1、 第十三 - 十五章基因表達調控及重組DNA技術2主要內容 基因及基因表達調控相關概念 原核基因表達調控基本原理 真核基因表達調控基本原理 重組DNA技術相關概念 重組DNA技術基本原理 負載特定遺傳信息的DNA片段，包括：DNA編碼序列、非編碼調節序列和內含子序列。 基因 （Gene）基因組（Genome） 來自一個遺傳體系的一整套遺傳信息原核：單個環狀染色體所含的全部基因真核：一個生物體的染色體所包含的全部 DNA，又稱染色體基因組線粒體基因組葉綠體基因組Human Genome人類基因組計劃（Human Genome Project, HGP） 1985年美國提出 計劃投入30億美元，1

2、5年完成 1990年正式啟動 英、法、德、日、中國等先后加入中國的任務： 人類3號染色體短臂上一個約30Mb區域的測序， 該區域約占人類整個基因組的1。年10月 啟動2000年 6月 完成草圖2001年 2月 nature公布草圖 Nature, 409 (6822): 860-921, 2001 2004年 10月 nature公布精度 99%的測序圖 人類基因數：2 - 2.5萬 Nature, 431 (7011): 931-945, 2004HGP的進展The post-genome era is coming譜主為生物學大師耗資200萬完成 盼未來降價普及 助提早預防疾病“ 生命天書

3、” 首份個人基因圖公布 (2007.5.30) James Waston 基因表達調控是指細胞生物接受環境信號刺激或適應環境營養供給狀況的變化，在基因表達水平上作出應答反應的分子機制。重組DNA技術本質上是一項生物技術，目的在于通過人工重組DNA的方法，獲得某一目的基因的無性繁殖系DNA克隆，或使目的基因在一定的表達體系表達有特殊意義的蛋白質。主要研究內容：基因表達方式、規律、調節機理10第一節 基因表達調控11一、基因表達的概念* 在各種調節機制控制下，從基因激活開始，經歷轉錄、翻譯等過程產生具有生物學功能的蛋白質分子，從而賦予細胞一定的功能或表型，或使生物體獲得一定的遺傳性狀。 DNA R

4、NA蛋白質轉錄翻譯逆轉錄簡單定義：轉錄 翻譯廣義：包括 rRNA、tRNA的表達13二、基因表達調控的意義 生物體基因數量很多，但在某一特定時期只有一小部分基因處于活化狀態，能進行轉錄（例如，真核細胞約25基因具轉錄活性）。因此，機體內存在著復雜的調節機制，調節基因的表達。通過調控基因的表達，使生物體適應環境、調節代謝、維持其生長與繁殖。基因表達調控的意義：14三、基因表達的規律* 階段特異性 （時間特異性） 組織特異性 （空間特異性）15 階段特異性 （時間特異性）甲胎蛋白 某一特定基因的表達嚴格按一定的時間順序發 生，稱時間特異性* 多細胞生物的不同基因在不同發育階段按特定 時間順序開啟和

5、關閉，稱階段特異性*哺乳類nAChR： 胚胎型2(煙堿型乙酰膽堿受體) 成年型216 組織特異性 （空間特異性）在個體生長的某一階段， 不同細胞有不同基因表達胰島素：胰島細胞血紅蛋白：紅細胞鳥氨酸循環酶類：肝細胞X YX Y AB17四、基因表達的方式 有些基因的產物對于生物體的整個生命過程都是必不可少的，這類基因在生物體的幾乎所有細胞中持續表達，這類基因被稱為管家基因。這類基因的表達稱為基本的基因表達* 。例如：葡萄糖酵解途徑中各種酶的編碼基因基本的基因表達也是在一定機制控制下進行（一）基本的基因表達18（二）可調節的基因表達 與管家基因不同，另一些基因表達狀況極易受外環境變化的影響，隨外環

6、境變化，這類基因表達水平可升高或降低,又稱適應性表達；又稱奢侈基因。 特點：不是細胞生命必不可少的 表達受外環境的影響較大，不恒定表達 有間斷性和空間特異性 誘導 基因表達水平在特定環境中增高的現象 這類基因叫可誘導基因阻遏基因對環境信號應答表現為表達水平降低這類基因叫可阻遏基因 DNA損傷：DNA損傷修復酶被誘導 色氨酸供應充足：參與合成色氨酸的酶被阻遏20五.基因表達的多級調控基因表達調控在多級水平上進行基因激活 轉錄起始* 轉錄后加工及轉運 mRNA降解 翻譯及翻譯后加工 蛋白質降解21六、基因表達調控原理以mRNA轉錄為例DNA元件 調節蛋白RNA聚合酶活性*調控要素（一）轉錄起始調節

7、基因表達 （1） DNA元件：具有調節功能的特異DNA序列操縱子：由功能上相關的一組酶或蛋白質基因在染色體上串聯一起并共同享用同一表達調控的DNA組件所構成的一個轉錄單位。操縱子調節序列編碼序列：編碼蛋白質啟動序列：結合RNA聚合酶操縱序列：結合阻遏蛋白*1、原核生物 操縱子結構編碼序列 啟動序列 操縱序列其他調節序列(promoter)(operator)PO(coding sequence) 原核生物啟動序列（啟動子）RNA轉錄起始-35區-10區TTGACATTAACTTTTACATATGATTTTACATATGTTTTGATATATAATCTGACGTACTGTN17N16N17N16

8、N16N7N7N6N7N6AAAAAtrp tRNATyrlacrecAAra BAD TTGACA TATAAT一致序列 （2）調節蛋白特異因子 決定RNA聚合酶特異識別并結合 啟動序列的能力（因子）阻遏蛋白 與操縱序列結合，抑制RNA聚合酶活性 （負性調節）激活蛋白 促進RNA聚合酶活性（正性調節） （3） RNA聚合酶活性 DNA元件與調節蛋白對轉錄激活的調節作用最終由RNA聚合酶活性體現。 啟動序列或啟動子的結構、調節蛋白的性質對RNA聚合酶活性影響最大。 2. 真核生物（1） 順式作用元件：（2） 反式作用因子： （3） mRNA轉錄激活及其調節28第二節 原核基因表達調控與真核基因

9、表達調控的基本原理29一、原核基因表達及其調控的特點 1、轉錄與翻譯兩過程緊密偶聯 3、操縱子調節機制中普遍存在阻遏蛋白介導 的負性調節*2、普遍存在操縱子調節機制阻遏蛋白操縱序列結合阻遏解聚結合去阻遏 阻礙 4、轉錄產物為多順反子mRNA 5、轉錄起始是基因表達調控的最關鍵環節*多順反子mRNA：多個功能相關的基因串聯， 轉錄產物在 一條mRNA上，翻譯產物為多個多肽鏈31二、操縱子理論通常一個操縱子含有一個啟動序列及數個編碼基因（26個，甚至更多），還有其它調節序列。 編碼序列 啟動序列 操縱序列其他調節序列(promoter)(operator)PO(coding sequence)操縱

10、子結構32乳糖操縱子調節機制 阻遏蛋白的負性調節 CAP的正性調節 協調調節 乳糖操縱子結構 CAP結合位點P IIPOZYA調控區結構基因I: 阻遏蛋白編碼基因PI: 阻遏蛋白基因啟動序列Z: -半乳糖苷酶Y: 透酶A: 乙酰基轉移酶結構基因O:操縱序列（阻遏蛋白結合部位）P:啟動序列CAP結合位點調控區 1. 阻遏蛋白的負性調節（無乳糖） *阻遏蛋白與O序列結合, 抑制轉錄, lac操縱子關閉阻遏蛋白mRNACAP結合位點P IIPOZYARNA聚合酶 誘導劑結合于阻遏蛋白，阻遏蛋白與O序列解離，轉錄抑制解除，lac操縱子開啟乳糖別乳糖CAP結合位點P IIPOZYAmRNA 阻遏蛋白的負

11、性調節（有乳糖） * CAP: 分解代謝基因激活蛋白 catabolite gene activator protein同二聚體cAMP 結合區 DNA 結合區 2. CAP的正性調節（無葡萄糖） *cAMPCAP蛋白P IIPOZYACAP結合位點mRNA無葡萄糖，cAMP濃度高cAMP與CAP結合 與CAP結合位點結合轉錄活性提高約50倍 CAP的正性調節（有葡萄糖） *cAMPCAP蛋白P IIPOZYACAP結合位點mRNA有葡萄糖，cAMP濃度低cAMP與CAP結合受阻轉錄活性下降 阻遏蛋白mRNACAP結合位點P IIPOZYARNA聚合酶 3. 阻遏蛋白與CAP的協調調節*（1）

12、無乳糖時, 阻遏蛋白封閉轉錄， CAP無作用 （2） 有乳糖時, 乳糖操縱子去阻遏, 雖可轉 錄, 但活性很低, 必須由CAP的正性調節來加強P IIPOZYACAP結合位點mRNA THANK YOUSUCCESS2022/7/2641可編輯 乳糖操縱子強的轉錄活性既需要乳糖存在又需要缺乏葡萄糖43（一）真核基因結構特點 1. 轉錄產物為單順反子 一個基因 一條mRNA 一條多肽鏈2. 重復序列 高度重復序列、中度重復序列、單拷貝序列3. 基因不連續性 非編碼序列 內含子12353三、真核基因表達調控 （二） 真核基因轉錄特點活性染色體結構變化 對核酸酶敏感、甲基化程度降低、 組蛋白乙酰化修

13、飾2. 正性調節占主導 真核RNA聚合酶對啟動子的親和力極小或根本沒有 實質的親和力，轉錄起始需依賴多種激活蛋白的作用3轉錄與翻譯分隔進行 轉錄在核內進行，翻譯在胞漿進行45 轉錄（起始）調節實質上是調節蛋白與DNA的相互作用 1、順式作用元件：2、反式作用因子： 3、mRNA轉錄激活及其調節（三）真核基因轉錄激活調節 1. 順式作用元件* 指結構基因兩側或內部具有調節功能的DNA序列，因其作用于自身分子并發揮作用，所以稱順式作用元件。 根據位置、性質及作用方式的不同分為啟動子、增強子和抑制子。47 真核生物 順式作用元件結構基因序列 啟動子(promoter)P 抑制子(silencer)

14、增強子(enhancer) 增強子(enhancer)48RNA聚合酶II啟動位點周圍一 組轉錄控制組件常見組件： TATA盒（TATAAA） -25bp -30bp GC盒 （GGGCGG） CAAT盒（CCAATC）CAAT盒GC盒TATA盒轉錄起始點-30bp -110bp啟動子 promoter 增強子* ： 遠離轉錄起始點、決定組織特異性表達、增強啟動子轉 錄活性的特異DNA序列，其發揮作用的方式與方向、距 離無關。 抑制子* ： 對啟動子轉錄活性起抑制作用的 DNA序列 負性調節元件 2、反式作用因子（轉錄因子） 轉錄因子、轉錄調節因子、轉錄調節蛋白 基本轉錄因子 轉錄激活因子 轉

15、錄抑制因子 絕大多數轉錄因子屬于反式作用因子*真核生物：由某一基因表達后，通過DNA-蛋白質或蛋白質-蛋白質相互作用控制另一基因的轉錄。 AB RNA聚合酶結合啟動子所必須的一組轉錄因子 基本轉錄因子FEBDARNA pol TATADNATATA TFD TFA TFB TFF TFERNA pol 轉錄激活因子 （正性調節因子） 通過DNA蛋白質、蛋白質蛋白質相互作用起 正性調節作用的轉錄因子。 轉錄抑制因子 （負性調節因子） 通過DNA蛋白質、蛋白質蛋白質相互作用起負 性調節作用的轉錄因子。與增強子結合的轉錄因子與抑制子結合的轉錄因子55真核RNA聚合酶II不能單獨識別啟動子，而是由基本

16、轉錄因子TFIID識別并結合啟動子，形成TFIID啟動子復合物，然后有一系列的轉錄因子（如TFIIA、TFIIB、TFIIE、TFIIF等）加入形成前起始復合物，調節轉錄的起始。3mRNA轉錄激活及其調節56第三節 重組DNA技術基因重組（genetic recombination） 自然發生的基因重排 真核、原核均會發生 基因變異、物種演變、生物進化的基礎基因工程（genetic engineering）重組DNA技術人工進行基因重組58 克隆*(名詞)：就是指來自同一母本的所有副本或 拷貝的集合。 克隆化（動詞）：獲取同一拷貝的過程。二、重組DNA技術相關概念母本克隆cloneclonin

17、g（一） 克隆與克隆化 細胞克隆： 從大量群體細胞中分離出某一種類型細胞， 經擴增獲得這樣一類相同的細胞。在分子生物學領域所說的分子克隆專指 DNA克隆(DNA cloning)。 分子克隆： 從眾多不同的分子群體中分離到的很多相同分子的集合。60（二）重組DNA技術* 應用酶學的方法，在體外將各種來源的遺傳物質（目的基因或目的DNA）與載體DNA連接成復制子，然后通過轉化或轉染等方法導入宿主細胞，生長、篩選出含有目的基因的轉化子細胞。轉化子細胞經擴增、提取，獲得大量目的DNA的無性繁殖系，即DNA克隆，基因工程。 目的 DNA 載體DNA連接復制子（重組DNA）導入宿主細胞 （轉化或轉染）轉

18、化子細胞轉化子細胞擴增，可獲得大量重組DNA 基因克隆DNA 克隆重組DNA同一概念生物技術工程基因工程、細胞工程、酶工程、蛋白質工程 獲得DNA的無性繁殖系 獲得目的基因的表達產物重組DNA的目的 63（三） 工具酶限制性核酸內切酶連接酶DNA聚合酶反轉錄酶多聚核苷酸激酶 限制性核酸內切酶*識別和切割雙鏈DNA分子內部特異核苷酸序列的一類核酸酶。限制性核酸內切酶共分三類，基因工程常用II類酶，這類酶常識別DNA的回文序列 * 。 Hpa I：5- GTT AAC - 3 3- CAA TTG -5平端Pst I： 5- CTGCA G - 3 3- G ACGTC -53突出粘性末端EcoR

19、I：5- G AATT C - 3 3- C TTAA G -55突出粘性末端 （四）目的基因 target genecDNA (complementary DNA) 在體外以RNA（通常為mRNA）為模板，經反轉錄合成的單鏈DNA。基因組DNA(genomic DNA) 代表一個細胞或生物體整套遺傳信息的所有DNA序列。目的基因又稱外源DNA67 攜帶外源DNA，實現外源DNA無性繁殖或表達有意義的蛋白質所采用的一些DNA分子。 常用載體： 質粒 噬菌體DNA 病毒DNA質粒 （1）雙鏈環狀DNA，細菌染色體外 （2）2 - 3kb 或 數百kb （3）獨立自主復制，穩定遺傳 （4）遺傳標志

20、 (五) 基因載體 （克隆載體）68三、重組DNA技術的原理 與基本過程*1. 獲取目的基因2. 選擇、構建基因載體3. 目的基因與載體連接，形成重組分子4. 重組分子導入受體細胞5. 篩選、擴增6. 表達目的基因 +載體目的基因重組DNA分子細菌轉化或轉染擴增篩選70（1） 化學合成 （4） PCR（2） 基因組DNA文庫 （3） cDNA文庫 1. 獲取目的基因 組織或細胞染色體 限制性內切酶多個DNA片段載體多種轉化子 （基因文庫）重組DNA 導入宿主細胞mRNA逆轉錄cDNAcDNA文庫72聚合酶鏈式反應（PCR） 在有特定模板、特異DNA引物及合成DNA所需要的dNTP存在時，向DNA合成體系內加入耐熱的DNA聚合酶（如Taq DNA聚合酶* ），經反復變性、退火及延伸的多個循環反應，生成特異DNA產物的過程。 變性：解開模板雙鏈DNA 95 退火：使引物與單鏈模板DNA結合 55 延伸：DNA鏈的合成 72 2. 克隆載體的選擇與構建 目的基因不能自我復制 3. 目的基因與載體連接（DNA連接酶* ）重組DNA4. 重組DNA導入受體菌安全菌 感受態導入方式：轉化 轉染 感染 5. 重