1、鹽酸戊乙奎醚對大鼠缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖海馬腦片凋亡相關(guān)因子表達(dá)【摘要】目的研究鹽酸戊乙奎醚(penehylidinehydrhlride，PH)對大鼠缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖海馬腦片的保護(hù)作用及機(jī)制。方法采用大鼠海馬腦片缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖模型;分為正常組、缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖(H/R)組、PH2l/L(PH2組)、PH10l/L(PH10組)、PH50l/L(PH50組)、S50l/L(S50組)，測量各組LDH釋放率，免疫組織化學(xué)法測定各組海馬A1區(qū)Bax、Bl-2、aspase-3的表達(dá)。結(jié)果PH各組LDH釋放率均較H/R組下降，以PH50組效果最好(P0.01)。PH50組Bl-2陽性細(xì)胞的表達(dá)和

2、Bl-2/Bax比值均較H/R組升高,Bax和aspase-3陽性細(xì)胞表達(dá)均較H/R組降低(P0.01)。S50組Bl-2陽性細(xì)胞的表達(dá)和Bl-2/Bax比值也較H/R組升高,Bax和aspase-3陽性細(xì)胞表達(dá)均較H/R組降低(P0.01)。結(jié)論PH可能通過減少LDH釋放和aspase-3、Bax的表達(dá)，增加Bl-2的表達(dá)減輕大鼠缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖海馬腦片的損傷。【關(guān)鍵詞】海馬腦片;缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖;鹽酸戊乙奎醚;乳酸脫氫酶;大鼠Abstrat:bjetiveTinvestigatetheprtetiveeffetfpenehylidinehydrhlride(PH)ntheapptsis

3、frathippapalsliesinduedbyhypxia/hypglyeiaandrexygenatin(H/R)andtheunderlyingehanis.ethdsExperientaldelfhypxia/hypglyeiaandrexygenatin/gluserEintrdutinasestablishedbyadptinfrathippapalslies,hihereequallydividedint6grups:ntrlgrup,H/Rgrup,PH2lL-1(PH2)grup,PH10l/L(PH10)grup,PH50l/L(PH50)grupandS50l/L(S5

4、0)grup.TheLDHreleaserateasusedtevaluatetheprtetiveeffetfPHntheapptsisfrathippapalsliesinduedbyH/R.TheexpressinfBax,Bl-2andaspase-3inhippapalA1fieldfeahgrupererespetivelydetetedbyiunhistheialethd.ResultsparedithH/Rgrup,theLDHreleaserateinPHgrupsdereased,ithPH50grupnthetp;theexpressinfBl-2psitiveellsa

5、ndtheBl-2/BaxratiinPH50grupinreased;andtheexpressinfBaxandspae-3psitiveellsdereased(P0.01).paredithH/Rgrup,theexpressinfBl-2psitiveellsandtheBl-2/BaxratiinS50grupinreased;andtheexpressinfBaxandspae-3psitiveellsdereased(P0.01).nlusinPHightattenuatetheH/R-induedinjuriesthippapalsliesbyreduingthereleas

6、eratefLDH,theexpressinfaspase-3asellasBaxandinreasetheexpressinfBl-2.Keyrds:hippapalslies;hypxia/hypglyeiaandrexygenatin;penehylidinehydrhlride;latatedehydrgenase;rat缺血性腦損傷發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜，近年認(rèn)為腦缺血早期伴隨著乙酰膽堿(aetylhline，Ah)大量釋放，通過沖動毒蕈堿型膽堿受體加重腦損傷1。型膽堿受體通常可將其分為155個亞型。1受體主要存在于突觸后膜，過度激活后可出現(xiàn)慢興奮性突觸后電位，產(chǎn)生興奮性毒性作用。2受體主

7、要存在于突觸前膜，對Ah釋放產(chǎn)生負(fù)反響調(diào)節(jié)作用，阻斷2受體會導(dǎo)致Ah的釋放增多。因此，尋找選擇性拮抗1受體亞型而對2受體亞型沒有明顯作用的抗膽堿藥物可以成為治療缺血性腦損傷的策略之一。鹽酸戊乙奎醚(penehylidinehydrhlride，PH)主要選擇性拮抗1、3受體，對2受體無明顯作用，具有較強(qiáng)的中樞抗膽堿作用2。我們前期研究說明其對缺血性腦損傷具有保護(hù)作用3。但詳細(xì)機(jī)制尚不明確，尤其是在海馬腦片程度研究PH對缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖后細(xì)胞凋亡相關(guān)因子aspase-3、Bl-2、Bax等表達(dá)的影響鮮有報道。因此，本實驗以非選擇性受體阻斷藥鹽酸東莨菪堿(splainehydrhlride，S)

8、為對照，通過研究PH對大鼠海馬腦片腦缺血/再灌注損傷后凋亡相關(guān)因子的表達(dá)，討論PH對腦缺血的保護(hù)機(jī)制，為拓寬該藥臨床應(yīng)用提供理論根據(jù)。1材料和方法1.1動物與試劑成年雄性SD大鼠，體重250300g，由徐州醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供。aspase-3抗體、SP試劑盒購自武漢博士德公司，Bl-2和Bax抗體購自美國Santaruz公司。鹽酸東莨菪堿購自美國Siga公司，鹽酸戊乙奎醚購自成都力思特制藥公司。常規(guī)人工腦脊液(nASF)的配制(l/L)：Nal125、Kl5、NaH2P41.2、gS42.0、NaH325.7、al2H22.0、葡萄糖10。無糖ASF：以蔗糖10l/L代替葡萄糖。無鈣ASF

9、：gS410l/L，無al2H2。以上均調(diào)定pH=7.4。1.2主要儀器Ilain組織切片機(jī)(英國IKLE公司)，KD-型冰凍切片機(jī)(浙江金華科迪儀器設(shè)備公司)，2300型2孵箱(美國Sheldn公司)，三氣培養(yǎng)箱(美國Ther公司)，752分光光度計(上海分析儀器廠)。1.3模型制備大鼠乙醚麻醉，斷頭處死，立即將頭浸入0的生理鹽水中，迅速取腦，浸入預(yù)通純氧飽和的改進(jìn)人工腦脊液(ASF，4)中。別離海馬，將海馬在組織切片機(jī)上切成400厚的腦片，然后將腦片移入37的nASF。在2孵箱中平衡60in。然后將腦片移入已預(yù)先通氣(95%N2，5%2)的無葡萄糖ASF，再通入94%N2，5%2，1%2孵

10、箱中37孵育90in。取出腦片移入含葡萄糖nASF，2孵箱中37孵育60in，造成缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖，模擬人腦缺血再灌注損傷。1.4實驗分組腦片分為：正常組，模型(H/R)組，PH2l/L(PH2)組，PH10l/L(PH10)組,PH50l/L(PH50)組,S50l/L(S50)組。組分別于缺氧前參加相應(yīng)劑量的PH，組參加等體積nASF，孵育30in。取組孵育液測乳酸脫氫酶(LDH)釋放率;、組用SP法檢測海馬A1區(qū)aspase-3、Bax、Bl-2的表達(dá)。1.5LDH釋放率的測定在0.5l基質(zhì)液中分別參加各組100l上清孵育液和100l11.3l/L尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸(空白管不加),

11、37孵育15in,參加1l/L2,4-二硝基苯肼0.5l,37保溫15in,參加5l0.4l/LNaH終止反響。空白管調(diào)零點,440n波長處測光密度值。腦片勻漿后離心取上清液測定總LDH，LDH釋放率以腦片釋放于孵育液中的LDH占總LDH的百分比(LDH%)表示4。1.6SP法步驟缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖后腦片浸入4%多聚甲醛中固定6h，連續(xù)海馬冠狀冰凍切片，片厚25，進(jìn)展免疫組織化學(xué)反響：蒸餾水沖洗冰凍切片，PBS浸泡5in;3%H22室溫孵育510in，消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性;封閉液室溫孵育1015in，傾去，勿洗;滴加一抗稀釋液，放置4冰箱過夜;滴加生物素化羊抗兔二抗工作液，室溫孵育101

12、5in;滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液，室溫孵育1015in;DAB顯色，鏡下控制反響時間，雙蒸水終止反響。充分洗滌后貼片、晾干、脫水、透明、中性樹膠封片，顯微鏡觀察并拍照。第步驟后均用PBS洗(5in3次);aspase-3、Bl-2、Bax一抗稀釋比例均為1200。DAB按說明書使用;空白對照切片用抗體稀釋液代替一抗孵育，其他反響步驟一樣。光鏡下觀察到胞質(zhì)內(nèi)有棕黃色顆粒者為陽性細(xì)胞，切片采用陽性細(xì)胞數(shù)計數(shù)進(jìn)展半定量測定。每張腦片選取A1區(qū)一樣部位的2個視野，將每個視野在高倍鏡下觀察到的陽性細(xì)胞總和取平均，以陽性神經(jīng)元數(shù)/高倍鏡視野(個/HP)表示。1.7統(tǒng)計學(xué)處理所有數(shù)據(jù)均用SP

13、SS13.0軟件進(jìn)展分析。多組間比擬用方差分析法(ANVA)，兩組間比擬采用SNK法。P0.05認(rèn)為差異有顯著性。轉(zhuǎn)貼于論文聯(lián)盟.ll.2結(jié)果2.1PH對LDH釋放率的影響H/R組LDH釋放率高于正常組;與H/R組相比，PH各組LDH釋放率均降低，且隨著劑量的增加，作用逐漸增強(qiáng)(表1)。說明PH可以降低LDH釋放率。表1不同劑量PH對大鼠缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖海馬腦片LDH釋放率的影響2.2PH對大鼠缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖海馬腦片凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響H/R組Bl-2、Bax、aspase-3陽性細(xì)胞表達(dá)均高于正常組,而Bl-2/Bax比值低于正常組;與H/R組相比，PH50組和S50組Bl-2陽性細(xì)

14、胞的表達(dá)和Bl-2/Bax比值升高,Bax和aspase-3陽性細(xì)胞表達(dá)降低，但幅度沒有PH50組明顯。說明PH對以上指標(biāo)的影響才能大于S(表2)。表2PH對大鼠缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖海馬腦片凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響3討論海馬對缺血損傷非常敏感，也是與學(xué)習(xí)記憶關(guān)系最為親密的腦區(qū)。本實驗采用大鼠海馬腦片模擬人腦缺血/再灌注損傷模型，與在體實驗動物模型相比，此腦片更易控制實驗條件,排除了許多生理影響因素的干擾。LDH作為細(xì)胞內(nèi)標(biāo)志酶，當(dāng)受損神經(jīng)元由于膜通透性改變時，LDH漏出量明顯增加。LDH釋放率能很好地反映細(xì)胞損傷的程度。本實驗結(jié)果顯示，PH明顯降低大鼠海馬腦片的LDH釋放率，提示PH對缺血性腦損傷

15、可能有良好的保護(hù)作用。并且在PH50l/L時效果最好，所以選擇PH50l/L進(jìn)展機(jī)制作用討論，同時以等摩爾濃度的S50l/L作對照。凋亡在缺血性腦損傷過程中起重要作用。目前認(rèn)為至少有兩類基因與細(xì)胞凋亡的調(diào)控親密相關(guān)：一類為抑制細(xì)胞凋亡作用的Bl-2、Bl-xL5，另一類為促進(jìn)細(xì)胞凋亡作用的Bax、Bad、Bak等6。腦缺血發(fā)生時，通過觸發(fā)這些基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯,生成相應(yīng)的蛋白表達(dá)產(chǎn)物，引起細(xì)胞內(nèi)一系列生化及構(gòu)造改變,導(dǎo)致細(xì)胞凋亡7。另有研究說明，促細(xì)胞凋亡和抗細(xì)胞凋亡成員間的平衡影響著細(xì)胞凋亡的發(fā)生。其中Bl-2與Bax的比值在中樞神經(jīng)細(xì)胞凋亡中起關(guān)鍵作用8,比值高,細(xì)胞存活率高，比值低,細(xì)胞存

16、活率低。aspase-3是aspase級聯(lián)瀑布下游最關(guān)鍵的凋亡蛋白酶,它通過介導(dǎo)和執(zhí)行死亡指令，在缺血神經(jīng)元凋亡的信息傳遞中處于核心位置，被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡蛋白級聯(lián)反響的必經(jīng)之路9。本實驗研究發(fā)現(xiàn)，大鼠海馬腦片模擬人腦缺血/再灌注損傷后Bax、aspase-3表達(dá)增加，Bl-2的表達(dá)減少，Bl-2/Bax比例那么降低;而PH能降低損傷后Bax、aspase-3的表達(dá)，增加Bl-2的表達(dá)，并且使Bl-2/Bax比例升高，提示PH能減輕腦缺血后興奮性毒性引起的細(xì)胞凋亡。在本實驗中，S對腦缺血有一定保護(hù)作用，且各指標(biāo)影響趨勢同PH，但效果不如PH。可能因為東莨菪堿是非選擇性拮抗劑，阻斷1、3受體的同時

17、阻斷2受體，增加Ah的釋放，局部消減了東莨菪堿的作用。由于腦缺血損傷機(jī)制非常復(fù)雜，PH對腦缺血損傷的保護(hù)作用也是多方面的，因此對于其作用機(jī)制的討論還有待于進(jìn)一步深化。【參考文獻(xiàn)】1KuagaeY,atsuiY.utput,tissuelevels,andsynthesisfaetylhlineduringandaftertransientfrebrainisheiaintheratJ.JNeurhe，1991,56(4):1169-1117.2HanXY,LiuH,LiuH,etal.Synthesisftheptialisersfaneantihlinergidrug,penehylidin

18、ehydrhlride(8018)J.BirgedheLett，2022,15(8):1979-1982.3馬騰飛,靳榕,張晶,等.鹽酸戊乙奎醚對沙土鼠前腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用J.中國臨床藥理學(xué)與治療學(xué),2022,11(4):453-457.4KhJY,hiD.QuantitativedeterinatinfglutaateediatedrtialneurnalinjuryinellulturebylatatedehydrgenaseeffluxassayJ.JNeursiethds,1987,20(1):83-90.5AntnssnB.Baxandtherpr-appttiBl-2faily“killer-prtEinsandthEIrvititheithndrinJ.ellTissueRes,2001,306(3):347-361.6AdasJ,ryS.Bl-2-regulatedapptsis:ehanisandtherapeutiptentialJ.urrpinIunl,2022,19(5):488-496.7hipukJE,KuanaT,Buhier-HayesL,etal.DiretativatinfBaxbyp53ediates