1、顯微鏡直接計(jì)數(shù)法 湯國(guó)平一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、明確顯微鏡計(jì)數(shù)的原理。2學(xué)習(xí)使用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行微生物計(jì)數(shù)的方法。二、實(shí)驗(yàn)材料 酵母菌懸液，血球計(jì)數(shù)板，顯微鏡，蓋玻片，無(wú)菌毛細(xì)管、吸水紙等。三、實(shí)驗(yàn)原理 利用血球計(jì)數(shù)板在顯微鏡下直接計(jì)數(shù)，是一種常用的微生物計(jì)數(shù)方法。此法的優(yōu)點(diǎn)是直觀、快速。將經(jīng)過(guò)適當(dāng)稀釋的菌懸液（或孢子懸液）放在血球計(jì)數(shù)板載玻片與蓋玻片之間的計(jì)數(shù)室中，在顯微鏡下進(jìn)行計(jì)數(shù)。由于計(jì)數(shù)室的容積是一定的（0.13），所以可以根據(jù)在顯微鏡下觀察到的微生物數(shù)目來(lái)?yè)Q算成單位體積內(nèi)的微生物總數(shù)目。由于此法計(jì)得的是活菌體和死菌體的總和，故又稱為總菌計(jì)數(shù)法。 血球計(jì)數(shù)板，通常是一塊特制的載玻片，其上由四條槽

2、構(gòu)成三個(gè)平臺(tái)。中間的平臺(tái)又被一短橫槽隔成兩半，每一邊的平臺(tái)上各刻有一個(gè)方格網(wǎng)，每個(gè)方格網(wǎng)共分九個(gè)大方格，中間的大方格即為計(jì)數(shù)室，微生物的計(jì)數(shù)就在計(jì)數(shù)室中進(jìn)行。 計(jì)數(shù)室的刻度一般有兩種規(guī)格，一種是一個(gè)大方格分成16個(gè)中方格，而每個(gè)中方格又分成25個(gè)小方格，共400小格；另一種是一個(gè)大方格分成25個(gè)中方格，而每個(gè)中方格又分成16個(gè)小方格，總共也是400小格。所以無(wú)論是哪種規(guī)格的計(jì)數(shù)板，每一個(gè)大方格中的小方格數(shù)都是相同的。每一個(gè)大方格邊長(zhǎng)為1，則每一大方格的面積為12，蓋上蓋玻片后，載玻片與蓋玻片之間的高度為0.1，所以計(jì)數(shù)室的容積為0.13。其計(jì)算方法如下：12516的計(jì)數(shù)板計(jì)算公式細(xì)胞數(shù)/ ml

3、=(80小格內(nèi)的細(xì)胞數(shù) /80)40010000稀釋倍數(shù) =A/5 25 104 B21625的計(jì)數(shù)板計(jì)算公式細(xì)胞數(shù)/ ml=(100小格內(nèi)的細(xì)胞數(shù) /100)40010000稀釋倍數(shù) =A/4 16 104 B四、操作過(guò)程1稀釋將酵母菌懸液進(jìn)行適當(dāng)稀釋，菌液如不濃，可不必稀釋。2鏡檢計(jì)數(shù)室在加樣前，先對(duì)計(jì)數(shù)板的計(jì)數(shù)室進(jìn)行鏡檢。若有污物，則需清洗后才能進(jìn)行計(jì)數(shù)。3加樣品將清潔干燥的血球計(jì)數(shù)板蓋上蓋玻片，再用無(wú)菌的細(xì)口滴管將稀釋的酵母菌液由蓋玻片邊緣滴一小滴（不宜過(guò)多），使菌液沿縫隙靠毛細(xì)滲透作用自行進(jìn)入計(jì)數(shù)室，一般計(jì)數(shù)室均能充滿菌液。注意不可有氣泡產(chǎn)生。靜置510分鐘即可計(jì)數(shù)。4顯微鏡計(jì)數(shù)將血

4、球計(jì)數(shù)板置于顯微鏡載物臺(tái)上，先用低倍鏡找到計(jì)數(shù)室所在位置，然后換成高倍鏡進(jìn)行計(jì)數(shù)。在計(jì)數(shù)前若發(fā)現(xiàn)菌液太濃或太稀，需重新調(diào)節(jié)稀釋度后再計(jì)數(shù)。一般樣品稀釋度要求每小格內(nèi)約有510個(gè)菌體為宜。若選用2516規(guī)格的計(jì)數(shù)板則每個(gè)計(jì)數(shù)室選5個(gè)中方格，可選4個(gè)角和中央的中格（即80個(gè)小格），若選用1625規(guī)格的計(jì)數(shù)板，則數(shù)四個(gè)角：左上、右上、左下、右下的四個(gè)中方格，（即100小格）中的菌體進(jìn)行計(jì)數(shù)。位于格線上的菌體一般只數(shù)上方和右邊線上的。如遇酵母出芽，芽體大小達(dá)到母細(xì)胞的一半時(shí)，即作兩個(gè)菌體計(jì)數(shù)。計(jì)數(shù)一個(gè)樣品要從兩個(gè)計(jì)數(shù)室中計(jì)得的值來(lái)計(jì)算樣品的含菌量。5.對(duì)每個(gè)樣品計(jì)數(shù)三次，取其平均值，計(jì)算每1ml菌液中

5、所含的酵母菌個(gè)數(shù)。 各中格中菌數(shù)A B二室平均值菌數(shù)/ml12345第一室第二室 A-五個(gè)中方格的總菌數(shù)B-稀釋倍數(shù)6清洗血球計(jì)數(shù)板 血球汁數(shù)板使用后，用自來(lái)水沖洗，切勿用硬物洗刷，洗后自行晾干或用吹風(fēng)機(jī)吹干，或用95的乙醇、無(wú)水乙醇、丙酮等有機(jī)溶劑脫水使其干燥。通過(guò)鏡檢觀察每小格內(nèi)是否殘留菌體或其他沉淀物。若不干凈，則必須重復(fù)清洗直到干凈為止。 7.注意事項(xiàng)（1）實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，如何稀釋？ 如果發(fā)現(xiàn)每小格中酵母菌的個(gè)數(shù)多于10個(gè)，可按以下處理：取1ml酵母菌培養(yǎng)液加入到盛有9ml蒸餾水的試管中，搖勻，再計(jì)數(shù)；如發(fā)現(xiàn)酵母菌的個(gè)數(shù)仍然過(guò)大，則同樣再稀釋一次，直至每小格中酵母菌的個(gè)數(shù)介于5-10，并作記錄。（2）調(diào)節(jié)顯微鏡光線的強(qiáng)弱適當(dāng)，對(duì)于用反光鏡采光的顯微鏡還要注意光線不要偏向一邊，否則視野中不易看清楚計(jì)數(shù)室方格線，或只見(jiàn)豎線或只見(jiàn)橫線。