1、膠質瘤分子病因研究【摘要】隨著高通量分子生物技術的完善，尋找膠質瘤確切的分子病因成為可能。在基因工程鼠模型制作過程中發現了多個癌基因和抑癌基因的敲除、轉入或轉染后發生了類似人類的惡性浸潤性膠質瘤，但所謂的“癌前期變的責任分子尚未明確。膠質瘤干細胞的研究成功和迅速開展為之開拓了新途徑。膠質瘤干細胞、神經干細胞和正常膠質細胞三者間能否轉化、轉化條件的探究是當今研究的膠質瘤分子病因的新策略。在神經干細胞向膠質瘤干細胞演變過程中尋找上述的責任分子是研究者看好的新途徑。【關鍵詞】膠質瘤膠質瘤干細胞神經干細胞分子病因leularEtilgyfGliaAbstrat：ithprgressntehniques

2、fhigh?鄄thrughputleularbilgialdetetin,itispssiblentpursuethepreiseleularetilgyfglia.alignantinvasivegliaslikehuanunterparthavebeenbtainedingenetiengineeringiedelshenknkut,knk?鄄inrtransfetedithseveralngenesrtursuppressrgenes.Hever,definiteleularpathaysrespnsiblefr“pre?鄄anerhangeKeyrds：glia;gliasteells

3、;neuralsteells;leularetilgy雄性原核中，然后轉入假孕鼠輸卵管，試圖制作基因工程鼠腫瘤模型，遺憾的是在仔鼠中未發生膠質瘤。直至1995年，AndreDanks用星形細胞特有的骨架蛋白GFAP基因和抑制p53抑癌基因蛋白活性的SV40Tag基因結合導入受精卵雄性原核制作成功的基因工程鼠，產生了低惡性星形細胞瘤，但SV40是病毒基因，并不是人源基因。進入21世紀，研究者用多種基因修飾的方法制作膠質瘤發生的分子模型獲得成功，提示膠質瘤分子病因研究進入了新時代。1基因工程鼠與膠質瘤分子病因近幾年，采用基因轉染、基因敲除等方法已經建立了一批膠質瘤基因工程鼠。實驗發現，Ras、V?

4、鄄Sr、Rb和SV40與星形細胞瘤發生有關：把一個含有GFAP啟動子及V12H?鄄Ras的基因轉入鼠胚胎細胞后能開展成星形細胞瘤2。也有用GFAP調控元件控制下的V?鄄Sr激酶制作而成3。還有通過Rb家族蛋白質特定性滅活制作的4。轉染的SV40T抗原能抑制p53也能產生星形細胞瘤。PDGFR，RAS/tv?鄄a，INK4a?鄄Arf與少突膠質細胞瘤發生有關：采用RAS/tv?鄄a轉基因系統，假如轉到的是GFAP高表達的成熟細胞中，約40%的鼠產生少突細胞瘤或混合型少突細胞瘤；假設把tv?鄄a轉基因鼠與缺少INK4a?鄄Arf基因位點的次級鼠雜交繁殖那么能增加間變性少突膠質瘤的發生率。也有在超聲

5、成像指引下直接把荷有PDGF?鄄B基因的LV載體注入胚胎鼠腦內，產生多種類型腫瘤，其中少數的是少突細胞瘤，多數的是膠母細胞瘤5。Ras、Akt、Nf1、is與多形性膠質母細胞瘤發生有關：把Ras和Akt結合轉入Ntv?鄄a轉基因小鼠可誘導產生膠質母細胞瘤，而僅把其中之一注入就沒有見到腫瘤形成6，假設兩者同時轉入帶有失活等位基因INK4a?鄄ARF的Ntv?鄄a小鼠那么能加速膠質母細胞瘤的形成。也有用p53敲除鼠和Nf1以及is雜合子敲除鼠交配而產生Nf1和p53雙沉默鼠模型7，可產生星形細胞瘤或膠質母細胞瘤。Pth、SHH、p53和Rb與髓母細胞瘤發生有關：用Pth敲除方法制作的Pth+/?鄄

6、鼠在12個月內形成髓母細胞瘤的發生率為14%19%8，假設再與p53缺陷鼠交配，其后代的髓母細胞瘤發生率上升到95%9。也有用帶有逆轉錄病毒載體的SHH在超聲成像系統指引下直接注入胎鼠小腦制作髓母細胞瘤模型獲得高發生率者10。結合敲除小腦外顆粒細胞層中的神經祖細胞的p53和Rb也能產生髓母細胞瘤11。2從膠質瘤起源細胞中找分子病因研究膠質瘤的分子病因，其起源細胞存在爭論。回憶歷史，早在上個世紀20年代Bailey和ushing提出瘤的起源細胞來自其同名的正常細胞，理由是在顯微鏡下觀察到星形細胞瘤的形態象星形細胞，少突膠質瘤的細胞形態象少突膠質細胞等。當這些腫瘤變得更加惡性時，細胞形態象其低分化

7、的前體細胞，因此把惡性星形細胞瘤稱為星形母細胞瘤。到了上個世紀下半葉，通過電子顯微鏡觀察和免疫組化GFAP證實，星形細胞瘤由表達星形細胞分化特征的細胞組成。我們在先前的膠質瘤細胞誘導分化實驗中12，也見到了瘤細胞由雙極梭形向多極星形方向分化，成熟星形細胞特有的標記蛋白GFAP的表達量也隨之增加。鑒于此，膠質瘤是由正常的膠質細胞在特定的情況下轉化而來的學說，幾乎沒有人疑心過。其實Bailey和ushing關于膠質瘤起源細胞學說，至少對神經節膠質細胞瘤和少突星形膠質瘤的細胞起源問題不能圓滿解釋。因為前者同時存在瘤性神經元和瘤性星形細胞，后者同時存在少突和星形兩種瘤細胞。假設用起源于其前體細胞或干細

8、胞來解釋，在理論上是成立的13，因為神經干細胞可分化成神經元和膠質細胞，膠質祖細胞可分化成少突細胞和星形細胞。神經干細胞具有遷移性和多向分化特征，當受到“致癌性刺激時，發生的分化既有正常細胞，又有瘤性細胞多向分化特征。這種理論推導，在后來的實驗中得到了部分證實，如Hlland6，轉導Ras、Akt、PDGF和Ink4a-等基因于膠質祖細胞的實驗中，從獲得的基因工程鼠腫瘤標本來看，無論在形態和浸潤性等方面都非常象人的膠質瘤，而不象既往移植于裸小鼠，缺乏浸潤特征的可移植性膠質瘤。3從腫瘤干細胞、神經干細胞和正常膠質細胞轉化關系中尋找膠質瘤的分子病因對一個膠質瘤患者來說，機體中存在膠質瘤干細胞gli

9、asterells、正常膠質細胞nralgliyte和神經干細胞neuralsteells，它們之間存在何種關系見圖1，這是筆者在兩年前提出的假設14，根據最新進展加以修改成示意圖。它們之間在特定條件下是可以轉化的，其中實線箭頭之間的轉化已經得到公認，虛線箭頭之間的轉化已有實驗得到部分證實，空心箭頭之間尚未有人提出它們之間的相關性。從將來的分子程度研究前景來看，預計無論是順時針還是逆時針方向均有可能發生轉化，有的僅是其轉化的分子條件不具備，所以看不到轉化。例如神經干細胞向正常膠質細胞分化，在胚胎發育的研究中早已得到證實。而正常膠質細胞返回到神經干細胞，既往認為是不可能的，而如今已有實驗證實，神

10、經干細胞向正常膠質細胞分化的過程中，至少有部分階段是可逆的15，16。又如，腫瘤細胞誘導分化的實驗，可以將膠質瘤細胞返回至正常膠質細胞也有部分實驗得到證實。我們早先的實驗也看到了這種轉化現象17。再往前追溯，上個世紀60年代，Piere在鼠畸胎癌的實驗中18，發現癌細胞可以自發地向良性甚至是正常細胞方向分化。在臨床上，偶爾也能見到經病理證實的癌腫出現自發消退。神經干細胞向膠質瘤細胞轉化的可能性雖然尚無直接證據，但作為一個推理已經受到了神經腫瘤學界的高度關注6，14，特別是膠質瘤干細胞的研究迅速進展19，已有充分證據證明，膠質瘤組織中存在類似于腦組織存在的具有多向分化潛能干細胞20，膠質瘤干細胞

11、是直接生成膠質瘤的細胞，由于它們之間存在許多相似性，已有人推測膠質瘤細胞由神經干細胞轉化而來。然而膠質瘤細胞向神經干細胞轉化，尚未見報道，但有許多跡象說明，兩者之間存在著目前還無法說清楚的淵源關系。例如我們正研究的SHG?鄄44人腦膠質瘤細胞中存在著為數不多的D133+和為數不少的Nestin+細胞，這與我們先前研究的人胚胎神經干細胞表達的D133和Nestin蛋白的情況非常相似21，22。我們還在神經節細胞膠質瘤惡化和神經干細胞分化過程中用RT?鄄PR方法檢測到了共同調控分化基因D223。還有曾一度作為神經干細胞的標志物Nestin在許多膠質瘤細胞系和實體瘤組織中表達24，都能說明這一點。不

12、僅如此，令人感興趣的是腦內神經干細胞還有向膠質瘤遷移的特征，如Abdy等25將神經干細胞注入荷瘤鼠腫瘤部分，它最終能遍布整個腫瘤，并隨腫瘤細胞一起向其它部位遷移；假如注入腦內遠離腫瘤的部位，神經干細胞還會穿過正常腦組織向腫瘤遷移。因此，我們不妨作個推測，臨床膠質瘤標本中有可能同時存在神經干細胞和腫瘤干細胞，至少是在腫瘤發生的早期是這樣。正如前述，神經干細胞和腫瘤干細胞共同表達D133和Nestin蛋白，它們之間的鑒別和是否可以轉化，有待進一步研究證實。當然這種研究的難度大，風險性也高，但客觀條件日趨成熟，如人類基因組草圖已經完成，GeneBank中收錄的核酸序列高達1700多萬條，Siss?鄄

13、pr蛋白質數據庫中收錄蛋白質序列也有11萬多條可供檢索26。隨著高通量基因檢測手段不斷完善27，集分子生物學、數學和計算機科學為一體的生物信息學的產生和應用28，即從高科技的開展速度來看，在不久的將來，從分子程度有可能說明如圖1所示的神經干細胞、正常膠質細胞、膠質瘤細胞三者之間的關系，膠質瘤的分子病因也就隨之揭曉。4小結研究膠質瘤的分子病因較消化系等其它腫瘤要難得多，原因是后者無論在臨床上，還是在實驗動物的研究上都可明確從正常細胞演變至癌前病變、原位癌、浸潤和轉移等各個階段，而膠質細胞的“癌前病變階段很難確立，因為它在一般情況下較少增生，雖然在外傷和某些炎癥等情況下可以發生反響性增生，但沒有流行病學資料支持膠質瘤的發生與膠質細胞反響性增生有關。在已經制作成功的基因工程鼠腦膠質瘤模型中也沒有見到膠質瘤的“癌前變化，而一開場就是H分類屬于級和級以上的惡性度高的膠質瘤。從目前的膠質瘤分子生物學研究成果來看，受上述條件限制，僅對膠質瘤發生后惡性進展的信號傳導通路有所