1、 CNAS-GL043 獸醫檢測實驗室ELISA試驗測量不確定度評估指南GuidetotheEvaluation ofUncertainty inELISATestMeasurement in Veterinary Laboratory2020年 03月 01日發布2020年 3月 1日實施 CNAS-GL043:2020第 1頁共 7頁獸醫檢測實驗室ELISA試驗測量不確定度評估指南1、適用范圍本指南規定了獸醫檢測實驗室對 ELISA試驗進行測量不確定度評估的“從上到下法”和“從下到上法”。本指南適用于獸醫檢測實驗室對 ELISA進行測量不確定度的評估。2、引用文件下列文件中的條款通過引用而

2、成為本文件的條款。以下引用的文件，注明日期的，僅引用的版本適用；未注明日期的，引用文件的最新版本（包括任何修訂）適用。3.1 CNAS CL01檢測和校準實驗室能力認可準則3.2 CNAS-CL01-G003:2019測量不確定度的要求3.3 OIEManual of Diagnostic Tests and Vaccine for Terrestrial Animals(2019)：Chapter1.1.5“Qualitymanagementinveterinarytestinglaboratories”、Chapter .2.2.4“Measurement uncertainty”3、術語

3、和定義測量不確定度：與測量結果相關聯的參數，表征合理地賦予被測量值的分散性。標準不確定度：以標準偏差表示的測量不確定度稱為標準不確定度，以 u表示。擴展不確定度：確定測量結果區間的量，合理賦予被測量之值分布的大部分可望含于此區間。不確定度的A類評定：對在規定測量條件下測得的量值用統計分析的方法進行的測量不確定度分量的評定。不確定度的B類評定：用不同于測量不確定度A類評定的方法對測量不確定度分量進行的評定。合成標準不確定度：當測量結果是由若干個其他量的值求得時，按其他各量的方差（和）協方差算得的標準不確定度。自由度：在方差計算中，和的項數減去對和的限制數,符號為。置信概率：與置信區間或統計包含區

4、間有關的概率值（1-），為顯著性水平。當測量值服從某分布時，落在某區間的概率P即為置信概率。置信概率是介于（0，1）之間的數，常用百分數表示。在不確定度評定中置信概率又稱置信水準或置信水平。包含因子：為獲得擴展不確定度，而對合成標準不確定度所乘的數字因子。包含因子一般以K表示。置信概率為P時的包含因子用KP表示。2020年03月01日發布2020年03月01日實施 CNAS-GL043:2020第 2頁共 7頁4、“從下到上法”/“影響因素分析法”評估ELISA測量不確定度的步驟4.1確定ELISA試驗檢測結果不確定度來源4.1.1 A類不確定度因素A類不確定度影響因素包括（但可能不限于）對被

5、稀釋后的被檢血清或抗原的每個濃度進行的多個平行進檢測引起的不確定度、不同人員之間不同檢測同一樣品引起的測量不確定度、標準樣品引起的不確定度、不同品牌試劑用于同一血清進行引起的不確定度、被檢樣品/試劑盒存放條件引起的不確定度、采樣是否正確及樣品是否被污染引起的不確定度、樣品運輸和儲存條件引起的不確定度、處理樣品引起的不確定度、環境條件引起的不確定度、設備因素引起的不確定度、未知的隨機因素引起的不確定度。4.1.2 B類不確定度影響因素B類不確定度因素因素包括（但可能不限于）酶標儀的分辨力、孵育所用的恒溫箱溫度、加樣器、天平、未知隨機因素（如設備供電是否穩定、環境溫度是否變化很大、試劑反復冷藏、人

6、員身體狀況等等）。4.2影響ELISA試驗檢測結果各因素不確定度的評估4.2.1 A類因素的不確定度評估對列出的A類不確定度影響因素，分別進行重復測量。對每個影響因素測量出的結果按照如下方式分別計算。(1)計算所測量之值的平均值 XX= 1nxini1n:測量列數據的個數；X:第i個測量值；(2)計算每個影響因素有限測量值的標準偏差(用S表示)nvi2s i1n 1（即：測量結果減去被測量的最佳估計值）vi xi x(3)計算每個影響因素有限次測量值的相對標準偏差（或稱為平均值的標準偏差）s= n2020年03月01日發布2020年03月01日實施 CNAS-GL043:2020第 3頁共 7

7、頁為 X的實驗標準偏差(4)每個影響因素的標準不確定度評估su =n4.2.2 B類因素的不確定度評估（1）加樣器產生的不確定度加樣器產生的不確定度來源于加樣器(C)產生的不確定度u(C)和溫度效應(T)產生的不確定度u(T)。加樣器校準(C)產生的不確定度u(C)：根據加樣器說明書的介紹，該加樣器的準確度為2%，ELISA試驗中每次加樣量為100L，按矩形分布處理，加樣器引入的標準不確定度為：u(C)=（100L2%）/ 3=1.15 (L)溫度效應(T)產生的不確定度u(T)：容量器皿一般在20下被校準，假設實驗室的溫度在204之間波動，水的膨脹系數為2.110樣器由溫度效應引入的標準不確

8、定度為:u(T)=10042.110由于校準和溫度效應是 2個相互獨立的分量，因此 100L底物（V底）引起的標準合成不確定度 u（V底）=u =1.153 (L)-4/，按矩形分布100L加-4= 0.084 (L)。2(C)+u(T) =(1.15+0.084)2 1/2 2 2 1/2同理由100L終止液(V終)所引起的標準合成不確定度u(V終)=u（V底）=1.153(L)；因為u（V底）和u(V終)是兩個相互獨立的兩個分量，所以液層厚度的標準合成不確定度為： u（液層厚厚度）（2 ）酶標儀的不準確度由前述可知酶標儀的測量引起的標準不準確度為B類不確定度，求解為：u（酶標儀）=u1+

9、u2+ u3(3)溫育時間的不確定度ELISA試驗中，孵育時間分別為45 min3min和30 min3min，按照均勻統計分布計算，標準差為3min/3 =1.732 min.u（時間）=1.732 =0.069 min(4)溫育溫度的不確定度ELISA試驗共需孵育3次，孵育的溫度均為37t。根據均勻統計分布計算，其標準差為t/3 ,所以溫度的相對不確定度為：u（溫度）= (t/3 + (t/3 + (t/3如果t為2, U（溫度）=2.000=u（V底）+u(V終) =1.631 (L)2 2 1/2222 1/21/22/45 +1.732/302 2 2 1/21/21/2)21/2)

10、2)1/2 2 1/22020年03月01日發布2020年03月01日實施 CNAS-GL043:2020第 4頁共 7頁4.2.3相對標準不確定度的合成以上各分量互不相關，故合成不確定度就是將各個影響因素算出來的不確定度合在一起的過程，即將各個影響因素的不確定度的2次方加在一起，再開平方根。因為待測樣品 (S)，陽性對照(P)，陰性對照(N)，酶標儀(Uc)，溫育時間(UT1)，溫育溫度(UT2)的不確定度均為相對獨立的分量，所以合成相對標準不確定度為：u= u（S）u（P）u（N） u（C） u（T1） u（T2）2 2 2 2 2 24.2.4擴展不確定度的的計算與表示以標準偏差的倍數表

11、示的不確定度稱為擴展不確定度，以 U表示。在自由度 =n-1，測量結果的置信水平定為95時，最佳估計值的擴展不確定度為 U k sx，對于有限次測量，可通過查學生T表得到包含因子K。在ELISA試驗中一般使用2倍擴展不確定度，即K=2。4.2.5不確定度的報告得出ELISA試驗的不確定度后，如果需要在檢測報告中予以表示，可表示為：X=xU，其中x為實際樣品的OD值，U為OD值的不確定度，X表示被檢樣品的準確的OD值所在的區間。4.2.6不確定度的應用根據所用 ELISA試劑盒的結果判定標準，當 OD0.5時判定為 ELISA陽性(+)，當 OD0.5時判定為 ELISA陰性(-)。如果測得了本

12、實驗室的 ELISA試驗的確定度，就應該計算出每個樣品的X=xU。例如，在U為0.02，實際樣品測得的OD值為0.49，表示被檢樣品準確的OD值應該在0.47-0.51之間；在U為0.02，實際樣品測得的OD值為0.51，表示被檢樣品準確的OD值應該在0.49-0.53之間.這二份樣品不可以完全確定其為陰性結果。如果實際樣品測得的OD值為0.48以下或0.53以上，即使把不確定度計算在內，前者的最大OD值也小于0.5，仍可判為陰性，后者的最小OD值也大0.5，仍可判為陽性。5.“對照樣品”/“自上而下”法評估ELISA測量不確定度的步驟5.1“評估原理“對照樣品”/“自上而下”法評估ELISA

13、的測量不確定度，是利用質控樣品對試驗方法的全過程和性能進行監控，直接評估該試驗過程的合成不確定度。實際評估時，選擇一個弱陽性對照血清質控樣品，進行有限次的ELISA重復試驗，計算出檢測結果的平均值、標準偏差（SD）、相對標準偏差（RSD）。RSD即為不確定度。假設數據以正態分布，在閾值附近以 95%置信水平計算。擴展不確定度即為：22020年03月01日發布2020年03月01日實施 CNAS-GL043:2020第 5頁共 7頁乘以RSD。5.2評估舉例5.2.1評估實例用檢測禽流感病毒抗體的競爭ELISA有限的數據為例，說明血清學中“自上而下”評估測量不確定度的方法。在競爭ELISA試驗中

14、，試驗結果是所測得樣品（本實驗是陽性對照質控樣品）的OD值與陰性對照OD值間的比值，再用1減去這個比值。就得到了與所測抗體活性水平正相關的數值，抗體活性水平越高，計算得到的值越大。這個值即為抑制百分值或PI值。所以弱陽性對照血清的OD值（ODL）就轉換為：PIL=100 X 1- ODL / ODN 相對標準偏差就是：RSD（PIL）=SD（PIL）/（PIL）試驗檢測數據如下表試驗檢測次數PI（%）1565661645149597055422345678910經過計算可得：檢測次數為10，平均值（Mean）為56.3，標準偏差（SD）為7.9。相對標準偏差（RSD）= SD/Mean =7.

15、9/56.3=0.14假設數據以正態分布，在閾值附近以95%置信水平計算。擴展不確定度U(95%CI) = 2RSD，即2 0.14=0.285.2.2評估結果的應用舉例的禽流感病毒抗體競爭ELISA試驗的判定閾值PI為50%（即PI50%為陽性，PI50%為陰性）。所測得的不確定度在閾值水平上的應用為：95%CI=50%(50% X 0.28)=50%14%2020年03月01日發布2020年03月01日實施 CNAS-GL043:2020第 6頁共 7頁解釋：在95%置信度下，如果檢測結果PI大于64%時，不可判為陽性結果。同樣，在95%置信度下，如果檢測結果PI不小于36%時，不可判為的陰性結果。所有試驗都應建立用于解釋與“灰色區域”或“不確定/質疑區”有關的較低置信區間。2020年03月01日發布2020年03月01日實施 CNAS-GL043:2020第 7頁共 7頁參考文獻1.國家質量技術監督局計量司組編.測量不確定度評定與表示指南，第一版.北京：中國計量出版社。2.李慎安.測量不確定度表達百問，第一版.北京：中國計量出