1、第十二章 細胞增殖及其調控細胞增殖：細胞物質積累與細胞分裂的循環過程1）掌握細胞周期及其相關的概念；2）掌握有絲分裂和減數分裂過程中的主要事件；3）掌握MPF、周期蛋白與CDK激酶以及在細胞周期調控中的作用機理。本章重點：第一節 細胞周期概述細胞周期：細胞由一次分裂結束開始，經過物質積累過程，直到下一次分裂結束為止，稱為一個細胞周期。在正常情況下，沿著G1 S G2 M期的路線運轉。標準的細胞周期 、時相細胞周期的長短取決于G1期，不同細胞類型之間差異較大。不是每種細胞都有標準的細胞周期，如早期的胚胎細胞沒有G1和G2期。表- 某些真核生物的細胞周期時間 細胞周期檢驗點細胞周期檢驗點是控制細胞

2、由一個時期向下一個時期正常運轉的關卡。主要包括：G1/S檢驗點: 酵母中稱start點，哺乳動物中稱R點(restriction point)，控制細胞由G1進入DNA合成期。 DNA是否損傷？細胞外環境是否適宜？細胞體積是否足夠大？S期檢驗點：DNA復制是否完成？G2/M檢驗點：決定細胞一分為二的控制點，相關的事件包括：DNA是否損傷？細胞體積是否足夠大？中-后期檢驗點：紡錘體組裝檢驗點。 終末分化細胞：不可逆地脫離細胞周 期，喪失分裂力，但保持生理活性的細 胞。根據細胞分裂行為，將真核生物細胞分為3類：連續分裂細胞（周期中細胞）: 在細胞周期中連續運轉 休眠細胞（G0期細胞）： 暫時脫離細

3、胞周期，不進行增殖，但可 重新進入細胞周期。人工同步化選擇同步化：用物理方法將處于細胞周期中同一階段的細胞從非同步的群體中分離出來。 1）有絲分裂選擇法：對數增殖期的細胞與培養皿的附著性低，振蕩脫離器壁收集培養。優點：操作簡單，同步化程度高，細胞不受藥物傷害。缺點：獲得的細胞數量較少（1-2%）。2）細胞沉降分離法： 不同時期的細胞體積不同，可離心分離。優點：可用于任何懸浮培養的細胞缺點：同步化程度較低 誘導同步化1）DNA合成阻斷法：選用DNA合成的抑制劑，可逆地抑制DNA合成,最終將細胞群阻斷在S期或G1/S交界處。常用TdR雙阻斷法：優點：同步化程度高，適用于任何培養體系。缺點：產生非均

4、衡生長，個別細胞體積增大。2）中期阻斷法：利用秋水仙素等破壞微管的藥物將細胞阻斷在中期。 優點：無非均衡生長現象， 缺點：可逆性較差。 （無染色體變化，不均等核分裂，不出現紡錘體）第二節 細胞分裂細胞分裂的方式：無絲分裂amitosis 有絲分裂mitosis 減數分裂meiosis有絲分裂：有紡錘體形成和染色體的變化，染色體單體被平分到子細胞。減數分裂：染色體復制一次而細胞連續分裂兩次，有紡錘體形成和染色體的變化，子細胞染色體數為母細胞的一半。有絲分裂過程及其主要特征：M期：前期、前中期、中期、后期、未期、胞質分裂前期：有絲分裂開始，染色體的凝集,分裂極的確定(動粒開始裝配，紡錘體開始組裝，

5、星體出現), 核仁的消失。星體-圍繞中心體向外輻射狀發射的微管組成的結構。前中期：核膜破裂到染色體列隊排到赤道板之前的這一階段。核纖層解聚，染色體進一步縮短變粗，紡錘體微管開始與動粒結合。 中期：染色體列隊排到赤道板， 染色體最短最粗。列隊速度0.05-1um/秒 后期：姊妹染色體單體分離，分別向兩極運動； 動粒微管變短，染色體向兩極運動（后 期A）；極性微管變長，兩極距離變長 （后期B）。染色體運動速度1-2um/分后期A： 染色單體分離 后期B：兩極延伸星體微管動粒微管極性微管馬達蛋白與微管系統共同協作，推動染色體分離胞質分裂：起始于后期，完成于末期。動物細胞在赤道板處形成分裂溝，分裂溝收

6、縮。 胞質分裂：植物細胞在赤道面上形成中央板，以此為基礎形成細胞壁。一次DNA復制，兩次分裂，第一次是減數分裂，第二次是等數分裂。染色體組數目減半 發生遺傳重組減數分裂的主要特點：MEIOSIS特點：1.同源染色體要發生交換重組。2.同源染色體組要發生隨機組合。減數分裂期I的各個時期：前期I 細線期 偶線期 粗線期 雙線期 終變期 中期I后期I末期I減數分裂前間期：S期長，DNA復制不完全。主要事件是完成同源染色體的配對，在此過程中要發生配對同源染色體間的交換重組。細線期（凝集期）：染色體呈細線狀；染色單體連接緊密，具有念珠狀的染色粒；染色體的端粒同核膜相連。偶線期：同源染色體配對，聯會，二價

7、體（bivalent） 、四分體（tetrad），聯會復合體；合成剩余DNA。( Zyg-DNA, 0.3%)。聯會復合體 synaptonemal complex ，SC SC是偶線期兩條同源染色體配對形成的復合結構。蛋白質和DNA片段是SC的主要組成成分。側成分中央成分粗線期：同源染色體的非姊妹染色單體間發生基因交換重組，染色體縮短變粗，合成部分p-DNA，合成專用組蛋白并置換。雙線期：重組結束，同源染色體相互排斥、開始分離，交叉開始端化，但仍有聯系，不同程度解凝聚，基因轉錄活躍，聯會復合體消失。重組結染色體重組-交換與交叉在同源染色體聯會期間，同源染色體要 發生斷裂和重接，在此過程中發生

8、同源 染色體間的交換，在顯微鏡下可見到交 叉（chiasma）。交叉(crossover)是交換的結果。同源染色體的交換與交叉終變期：二價體顯著變短。由于交叉端化過程的進一步發展，故交叉數目減少，同源染色體僅在端部連接。核仁開始消失，核被膜解體。減數分裂的前期I細線期偶線期粗線期雙線期終變期中期減數分裂期II中期II后期II末期II前期II描述各時相的重要事件有絲分裂是一次細胞周期, DNA復制一次, 分裂一次,染色體由2n2n; 減數分裂是兩次細胞周期,DNA復制一次,細胞分裂兩次, 染色體由2n1n;有絲分裂中,每個染色體是獨立活動; 減數分裂,染色體要配對、聯會、交換和交叉。有絲分裂之前

9、,經DNA合成,進入G2期,才進行有絲分裂;減數分裂之前,DNA合成時間很長(99.7%合成,0.3%未合成),一旦合成,即進入減數分裂期,G2期長短變化大;有絲分裂時間短,1-2小時;減數分裂時間長,20多小時,至幾年。減數分裂與有絲分裂的比較共同點: 都是通過紡錘體同染色體的相互作用進行細胞分裂。不同點：有絲分裂是體細胞的分裂方式，減數分裂主要是產生配子的過程;減數分裂的生物學意義保證了染色體數目在世代交替中的恒定,從而保證了物種相對的穩定性。染色體間分離時的重組,提供了遺傳的多樣性;同源染色體配對時交換重組,提高了基因內、基因間重組的頻率,加快了進化的速度。細胞周期調控中的一些關鍵問題：

10、細胞如何準確地復制遺傳物質及傳給子細胞的？調節細胞周期的關鍵調控因子是什么？細胞周期是如何調控的？第四節 細胞周期調控2001年諾貝爾生理學/醫學獎得主利蘭哈特韋爾(美)保羅納西（英）蒂莫西亨特（英）控制細胞周期的基因，其中一種被稱為“START” 的基因對控制各個細胞周期的最初階段具有決定性的作用。發現了CDK（周期蛋白依賴性激酶）。發現了調節CDK的功能物質CYCLIN.以人細胞系HeLa和非洲爪蟾為研究代表 MPF，促成熟因子，p32+p45以裂殖酵母、芽殖酵母為研究代表-CDC（cell division cycle）細胞分裂基因，p34cdc2 p34cdc28以海膽卵為研究代表-C

11、yclin A、B、C、D， 細胞周期蛋白細胞周期調控因子的發現和研究： 細胞融合實驗研究者：1970年，Colorado 大學的Potu Rao 和 Robert Johnson 研究方法：使用HeLa細胞系的融合早熟染色體凝集(premature chromosome condensation,PCC ）或稱染色體超前凝集。一、MPF的發現及其作用G1期細胞與M期細胞融合G1期PCC為單線狀，因DNA未復制。S期細胞與M期細胞融合S期PCC為粉末狀，因DNA由多個部位開始復制。G2期細胞與M期細胞融合G2期PCC為雙線染色體，說明DNA復制已完成MPF的發現 成熟促進因子(maturati

12、on promoting factor，MPF）,早期稱為M-期促進因子(M-phase promoting factor, MPF)，是指M期細胞中存在的促進細胞分裂的因子。 非洲爪蟾和無脊椎動物的卵母細胞及早期的胚細胞也證實MPF的存在卵細胞提取物注射實驗1X21988年Maller實驗室的Lohka 將非洲爪蟾卵的MPF純化，經鑒定由32KD和45KD兩種蛋白組成(p32和p45)，二者結合表現出蛋白質激酶活性，可使多種蛋白質磷酸化。由此證明MPF是一種蛋白激酶。1960s Leland Hartwell以芽殖酵母,1970s Paul Nurse等人以裂殖酵母為實驗材料，利用溫度敏感突

13、變株，發現許多與細胞分裂有關的基因(cell division cycle gene，cdc) 。二、P34cdc2激酶的發現與MPF的關系：cdc2和cdc28分別是裂殖和芽殖酵母細胞周期中重要的調控基因，都編碼一個34KD的蛋白激酶，即p34cdc2和p34cdc28，它們互為同源物。 突變型在限定的溫度下無法分裂，停止在G2/M交界處或G1/S交界處。-兩者與相關蛋白結合，如p56cdc13 ，才具有激酶活性（ MPF中的p45 ？ p56cdc13 ）- p34cdc2特異抗體能夠識別MPF中的p32，并且p34cdc2多肽片段增強MPF 活性，證實p34cdc2是p32的同源物。三、

14、細胞周期蛋白的鑒定1983年Timothy Hunt首次發現海膽卵受精后，在其卵裂過程中兩種蛋白質的含量隨細胞周期劇烈變化，故命名為周期蛋白(cyclin)。后發現各類動物來源的周期蛋白mRNA均能誘導蛙卵的成熟。實驗方法獲得同步化的受精的海膽卵細胞在有放射性氨基酸的培養液中培養每10分鐘取一次樣分離純化蛋白質進行分析實驗結果周期蛋白的積累和降解在細胞周期中周期蛋白和MPF的波動 P45(MPF) -周期蛋白B- p56cdc13(酵母)MPF的結構組成 Paul Nurse（1990）是一種蛋白質激酶，由兩個不同的蛋白質（亞基）組成的異質二聚體，可使多種蛋白質磷酸化:催化亞基:p32, cd

15、c2蛋白p34是p32的同源物是絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶其活性有賴于周期蛋白，是周期依賴性蛋白激酶(cyclin-dependent protein kinases,CDK);調節亞基：p45,周期蛋白(cyclinB)是p45 的同源物。MPF的結構組成周期蛋白依賴性激酶CDK周期蛋白MPF=Cdc2+CyclinB周期蛋白分子結構的特點和類型特點：在細胞周期中呈周期性變化。均含有一段約100個氨基酸的保守序列，稱為周期蛋白框，介導周期蛋白與CDK結合，形成周期蛋白-CDK復合體。作用：激活CDK，引導CDK作用于不同的底物。類型：G1期周期蛋白： G1表達， 在G1、 S和G1/S轉化過程中

16、起調節作用；C端含一段特殊的PEST序列。M期周期蛋白：間期表達積累，在M期表現出調節功能；近N端含9個氨基酸組成的破壞框，參與泛素介導的降解作用。P426 圖12-34細胞周期蛋白分子結構特征N端9個氨基酸序列，即：N端破壞框(destruction box)周期蛋白框C端PEST序列 100個氨基酸的保守序列 不同周期蛋白的表達時期不同，與不同的CDK結合，調節不同CDK激酶的活性。 圖12-35 部分哺乳動物和酵母細胞周期蛋白在細胞周期中的積累及其與CDK激酶活性的關系。四、CDK激酶和CDK激酶抑制物Cdc2又被稱為CDK1，可將特定蛋白磷酸化，促進細胞周期運行，被稱作細胞周期引擎。-

17、將核纖層蛋白磷酸化導致核纖層解體、核膜消失，-將H1磷酸化導致染色體的凝縮CDK是細胞周期蛋白依賴性激酶(cyclin-dependent kinase)，與細胞周期蛋白結合才具有激酶的活性。現有的CDK共同點：均含有一段相似的激酶結構域，這一區域有一段保守序列，即PSTAIRE，（激酶活性區域）與周期蛋白的結合有關。1、CDK與cdc2類似的CDK蛋白分子圖解13表12-2 某些CDK與周期蛋白的配對關系及執行的功能CDK種類 可能結合的周期蛋白 執行功能的可能時期CDK1（p34cdc2） A,B1,B2,B3 G2/MCDK2 A,D1,D2,D3,E G1/S,SCDK3 G1/SCD

18、K4 D1,D2,D3 G1/SCDK5 D1,D3CDK6 D1,D2,D3 G1/SCDK7 HCDK8 CCDK122、CDKICDKinhibitor( CDKI): 細胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子,對細胞周期起負調控作用.目前發現的CDKI分為兩大家族:Ink4(Inhibitor of CDK4): p16ink4a、p15ink4b、p18ink4c、p19ink4d，特異性抑制CDK4cyclin D1、CDK6cyclin D1復合物。CIP/Kip(Kinase inhibition protein)：p21cip1 (cyclin inhibition protein 1

19、)、p27kip1、p57kip2等，抑制大多數CDK的激酶活性.p21cip1抑制CDK和pCNAp21cip1主要對G1期CDK激酶起抑制作用，還能與DNA聚合酶的輔助因子pCNA（proliferating cell nuclear antigen）結合，直接抑制DNA的合成。G1，S期五、細胞周期運轉調控1、G1/S 期轉化與調控- G1周期蛋白：Cyclin D 、E 或A-CDK激酶： CDK4，6，2- G1- CDK復合體： Cyclic D- CDK4，6 (D1-3, G1/S 期轉化必需) Cyclic E- CDK 2 （S期啟動必需） Cyclic A - CDK 2

20、 （與DNA復制有關） -降解作用：泛素化降解途徑，PEST序列 G1期，在生長因子的刺激下，cyclin D表達，并與CDK4、CDK6結合，使下游的蛋白質如Rb磷酸化，Rb釋放出轉錄因子E2F，促進許多基因的轉錄，如編碼cyclinE、A和CDK1的基因。（Rb：成視網膜細胞瘤蛋白，E2F：轉錄因子） Cyclin D與CDK結合使Rb釋放結合的轉錄因子E2F在G1-S期， cyclinE與CDK2結合，促進細胞進入S期。CyclinE的抗體能使細胞停滯于G1期。2、 G2-M期轉化與調控 在G2-M期，cyclinB （或 cyclinA）與CDK1結合，CDK1使底物蛋白磷酸化、如將組

21、蛋白H1磷酸化導致染色體凝縮，核纖層蛋白磷酸化使核膜解體。作用底物 見 430頁的表12-3M期CDK1的激活M期CDK1的激活依賴于分裂期cyclin的積累。結合cyclinB的CDK1被Wee1/mik1激酶將CDK的Thr14和Tyr15磷酸化,被CAK激酶(CDK activating kinase)將Thr161的磷酸化,不具有活性，使CDK-cyclin不斷積累。在M期，Wee1/ mik1的活性下降，Cdc25c使CDK1的Thr14和Tyr15去磷酸化，去除了CDK活化的障礙。P431 圖12-38CDK1CDK1CDK1周期蛋白B/A周期蛋白B/A周期蛋白B/A周期蛋白B/A

22、Thr14 PTyr15PThr161 PThr14Tyr15Thr161 PThr14Tyr15Thr161無激酶活性無激酶活性有激酶活性APC+Wee1/Mik1CAKCdc25c圖12-38 CDK1激酶活性綜合調控示意圖CDK1的激活需要Thr14和Tyr15去磷酸化和Tyr161的磷酸化細胞周期運轉到分裂中期后，M期周期蛋白通過泛素途徑迅速降解。在中期當CDK活性達到最高時，激活后期促進因子APC，將泛素連接在cyclinB上，導致cyclinB被蛋白酶體（proteasome）降解，完成一個細胞周期。3、分裂中期向分裂后期轉化中的M期周期蛋白APC: anaphase promot

23、ing complex泛素是由76個氨基酸組成的高度保守的小分子多肽，普遍存在于真核細胞，故名泛素。共價結合泛素的蛋白質能被蛋白酶體識別和降解，這是細胞內短壽命蛋白和一些異常蛋白降解的普遍途徑。26S蛋白酶體是一個大型的蛋白酶，由一個筒狀的20S的催化核心和一個稱為PA700的調節部分組成，可將泛素化的蛋白質分解成短肽而降解。 周期蛋白的泛素化降解途徑多聚泛素化作用(polyubiquitination)泛素激活酶(ubiquitin-activating enzyme, E1) 泛素結合酶(ubiquitin-conjugating enzyme, E2) 泛素連接酶(ubiquitin l

24、igase, E3) 促后期復合物（后期促進因子） (anaphase-promoting complex, APC) 蛋白酶體的降解作用Polyubiquitination多聚泛素化作用通過調節APC活性來調控周期蛋白B的降解和有絲分裂的退出：當MPF(CDK)的活性在有絲分裂中期達到最高峰時, 它將APC磷酸化并將其激活；形成多聚泛素化的周期蛋白B, 引起周期蛋白B的降解；由于周期蛋白B是MPF的一個必需亞基, 它的降解勢必導致MPF(CDK)的逐漸失活；在G1期的后期,APC完全失活,使得周期蛋白B的濃度升高,同時提高MPF的活性, 以便進入下一個有絲分裂期。中期后期后階段末期間期前期多

25、聚泛素鏈周期細胞中M期周期蛋白水平的調節真核生物細胞周期調控的關鍵時期：三個關鍵的過渡：G1期S期：Cyclic D- CDK4，6， Cyclic E- CDK 2， Cyclic A - CDK 2G2 M期： cyclinB （A）- CDK1中期后期及胞質分裂期過渡： cyclinB的降解兩類周期蛋白-CDK復合物:G1期周期蛋白-CDK復合物M期周期蛋白-CDK復合物真核生物細胞周期調控模型 圖12-11 真核生物細胞周期調控模型 在復制期始點裝配DNA復制復合物激活G1cyclin-CDK復合物S-cyclin-CDK復合物被抑制G1后期激活S-cyclin-CDK復合物S期CDK

26、復合物激活復制復合物七、生長因子對細胞增殖的影響單細胞生物的增值取決于營養，多細胞生物細胞的增值與細胞通信有關。生長因子：是一類與細胞增殖有關的信號物質，已知幾十種，多數能促進細胞增殖，又稱有絲分裂原（mitogen），如EGF、NGF。作用方式：主要通過旁分泌作用于鄰近細胞。信號通路主要有：ras途徑，cAMP途徑和磷脂酰肌醇途徑。如通過ras途徑，激活MAPK，MAPK進入細胞核內，激活c-myc，myc作為轉錄因子促進cyclin D、SCF、E2F等G1-S有關的許多基因表達，細胞進入G1期。圖13-29 生長因子的作用機理有絲分裂的生物學意義 核內每個染色體準確地復制，有規則而均勻地分配到兩個子細胞的核中，