(yīng)混合合物（ppH6.0 220mMM PBBS, r-HHir: SCC-mPPEG=1:33）的分分離純化化Fig.