1、病毒分類及微生物檢驗二、病毒分類系統和命名 （一）病毒分類一般系統 病毒分類系統將病毒分類為 科(families)、屬(genera)、種(species)等三級，或科、亞科、屬、種等四級。 根據病毒體的形態、基因結構和復制模式等特征將病毒分為科和亞科； 在科或亞科中又根據理化特性和血清學特性等分病毒屬，屬名后綴為virus，屬下分為不同的病毒種。 分類 可將病毒分為科、亞科和屬 常用核酸類型分類 1 DNA virus (DNA病毒中有9科 ) 2 RNA virus ( ssRNA 7 科. ssRNA 7 科. dsRNA 2科 ) 3 反轉錄病毒 (DNA和RNA反轉錄病毒中有2科)

2、 依傳播方式和感染部位分類 1 蟲媒病毒 2 腸道病毒 3 呼吸道病毒 4 肝炎病毒 5 性傳播病毒（二）非尋常病毒的分類 1 衛星病毒（satellites） 2 類病毒（viroids） 3 朊粒（prion） 第三節 病毒學診斷 自身免疫病和腫瘤密切相關。病毒性疾病在人類疾病中占有十分重要的地位。 由于病毒感染的防治原則不同于細菌等其他微生物，盡早判定病人感染或某傳染病的流行是由病毒所致，是醫生和微生物學實驗室的責任和任務。 病毒的分離與鑒定當然是病毒病原學診斷的金標準，但因病毒是嚴格細胞內寄生，病毒分離必須有活的細胞支持，故病毒的分離鑒定較困難。 一、標本的采集、運送和處理1. 應在感

3、染早期（發病12天內）采集。2. 必須無菌操作，對用于病毒分離培養的污染標本用 高濃度抗生素處理過夜，必要時需加抗真菌藥物等3. 及時送檢，送檢的組織等可放入含有抗生素的50% 甘油緩沖鹽水或二甲基亞砜中低溫冷藏。4. 血清學檢查的標本，尤其檢測抗病原體的IgG型抗 體，應分別在發病初期和恢復期采集雙份血清，只 有當恢復期血清抗體效價比初期升高4倍或以上， 才具有確診意義。分離培養鑒定(污染標本用抗生素處理過夜)快速診斷雞胚紅細胞凝集試驗紅細胞凝集抑制試驗細胞培養CPE電鏡檢測中和試驗TCID50pfu測定MOI測定動物接種觀察發病情況中和試驗免疫學檢測ID50測定LD50測定形態學電鏡觀察病

4、毒顆粒（大小、形態）光學顯微鏡觀察包涵體抗原檢測ELISAIFRIAWB核酸檢測核酸電泳核酸雜交PCR基因芯片基因測序抗體檢測ELISARIAIFWB病毒成分檢測 標本采集 二、病毒的分離與鑒定 以下情況需考慮進行病毒分離與鑒定： 1. 病程長且診斷困難的病人。 2. 懷疑為新現病毒（emergent virus）感染或已被消滅 的病毒性疾病懷疑“死灰復燃”。 3. 為鑒別臨床上具有相同癥狀的疾病。 4. 監測所用減毒活疫苗。 5. 用于病毒生物學性狀的研究或流行病學調查等。 （一）病毒的分離培養1細胞培養：原代培養細胞、 二倍體細胞株、傳代細胞 系或株 標本接種后溶細胞型感染病毒可致細胞出現

5、細胞病毒效應（CPE），穩定感染病毒細胞并不出現明顯病變，但被感染的細胞膜表面會表達病毒蛋白等標志物，如血凝素、神經氨酸酶、病毒特異性抗原等。2雞胚培養和動物接種： 流感病毒的分離培養雖可用犬腎傳代細胞（MDCK）,但雞胚接種仍是最常用的敏感而特異的方法。 動物接種是最原始的分離病毒的方法，但目前少用。 （二）病毒的鑒定1病毒在培養細胞中增殖的鑒定指標（1）細胞病變（ cytopathic effect, CPE ） 大多數病毒屬溶細胞型感染，在敏感細胞內增殖會出現CPE。CPE表現為細胞內顆粒增多、圓縮、聚集、融合，有的可形成包涵體，出現細胞溶解、脫落、死亡等。 不同病毒的CPE特征不同。因

6、此，觀察病毒所致CPE的特點，根據細胞類型，細胞病變種類可對標本中感染的病毒進行判定。脊髓灰質炎病毒感染所致CPEa. 未感染的vero細胞（一種非洲綠猴腎細胞系）b. 脊髓灰質炎病毒感染的vero細胞（顯示細胞圓縮、分散 、 壞死、脫落）。 （2）紅細胞吸附（hemadsorption） 包膜上帶有血凝素的病毒感染敏感細胞后， 血凝素會出現于細胞膜表面，使感染細胞能與加入的紅細胞結合出現紅細胞吸附現象，這是檢測正粘病毒和副粘病毒的間接指標。 （3）中和試驗（neutralization test, NT） 用抗某病毒血清先與待測病毒懸液混合，經作用一定時間后接種敏感細胞，培養后觀察CPE或

7、紅細胞吸附現是否消失，即特異性抗體是否能 中和相應病毒的感染。如用不同濃度的抗血清 進行中和試驗，還可根據抗體的效價對待測病毒 液進行半定量檢測。 （1）空斑形成試驗（plaque formation） （2）50%組織細胞感染量 （3）感染復數 （Multiplicity of infection, MOI）2病毒感染性測定及病毒數量測定 三、病毒感染的快速診斷 病毒的分離與鑒定是病毒診斷的金標準，但臨床實驗室應用困難，而且費時，對臨床病毒感染癥的診治幫助不大。快速診斷主要指臨床標本繞過分離培養復雜而較長的過程，直接在電鏡下觀察病毒顆粒，或直接檢測標本中的病毒成分和IgM抗體等，以作出快速和

8、早期診斷。 （一）形態學檢查1電鏡和免疫電鏡檢查 含有高濃度病毒顆粒（107顆粒/ml）的樣品，可直接應用電鏡技術觀察。對含低濃度病毒的樣本可用免疫電鏡技術，或用超速離心機將標本離心進行電鏡觀察，以提高檢出率和特異性。電鏡下不僅能觀察病毒的形態學特征，還可測量病毒的大小。2光學顯微鏡檢查 病理標本或含有脫落細胞及針吸細胞的標本檢測病毒包涵體。包涵體對病毒的診斷有一定價值。觀察病毒CPE。病理標本根據病理特征，再配合組化染色技術進行診斷。 （二）病毒蛋白抗原檢測 1. 酶聯免疫技術（ELISA） 2. 免疫熒光標記技術（IF） 3. 放射免疫標記（SPRIA） 這些技術操作簡便、特異性強、敏感性

9、高。尤其使用單克隆抗體標記技術可測到ng（10-9g） 至pg（10-12g）水平的抗原或半抗原。其中由于放射性核酸可引起放射性污染，已逐漸被非放射性標記物（如地高辛等）所代替。（三）早期抗體檢測1IgM型特異抗體檢測 檢測病毒感染機體產生的特異性IgM，如孕婦羊水中查到IgM型特異抗體可早期診斷某些病毒引起的胎兒先天性感染；IgM抗體測定有助于早期診斷，但感染機體產生IgM抗體有明顯個體差異。 2免疫印跡試驗（Western blot, WB） 某些病毒感染的診斷需持慎重認真的作法。如AIDS和成人白血病等，在初篩試驗陽性后，尚需用WB法進行確認試驗。 （四）檢測病毒核酸1核酸電泳：正粘病毒屬和呼腸病毒屬的核酸是分節段 的，甲型流感病毒8個節段，輪狀病毒11個節段。從 標本中直接提取輪狀病毒的核酸，經聚丙烯酰胺凝膠 電泳（PAGE）和銀染色后在凝膠板上清楚核酸條 帶，結合臨床情況可進行診斷。2核酸雜交：其原理是應用已知序列的核酸單鏈作為探 針（probe），探針預先用放射性核素（32P或131I）或 生物素、地高辛苷原、辣根過氧化物酶等標記，在一 定條件下按堿基互補規律與標本 （1）斑點雜交（dot blot hybridization）： （2）原位雜交（i