1、異種脫蛋白骨復合物修復大段骨缺損的血管化觀察簡月奎，李起鴻，劉雷，楊柳【摘要】目的討論異種脫蛋白骨(hetergeneusdeprtEinbne，HDPB)復合物修復脛骨大段骨缺損過程中的血管化實驗研究，為異種脫蛋白骨的臨床應用提供實驗根據。方法山羊24只，在右側脛骨中下段截除脛骨總長度20形成節段性骨缺損，實驗組18只，植入異種DPB+自體Ss+rhBP2，用半環槽式外固定器固定。于術后每隔4周對3只進展股動脈墨汁灌注后處死，取新骨組織制成厚切片觀察血管化情況，以另6只植入自體骨為對照。結果術后424周，實驗組與對照組血管表現數目逐漸增多，排列漸趨規那么，血管大孝分布區域趨向均勻。測量血管數

2、目和面積，結果顯示424周2組血管數目和面積統計學分析差異無顯著性意義(P0.05)。結論異種脫蛋白骨復合物修復大動物大塊骨缺損過程中血管化程度與自體骨相當，可以作為組織工程支架材料，并對其免疫原性和成骨才能等性能進展進一步研究。【關鍵詞】異種脫蛋白骨；骨缺損；血管化；骨組織工程1材料與方法1.1主要儀器和試劑市售豬股骨;市售墨汁；20%甘露醇(西南藥業公司)；10甲醛、濃鹽酸、三氯化鐵(重慶化學試劑廠)；半環槽式外固定器(第三軍醫大學李起鴻教授研制)；超低溫冰箱(NUAIR，USA)；速眠新(軍事醫學科學院軍事獸醫研究所)；肝素鈉(天津生化制劑廠)；氯胺酮(江蘇恒瑞醫藥股份)。1.2異種DP

3、B的制備參照改進法2制備，將制備的豬DPB放入-80超低溫冰箱冷凍3個月后取出，在-700Hg真空下包裝，60照射后置-4保存。DPB于術前浸入含rhBP2濃度為75ngl3溶液中2h備用。1.3實驗動物分組山羊(第三軍醫大學動物實驗中心提供)，1012個月齡，雌雄不限，分籠喂養，體重(22.52.5)kg。隨機均分2組，按植入材料分為實驗組(異種DPB+自體Ss+rhBP2)和對照組(自體骨)。1.4山羊Ss培養及與異種DPB復合別離培養、搜集山羊Ss，調整細胞濃度為1.0106l，將細胞懸液接種于異種DPBrhBP2上，2l塊，放入37、52、飽和濕度的2培養箱中培養6h再加含15FBS的

4、DEF12培養基1l，23d后常規換液。1.5動物手術術前拍雙側脛骨X線片，測量脛骨干長度，所有動物骨缺損制備和外固定一樣，操作由同一組人員完成。半環槽式外固定器固定，所有螺母旋緊。根據X線片得到的脛骨長度，右側脛骨中下段造成20骨和骨膜段缺損4，據分組植入不同的植入物，其中Ss均來自山羊自體骨髓。術后每隔4周攝肢體正側位X線片。肌注速眠新0.08l/kg，麻醉后固定，常規條件攝片。1.6配制墨汁及灌注市售墨汁過濾后，按721的比例將墨汁、10甲醛和20甘露醇混合配制成灌注液，6層醫用紗布過濾，用前恒溫水浴加熱至38。速眠新0.08lkg與氯胺酮2g/kg肌肉注射復合麻醉后固定，肝素1000U

5、kg肌注全身肝素化，在腹股溝區切開皮膚、皮下組織，游離股、靜脈。結扎股動脈、離斷，遠端插管、固定；結扎股靜脈、離斷，遠端切開放血。快速向股動脈遠端推注大量肝素生理鹽水(每500L生理鹽水中參加肝素12500U)沖洗直至股靜脈流出清亮液體為止。然后從股動脈注入38墨汁灌注液至股靜脈流出黑色液體，皮膚趾甲變黑，結扎股動、靜脈。處死山羊，取下脛骨，低溫放置24h后10甲醛溶液中固定2周。進展大體解剖及厚切片觀察新骨血管化情況。1.7大體解剖觀察切開皮膚，暴露皮下組織和肌肉及剔除肌肉暴露骨膜，觀察皮下組織、肌肉和骨膜血管網。1.9統計方法采用SPSS13.0統計軟件進展數據處理，數值以均數標準差(s)

6、表示，采用單因素方差分析進展比擬。2結果2.1術后觀察所有實驗山羊術后傷口無潰爛、流膿，無死亡。26h清醒，并能站立進食。螺母松動后及時旋緊，無外固定松動失敗，皮膚無壞死。2d內傷肢能落地，但不能負重，2周后可以局部負重，3周能細微跛行，4周后能自由活動，無跛行。2.2大體解剖觀察肌肉和軟組織已經被墨汁黑染，皮下、肌肉筋膜和骨膜可清楚的觀察到血管大孝分支、走行方向及互相吻合呈網狀。2.3影像學觀察術后4周骨缺損區出現植入物邊緣毛糙，8周出現大小不等、形狀不規那么的透光性骨吸收區。術后12、16、20、24周，2組表現為時間依從性的骨修復，表現為骨缺損區兩斷端之間高密度鈣化影，新生骨與兩斷端完全

7、相連接，大局部塑形，可見髓腔影(圖1)。表12組術后不同時間點新骨血管數目比擬略2組比擬：P0.05表22組術后不同時間點新骨血管面積比擬略兩組比擬：P0.053討論異種骨的應用主要是免疫原性和成骨才能，而移植后的血管化及其速度是評價去除免疫原性程度的一項重要指標，去免疫原性的程度能為受植的動物所耐受。對新骨能否生成，血管化過程對骨再交融方式起決定性作用3，以往作為骨移植材料制備的異種骨多作為單純的充填物，或添加自體細胞或生長因子進展研究，這些實驗在小型動物實驗或大型動物小段骨缺損修復獲得了成功4。在修復骨缺損的部位上，李曉輝等5添加堿性成纖維細胞生長因子與局部脫蛋白骨復合修復家兔股骨頭缺損獲

8、得良好的效果，但在大型動物的大段骨缺損，特別是在血供較差，肌肉覆蓋較少的脛骨中下段修復報道較少。作者的改進法在制備過程中盡量保存膠原蛋白，去除非膠原蛋白、肽類及脂類、細胞等，顯著降低了抗原性，同時保存了良好的力學強度、天然的網狀孔隙系統，為細胞的黏附、增殖及分化提供良好的三維空間構造，并參加骨誘導性細胞因子rhBP2，在植入前復合山羊自體Ss，使復合物既具有骨傳導性，又具有骨誘導性，促使其成骨才能增強。在一系列理化性能檢測、平安性及小動物免疫原性及成骨研究的根底上6，本實驗在修復羊脛骨干大段骨缺損過程時對組織工程骨的血管化問題進展了研究，結果顯示，所有實驗組山羊術后傷口無潰爛、流膿，無死亡，影像學顯示對骨缺損有完全修復。血管化過程表現為血管數量逐漸增多，血管分布逐漸均勻。血管面積圖像分析結果顯示實驗組與自體骨移植修復組比擬，2組新骨的血管化程度經統計學分析差異無顯著性意義(P0.05)，說明本組研制的異種脫蛋白骨復合物修復大動物長骨大段缺損的血管