1、-. z.同源模建的方法與結果分析序言：作為一個以實驗為主的生化工作者來說，很多時候可以通過分子生物學手段獲取自己需要的目的基因，并在各種表達載體和宿主中進展對應蛋白的表達，隨后對于這些蛋白的特性進展研究，這也是一般酶學研究的特定套路。而近十幾年來，人們開場思考是否能夠將特性與蛋白質的三級構造進展關聯，從分子水平理解蛋白質與底物之間的相互作用呢？于是類似于蛋白構造模建、分子對接、分子動力學模擬、量化計算等多種手段相繼被創造以及應用。在這些方法中，同源模建無疑是最根底也是最重要的一個步驟，因為其質量的好壞直接決定了后續工作是否可信。因此，本文打算就同源模建的根本原理、常用軟件及效勞器以及結果分析

2、與改良提供一些個人的經歷，并希望各位朋友能夠給予批評指正。同源模建的原理及應用限制兩點根本原理：1.一個蛋白質的構造由其氨基酸序列唯一的決定。知道其一級序列，至少在理論上足以獲取其構造2. 構造在進化中更穩定，變化比序列層面的變化要緩慢許多。應用限制：模板蛋白和目標蛋白的序列一致性需要大于30%，且越大建模準確性越有保障。了解了根本的原理，我們需要知道在實際操作中，同源模建都需要怎么樣進展。同源模建的過程從實踐中可分為以下7個步驟：模板識別和初始比對在序列一致性比擬高的時候，可以通過簡單的序列比對程序如BLAST獲取目標蛋白的構造將比對的數據庫選擇為PDB數據庫。比對結果的校正用以上的方法確定

3、一個或多個建模模板后，應該采用更為準確的方法已取得更優的比對結果。有時在序列一致性較低的區域比對兩條序列可能會具有困難，這個時候，我們可以采取其他同源蛋白序列一起參與比對來找到解決的方法。主鏈生成比對完成后，就可以開場實際的建模過程了，相對與后面幾步來說，主鏈建模時最沒有難度的一步了，因為大局部軟件都是通過簡單的拷貝模板蛋白的主鏈坐標來實現這一目的的。環區建模這一局部主要是目標蛋白和模板蛋白的比對結果中存在缺口的局部如何處理的問題。第一種解決的方式是略去模板蛋白存在的殘基，留下一個必須補上的缺口。另一種情況是將主鏈截斷，插入缺少的殘基。側鏈建模當我們比擬構造相似的蛋白質中保守殘基的側鏈構象時，

4、我們會發現他們的側鏈構象通常會比擬相似。這就告訴我們如果加保守殘基的側鏈構象完整的拷貝到模建蛋白上時，在*些時候比先拷貝主鏈構象之后，再預測側鏈構象來的可靠。但是這一經歷規則在實際運用中僅在兩者序列一致性較高，并且保守殘基之間形成接觸的情況下才能實現。因此，在現有的測序中，都是構造各種可能的構象體，并利用基于能量的函數打分來實現側鏈構象的選擇的。模型優化模型優化其實是一個比擬復雜的問題，其質量依賴于高準確性的預測側鏈構象體，而為了到達這種目的，我們需要正確的主鏈，這一步驟實際又依賴于側鏈構象體正確的堆積。因此，這一優化過程是迭代直至收斂的過程。需要注意的是，對于構造進展能量優化需要十分慎重。因

5、此偏離正確構造的途徑比指向正確構造的途徑多很多。在優化中的每一步可以排除一些大的誤差，但是也會引入很多小的誤差，這些小的誤差經過多步積累，就有可能使你的結果更加偏離正確的構造。模型驗證所有的模型都包含誤差，誤差的多少主要依賴于兩方面的容：1.序列一致性的上下，越低的話引入誤差的可能性就越大。2. 模板蛋白中的誤差：如果這種誤差是局域性的，尤其是遠離活性位點的，對于你最后進展分子對接等研究室幾乎沒有影響的。如果是蛋白整體的，則需要小心處理。常用軟件、效勞器2.1常用效勞器： = 1 * GB3 SWISS-MODEL: 網址SWISS-MODEL可能是目前非專業人士應用最為廣泛的一個在線建模效勞

6、器了。其常見的模式可分為：Automated mode:自動模式，可以稱為是最傻瓜的方式了進去之后只需要填上你的email以及在底下的框框輸入你所想模建的蛋白序列，再點擊submit modeling request即可，底下還有高級選項，支持自定義模板蛋白的pdb以及chain，或者自己上傳模板文件，簡而言之，真是非常易于操作。這種方法適用于PDB數據庫中存在高度同源的蛋白構造時的建模(蛋白序列一致性最好大于80%，個人經歷)Alignment mode:比對模式根本的操作和自動模式類似，但是其序列提交的時候可以提交目標蛋白與模板蛋白的序列比對結果(FASTA,MSF,ClustalW等格式

7、)，如下所示：這種模式比擬適合目標蛋白與模板蛋白具有較高的相似性，但是利用自動模式未必能找到最適宜模板的情況，或者使用者有目的的使用特定的模板蛋白(比方具有更為相似的活性位點結果，而不是更為相似的整體構造)Project mode:工程模式工程模式主要是針對于目標蛋白和模板蛋白序列的相似性不高，兩者的三級構造相似程度難以直接通過序列比對獲得，需要人工插入調節(借助蛋白構造編輯軟件deepview)，這個模式能夠交互式的提高前面兩種模式的模型質量(通過將前兩種模式模建出的蛋白進展人為調整)。屬于針比照擬困難(序列一致性較低)的建模的一種有效途徑。 = 2 * GB3 I-TASSAR: (貌似被

8、墻了？)*也可以下載本地安裝包個人使用評價：根據結果質量檢驗，貌似在用過的自動建模的軟件里是結果最好的了不過缺點是給結果時間比擬長。 = 3 * GB3 HOMER: 個人使用評價：這個軟件需要序列蛋白與模板蛋白的構造比對文件上傳(FASTA格式)，可對模建的蛋白進展loop區優化以及側鏈優化。尚未深入的研究 = 4 * GB3 CPHmodels 3.2 Server：個人使用評價：貌似沒有任何特色，只需要一條蛋白序列既可以完成自動建模。常用軟件： = 1 * GB3 Modeller:說到同源模建，不得不提其名鼎鼎的modeller, 要是做同源模建的娃們沒有聽過modeller, 實在是

9、不好意思說自己玩轉了同源模建的。哈哈該軟件由Sali lab開發，目前最新的版本是9.11，可在win下和linu*運行，需要對應版本的python 3.0。該軟件好在什么地方呢？主要是可以自己控制的地方特別多，但這個也給新手帶來了不少困擾，比方終究在特定的場合用什么參數等等。(本人將在自己以后的學習過程中繼續分享對這個軟件的學習心得，真的是挺有意思的)可實現的功能包括：多聚體建模，二硫鍵建模，雜原子建模(配體、輔酶等)。具體的運算流程稍后補充：其最成熟的GUI為 easymodeller，最新版本為4.0。使用方法稍后補充。同源模建結果評價與改良策略在我們通過各種軟件構建出一個蛋白的同源模型

10、后，我們如何評價這一模型是否準確？如果不準確如何進展進一步的修飾能使其更好的應用于我們的后續模擬中呢？這些問題將在本節得以討論同源模建結果的評價本人最常使用的構造檢測方法來源于UCLA-DOE的SAVES效勞器，其網址為：提供的檢測工具包括5種方法：PROCHECK: 該程序可以給出特定蛋白質模型的一系列立體化學參數，并且能以直觀的彩圖輸出局部結果。該方法的原理主要是通過對蛋白質數據庫中高分辨的蛋白晶體構造的參數進展整理，作為標準參數。將輸入蛋白構造所具有的參數與標準參數進展比照，如果兩者差異顯著，則說明輸入的蛋白構造存在明顯問題。其輸出的結果包括：拉氏圖，主鏈的鍵長與鍵角，二級構造圖，平面側

11、鏈與水平面之間的背離程度等。WHATCHECK:包含大量的檢測項，可以針對給定的蛋白構造與正常構造之間的差異，產生一個非常長而且詳細的報告。ERRAT: 計算0.35 nm圍之，不同原子類型對之間形成的非鍵相互作用的數目。原子按照C、N、O/S進展分類，所以有六種不同的相互作用類型：CC、CO、 NN、 NO、 OO。如果這些相互作用類型出現的頻率與正常值相比有較大的區別，蛋白質模型的質量就值得疑心了通常使用9個氨基酸長度的滑行窗口用于獲得每一個窗口的相互作用頻率。類似的分析方法可以用于定位局部有問題的區域。Verify_3D: PROVE: 該程序可以比擬給定構造的原子體積與預先計算好的一系

12、列標準體積之間的差異。體積的計算方法采用Voronoi polyhedra幾何模型，通過在原子及其鄰近原子間放置一個個分散的平面來定義每一個原子占據的空間。以下以我研究的一個酶C-C鍵水解酶BphD的模型進展實例講解：背景：首先利用BLAST進展蛋白一致性搜索，找出最適宜的蛋白模板，經確定為2OG1，以此蛋白構造為模板，利用modeller進展模建，得到我們的BphD的初始構造，提交到SAVES效勞器進展處理：PROCHECK結果：本局部主要需要的是拉氏圖，在第一行中可以點擊ps格式、PDF格式以及JPG格式進展下載，我下載了個PDF文件，大家可以看看下面的截圖：這個效勞器最好的一點就是可以提

13、供處于各個區域的氨基酸殘基占總數的百分比。拉氏圖的結果主要分成4個區域：核心區域，允許區，大致允許區以及禁阻區。從圖中可以看到大局部的氨基酸殘基均位于核心區域 (95.9%),落在允許區和大致允許區的各有1個殘基，而處于禁阻區的只有殘基Ser112。通過我們對這個蛋白本身的了解可知，Ser112為該水解酶的催化三聯體，其模板蛋白的Ser112同樣處于禁阻區。接下來我們看看ERRAT的結果，該結果中Overall quality factor值越高越好，一般高解析度的晶體構造該值可以到達95，而對于解析度一般的來說該值只能到91%左右。本例中的ERRAT值為89.928,已經比擬接近低解析度的晶

14、體構造了，但是應該還有繼續改良的空間。在圖中存在的兩條誤差限表示的是位于其線以上的區域有多大的可能性是有問題的區域。根據這一結果，可以看出從殘基120-150之間是一個需要高度注意的區域，另一個需要注意的區域是250-255。從BphD的PDB構造來看這兩段主要是loop區，本身具有較大的彈性，因此再接下來的過程中可能需要重點關注這一段構造的優化。其他的參數如verify_3D等數值較好，在本例中未詳細給出，將在下一個修改版中放出首先，我們考慮采用計算量較少的chiron效勞器對模建構造的clash進展處理。其結果給出原始蛋白構造中存在的構造間的沖突以及其修正后的結果與原始構造的疊合結果。接下來我們利用SAVES對于經過處理的蛋白