1、第一節(jié) 粗糙鏈孢菌的遺傳分析生活史四分體遺傳分析隨機孢子遺傳分析粗糙鏈孢霉的生活史圖5-9紅色鏈孢霉的生活史(引自Russell,1992) 生活史生殖方式無性世代 ： 菌絲體 分生孢子 菌絲體有性世代 ：原子囊果+分生孢子 二倍體合子4個核8個子囊孢子遺傳分析二倍體合子減數(shù)分裂形成四個單倍體子囊孢子，也稱四分孢子。這四個減數(shù)分裂的產物不僅 留在一起，而且以直線方式排列在子囊中，所以又稱順序四分子（ordered tetred）。對四分體進行遺傳分析，就叫四分子分析。 基本概念真菌類的遺傳學分析主要以粗糙鏈孢菌(Neurospora crassa)和酵母菌(Saccharomyces)為例。都

2、是真菌，屬于低等真核生物。粗糙鏈孢菌的特點：子囊孢子是單倍體，表型直接反映基因型。一次只分析一個減數(shù)分裂產物。體積小，易繁殖，易于培養(yǎng)。可進行有性生殖，染色體結構和功能類似于高等生物。四分子分析(tetrad analysis)： 單一減數(shù)分裂的4個產物留在一起， 稱為四分子。對四分子進行遺傳學 分析稱為四分子分析。方法無交換發(fā)生交換雜交后代分析 非交換型（1）+ + - - （+ + + + - - - -） （2）- - + + （- - - - + + + +） 交換型（3）+ - + - （+ + - - + + - -） （4）- + - + （- - + + - - + +） （5

3、）+ - - + （+ + - - - - + +） （6）- + + - （- - + + + + - -） 第一次分裂分離第二次分裂分離MI模式MII模式 總結 ： 如果兩個基因的分離發(fā)生在第一次減數(shù)分裂，則基因與著絲粒之間未發(fā)生重組;如果兩個基因的分離發(fā)生在第二次減數(shù)分裂，則說明基因與著絲粒之間發(fā)生了重組。 著絲粒作圖(centromere mapping)鏈孢霉的野生型又稱為原養(yǎng)型(prototroph)， 子囊孢子按時成熟呈黑色。營養(yǎng)缺陷型(auxotroph)，只能在完全培養(yǎng)基上生長， 成熟較慢，子囊孢子呈灰白色。prototrophauxotroph利用四分子分析法，測定基因與著

4、絲粒之間的距離。遺傳分析著絲粒距離=如：將兩種菌株進行雜交lys+ lys，得如下結果子囊類型子囊數(shù)分裂類型（1） （2） （3） （4） （5） （6）105 129 9 5 10 16MIMIMIIMIIMIIMII非交換型 交換型Lys 基因與著絲粒之間的距離是7.3cM。兩個連鎖基因的作圖Neurospora crassa雜交結果 5 1 90 5 90 1808實得子囊 數(shù) TNPD PD T TNPD PD四分子類 別分離發(fā)生時期四分子基因型 子囊型+ a+ an +n + + +n an a+ + an +n a+ an a+ +n + an + an + +n a+ +n a+

5、 +n a+ an +MIMIMIMIMIMIIMIIMIMIIMIIMIIMIIMIIMIIP192兩對基因雜交，如不考慮孢子排列，只考慮性狀組合時，子囊可以分為3種四分子類型。親二型(parental ditype , PD)，有兩種基因型，并與 親代相同。包括子囊型和。非親二型(non-parental ditype ,NPD)，有兩種基因型 都跟親代不同，是重組型。包括子囊型和。四型（tetratype, T），有四種基因型，2種與親代相 同，2種重組型，包括子囊型、和。下圖是從染色體交換和重組來理解各類子囊的形成原因。交換類型染色體圖象重組四分子類型子囊型無交換四 線雙交換單交換0%

6、100%50% an an an a , a , n , n(PD), , na , na(NPD) , a , n , na(T)交換類型染色體圖象重組四分子類型子囊型二 線雙交換單交換四 線多交換50%0%100% an a , na , , n(T)a , n, a , n(PD), na , , na(NPD) an an an , na , a , n( T )50%三線雙交換資料分析：計算nic與著絲粒之間的重組率：2. 計算ade與著絲粒之間的重組率：3. 判斷 nic、ade 基因是獨立分配還是連鎖。如果兩個基因是自由組合的話，則PDNPD =11而實驗結果PD=808+90=

7、898，NPD=1+1=2，PD遠遠大于NPD。說明這兩個基因是相互連鎖的。5.059.30nicadenicade5.059.30哪一種排列正確呢？ 再讓我們根據(jù)四分體來計算nic 和ade之間的重組頻率，以便判斷nic 和ade與著絲粒的相對位置。 依圖9-5 知每一個四分體中均會含有四條染色單體，由于每個T型四分體中含有2條重組染色單體，每個NPD型的四分體中含有4條重組染色單體，每個PD型四分體中不含重組染色單體，所以重組染色單體數(shù)目是 2 T + 4 NPD ；染色單體的總數(shù)是 4 (T + PD + NPD)，因此 nic 和ade 基因間的重組頻率可根據(jù)下列公式計算： 重組染色單

8、體數(shù)目 2 T + 4 NPD 重組頻率 = _ 100% = _ 100% 染色單體總數(shù)目 4 (T + PD + NPD) 1 / 2 (90 + 5 +5) + (1+1) nic-ade重組率= _ 100% = 5.2% 1000也就是說，nic 和ade之間的相對距離為5.2。由于nic 和著絲粒的距離為5.05，ade和著絲粒的距離為9.3，因此可以判定nic 和ade在染色體上的排列順序和相對距離為圖: _ 。_nic_ade_ 5.05 5.20 9.3 圖 nic 、ade和著絲粒之間的距離 由上圖可見，通過著絲粒距離計算得到的ade與著絲粒距離為9.3，而由重組頻率測得的

9、距離為5.2 + 5.05 = 10.25。雖然兩個數(shù)值相近，但并不相等。這是因為在著絲粒距離方法中，在求ade與著絲粒之間的距離時，是將所有第二次分裂分離型的子囊數(shù)加起來再除以二倍的總子囊數(shù)。在此將少量的在著絲粒和ade間發(fā)生雙交換的子囊遺漏了，因此造成著絲粒與ade的距離偏低。第二節(jié) 構巢曲霉 1、四分體無序 2、三種類型 3、P196在構巢曲霉(A. nidulans)中，一次減數(shù)分裂的全部產物雖然也同處于一個子囊內，但是其子囊孢子不象粗糙脈孢菌那樣呈直線排列，而是無順序的排列。 我們將這種不是以直線方式排列在一個子囊內的四個減數(shù)分裂產物稱為非順序排列四分體。 二、構巢曲霉有性雜交的遺傳

10、分析 構巢曲霉有性雜交產生的是非順序排列的四分體，無法判斷它們是屬于第一次分裂分離還是第二次分裂分離，因此在粗糙脈孢菌中適用的通過第二次分離子囊數(shù)來計算著絲粒距離的方法，在構巢曲霉有性雜交中不適用。 但把四分體歸納為PD、NPD何T三種類型時，是以四分體中子囊孢子性狀的組合方式劃分的，沒有考慮四分體中孢子的排列順序。所以在構巢曲霉有性雜交中可采用四分體中PD、NPD和T的出現(xiàn)頻率來進行遺傳分析。 另外，也可用隨機孢子分析法來進行分析。第三節(jié) 真菌的準性生殖(parasexual cycle)真菌在進行有性循環(huán)時，通過減數(shù)分裂可產生重組體，是實現(xiàn)基因重組的一條重要途徑。但是有很多真菌，特別是半知

11、菌亞門的真菌，沒有或很少發(fā)生有性生殖過程，卻仍然表現(xiàn)出了較高頻率的變異，這種變異就是通過另一條獨立于有性生殖的基因重組途徑 _ 準性生殖。準性生殖是真菌的一種導致基因重組的過程，包括異核體的形成、二倍體的形成以及體細胞交換和單元化。真菌的準性生殖(Parasexuality)是指異核體真菌菌絲細胞中兩個遺傳物質不同的細胞核可以結合成雜合二倍體的細胞核，這種二倍體細胞核在有絲分裂過程中可以發(fā)生染色體交換和單倍體化，最后形成遺傳物質重組的單倍體的過程。準性生殖和有性生殖的主要區(qū)別在于，有性生殖是通過減數(shù)分裂進行遺傳物質重組和產生單倍體。而準性生殖是通過二倍體細胞核的有絲分裂交換進行遺傳物質的重新組

12、合，并通過產生非整倍體后不斷丟失染色體來實現(xiàn)單倍體化的。每一個分生孢子都有一個單個的核。任何一個孢子的表型都和它的基因型是一致的，這樣便于鑒別。若將兩個單倍體品系混合，菌絲融合，兩種類型的核都同時存在胞質中，這種品系稱為異核體（heterckaryon）。和其他品系一樣，異核體將產生單核的分生孢子。在少數(shù)情況下異核體中的兩個單倍體核融合產生一個二倍體核，這一過程稱為二倍化（diploidization）。二倍體品系的曲霉產生的無性孢子將具有二倍體核。二倍體細胞是可能要經歷有絲分裂交換，產生遺傳重組。因為二倍體的核不穩(wěn)定，最終通過有絲分裂產生單倍體核，此單倍體核含有來自兩個單倍體親本的等位基因的

13、重組。由二倍體核形成單倍體核的過程稱為單倍化（hapliodization） 概念二、準性生殖的過程 (一) 異核體的形成 當帶有不同遺傳性狀的兩個單倍體細胞或菌絲相互融合時，會導致在一個細胞或菌絲中并存有兩種或兩種以上不同遺傳型的細胞核，這樣的細胞或菌絲就叫異核體。異核體的形成是進行準性生殖的第一步。以構巢曲霉為例 當把構巢曲霉A接合型的亮氨酸缺陷突變株(leu met+) 與A接合型的蛋氨酸缺陷型突變株(leu+ met-) 混合接種在基本培養(yǎng)基上培養(yǎng)時，常常可以產生少量原養(yǎng)型菌落，這些菌落是異核體。這是因為兩個親本的菌絲間發(fā)生相互聯(lián)結，形成了細胞質和細胞核相互混雜的異核體。在異核體中兩種

14、細胞核能彼此提供所缺少的酶，因此可不需亮氨酸和蛋氨酸而在基本培養(yǎng)基上生長。1異核體的證實將兩個營養(yǎng)缺陷型菌株混合培養(yǎng)，出現(xiàn)原養(yǎng)型菌落的原因可能是由于互養(yǎng)、異核體、二倍體或單倍重組體的存在。如何證明？(1)互養(yǎng)這一解釋的排除(2)二倍體或單倍體的排除 的證實異核體1、互養(yǎng)2、二倍體和重組單倍體A、leu-met+B、 leu+met- 基本培養(yǎng)基含leu培養(yǎng)基含met培養(yǎng)基基本培養(yǎng)基2異核體的生物學意義 異核現(xiàn)象在自然界普遍存在。早在1938年就已在35屬的半知菌中發(fā)現(xiàn)32屬有異核現(xiàn)象。異核現(xiàn)象在自然界這樣普遍的一個原因是異核體包含著不同基因型的細胞核，具有生長優(yōu)勢，另外是具有更好的環(huán)境適應能力

15、。此外，異核體在遺傳分析中也很重要，由于異核體內的兩個不同營養(yǎng)缺陷型的細胞具有互補作用，因此可以用異核體進行基因等位性的測定等研究。 一般地說，異核體的形成與A、a接合型之間沒有關系，但接合型可影響形成異核體的難易程度，相同接合型的菌株間更容易形成異核體。異核體的形成是由基因型決定的，在粗糙脈孢菌中已發(fā)現(xiàn)至少有10個基因與異核體的形成有關。(二)雜合二倍體的形成 異核體細胞中存在著核融合的可能。核融合是指兩個單倍體核融合形成一個二倍體核的現(xiàn)象。基因型相同的核融合形成純合二倍體，基因型不同的核融合形成雜合二倍體。異核體中兩個基因型不同的細胞核可以以極低的頻率融合成雜合二倍體。研究表明異核體發(fā)生核

16、融合而產生二倍體的頻率為10-710-5。用某些理化因素(如紫外線、樟腦蒸氣或高溫)處理，可提高二倍體產生的頻率。原因可能是由于在處理過程中使某些抑制核融合的基因發(fā)生突變的結果。 1956年，Pontecorvo等人在用構巢曲霉白色突變株(w-y+ )和黃色突變株(w+ y- )進行異核體的研究時發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)基中可產生形成綠色孢子的菌株。由異核體( w-y+ / w+ y- )所產生的孢子應該是白色和黃色兩種，那么綠色的孢子是怎樣形成的呢？綠色分生孢子的形成是由于異核體中的兩個核融合而形成二倍體( w-y+ / w+ y- )的緣故。由于白色突變型和黃色突變型對于綠色野生型來講都是隱性的，所以

17、二倍體的分生孢子必然呈綠色。 例子1、W+Y-黃色W-Y+白色 -綠色？（ W+Y-/ W-Y+ ）2、 W+Y-/ W-Y+綠色-白、黃。？二倍體有什么特性呢？1、二倍體分生孢子大于單倍體的分生孢子；2、盡管分生孢子的大小是一樣的，但每個分生孢子中核的數(shù)目是不相同的, 二倍體分生孢子中核數(shù)約為單倍體分生孢子的一半。 (三) 體細胞交換和單元化 準性生殖循環(huán)過程中產生的二倍體并不象有性生殖過程中的二倍體那樣進行減數(shù)分裂，它們仍以有絲分裂的形式增殖。從穩(wěn)定性來看，二倍體細胞比異核體較為穩(wěn)定。從異核體所取得的分生孢子屬于兩個親本菌株，從二倍體得到的分生孢子則一律都是二倍體。 可是穩(wěn)定性是相對的，正

18、像從異核體中可以得到少數(shù)二倍體犯不著一樣，從大量的二倍體分生孢子中也可以得到少數(shù)體細胞分離子。所謂分離子包括重組體和非整倍體或單倍體。產生非整倍體或單倍體的過程稱為單元化，產生重組體的過程稱為體細胞交換。 體細胞重組體的產生經研究發(fā)現(xiàn)，體細胞重組體的出現(xiàn)是由于在有絲分裂過程中同樣染色體間發(fā)生染色體交換，從而導致部分基因的純合化。 此外，研究發(fā)現(xiàn)二倍體細胞在有絲分裂過程中通過產生非整倍體或單倍體-單元化過程亦可形成重組體(圖 )。 在準性生殖過程中，體細胞交換和單元化是兩個獨立發(fā)生的。體細胞交換產生部分基因純合化的二倍體的重組體，而單元化過程則產生各種類型的非整倍體和單倍體的重組體。因此，可以通

19、過體細胞重組和單元化過程進行有絲分裂定位。 第四節(jié) 絲狀真菌的遺傳物質和基因表達調控 真菌的遺傳物質包括5種成份:染色體基因、線粒體基因、質粒、轉座因子及病毒基因。 核基因組（重復、內含子、分散）絲狀真菌的基因組 線粒體基因組（幾十Kb） 質粒、轉座因子、病毒 粗糙脈孢霉單倍體基因組為4.3107bp，G+C含量為54%,每條染色體的大小為410.3Mb。端粒與人的端粒相同。線粒體內含有質粒。已經鑒定了2000多個不同的粗糙脈孢菌基因，目前正在構建基因組的物理圖譜，德國和美國的科學家及其單位正在進行基因組測序。2. 核基因組結構 絲狀真菌中功能相關的結構基因一般是不連鎖的、分散存在于基因組中。

20、但也有一些如與脯氨酸代謝有關的4個基因、與奎尼酸代謝有關的7個基因以及有關青霉素生物合成的3個基因是連鎖的，聚集在一起構成基因簇，前兩個基因簇同時還包含結構基因和調節(jié)基因。基因簇中所有各基因都是分別產生各自的mRNA，并不象原核生物那樣形成操縱子結構。 1989年在自然界分離的粗糙脈孢菌菌株中發(fā)現(xiàn)了絲狀真菌的第一個轉座子Tad，該轉座子全長7kb，在核基因組中以多拷貝存在，插入DNA時產生靶序列的重復。后來，在其它真菌如尖鐮刀菌中也發(fā)現(xiàn)了轉座因子，而且發(fā)現(xiàn)轉座子與植物病原菌的致病和培養(yǎng)性狀的高度變異有關。3. 線粒體基因組 絲狀真菌線粒體是大小為幾十個kb的環(huán)狀結構，它含16S和23S rRN

21、A基因和20多個tRNA基因，還有幾個與電子傳遞鏈有關的結構基因。此外，還還有一些尚未鑒定的ORF。 線粒體基因組在正常復制過程中經常發(fā)生分子內重組，造成基因組大小的多變。重組的內容和方式有多種，如線粒體DNA重排、DNA片段的插入或缺失。還有因內含子剪接不同造成基因內所含內含子數(shù)目不等等。 二、基因結構(1)啟動子 許多絲狀真菌基因的5非編碼區(qū)存在高等真核生物基因啟動子中普遍具有的CAAT和TATA盒。但有許多絲狀真菌基因并不含上述保守序列。(2)上游激活序列 上游激活序列是與激活蛋白結合的部位。在粗糙脈孢菌奎尼酸代謝(qa)基因簇中，qa-1F編碼的激活蛋白能與該基因簇中5個結構基因的5非

22、編碼區(qū)結合，并對轉錄起激活作用。(3)增強子 缺失分析發(fā)現(xiàn)粗糙脈孢菌的am基因(編碼谷氨酸脫氫酶)受兩個5上游遠距離序列的調節(jié)，一個序列在轉錄起始點上游1.4kb，另一個在上游2.13.2kb之間。當同時缺失這兩個序列時，只保留516%的表達水平，推測這兩個序列可能是弱的增強子。三、基因表達的調控 隨著分子生物學研究方法在絲狀真菌研究中的應用,已經開展了對絲狀真菌基因的表達及其調控全方位的研究，并取得了一定的進展。 如在抗生素生物合成的基因簇結構、基因表達調控；分生孢子形成的結構基因及其分生孢子發(fā)育過程中基因表達的時空秩序性；參與營養(yǎng)物質代謝的基因及其表達調控等方面已做了較深入的研究工作。下面

23、以粗糙脈孢菌奎尼酸代謝為例，闡述其調控機制。 粗糙脈孢菌的qa基因簇（奎尼酸代謝基因簇） 粗糙脈孢菌的qa基因簇包含5個結構基因和2個調節(jié)基因，全長18 kb(圖)。5個結構基因從左到右依次是:qa-X、qa-2、qa-4、qa-3 和qa-Y；2個調節(jié)基因分別是qa-1F 和qa-1S。 這2個調節(jié)基因qa-1F 和qa-1S，分別編碼激活蛋白和阻遏蛋白，在無奎尼酸時這2個基因屬于低水平的組成型表達。 5個結構基因的轉錄受奎尼酸的協(xié)同誘導，同時受qa-1F 和qa-1S的協(xié)同調節(jié)，誘導時的轉錄水平比無誘導時高501000倍。所有qa基因簇(包括結構基因和調節(jié)基因)的轉錄都需要qa-1F 編碼

24、的蛋白的激活。無誘導物時， qa-1S編碼的阻遏蛋白與激活蛋白結合，阻止了qa-1F 基因的轉錄，從而使qa結構基因及其qa-1S基因的轉錄受阻，僅維持在基礎水平的轉錄。 有誘導物時，誘導物與阻遏蛋白結合，使qa-1F 基因脫阻遏，產生的激活蛋白促進qa結構基因的轉錄，與此同時也促進qa-1S的轉錄，因此一旦誘導物水平下降，已逐漸積累的阻遏蛋白便可立即將整個系統(tǒng)關閉。在qa基因簇中共有13個激活蛋白的結合部位，該部位是部分對稱的16 bp的保守序列GGATAANNNNTTATCC，說明有些基因啟動子上游有1個以上的激活蛋白結合部位。四、絲狀真菌的接合型基因 已經對多數(shù)絲狀子囊菌和擔子菌的接合型

25、基因進行了克隆和特征分析。接合型基因的名稱現(xiàn)在傾向于統(tǒng)一用MAT來表示，但對于個別舊的稱呼仍然延用。 粗糙脈孢菌的接合型有A和a兩種類型,mat a的長度為3235 bp，含有一個ORF,即mat a1，編碼382個氨基酸；mat A的長度為5301bp，含有3個ORF，即mat A-1、mat A-2和mat A-3,它們編碼的產物的氨基酸長度分別為293、373和324 (圖 )。mat a和mat A這兩個DNA區(qū)段并無同源性，但它們兩側的DNA序列是相同的。mat a和mat A這兩個不同的DNA區(qū)段在單倍體細胞中對應的相同的染色體上占據(jù)著相同的位置，被叫做二極性(idiomorphs

26、)，而不叫等位基因。 mat a-1和mat A-1是細胞接合和有性生殖所必需的，而mat A-2和mat A-3能提高有性生殖能力但并不是有性生殖所必需的。 mat a和mat A的作用可能與釀酒酵母中的接合型基因類似，編碼調節(jié)蛋白，對接合信息素的分泌和受體的產生進行調控。其它絲狀子囊菌如Gibberella、Podospora、Pyrenoperiza、P. anserina等都有與粗糙脈孢菌類似的結構，即mat a含有單一ORF而mat A含有3個ORF，其作用可能也類似。但擔子菌的接合型基因的結構和作用則不同于子囊菌。在擔子菌中，接合型基因直接編碼信息素和受體，直接控制著細胞的融合和有

27、性孢子的形成。第五節(jié) 絲狀真菌的轉化及其特點一、外源DNA導入絲狀真菌受體的方法外源DNA導入絲狀真菌中最普遍使用的方法是CaCl2/PEG介導的原生質體轉化。首先是用溶壁酶處理菌絲體或萌發(fā)的孢子獲得原生質體，然后將原生質體、外源DNA混合于一定濃度的CaCl2、PEG(聚乙二醇)緩沖液中進行融合轉化，然后將原生質體涂布于再生培養(yǎng)基中選擇轉化子。 對于難以獲得原生質體的絲狀真菌來說，也可利用醋酸鋰介導的完整細胞的轉化，但轉化率低。在絲狀真菌中也應用了電轉化技術，與普遍采用的CaCl2/PEG方法相比，雖然簡化了操作步驟，但對提高轉化率并無明顯作用。基因槍注射(或生物導彈)轉化技術，最近幾年也在

28、絲狀真菌中得到應用，它同樣不能十分有效地提高轉化率。二、載體及其選擇標記1.載體 轉化DNA進入寄主細胞后，可獨立寄主細胞核染色體而自主復制，或整合到寄主染色體上而隨寄主染色體一起復制，前者被稱為復制型轉化，后者被稱為整合型轉化。 已實現(xiàn)轉化的絲狀真菌中，絕大多數(shù)都是整合型轉化。早期應用的載體通常以細菌質粒如pBR322、pUC等為主，在鈣離子和PEG作用下向受體菌原生質體進行轉移，轉化效率較低，一般每微克轉化DNA產生100個以下的轉化子。這類載體引起的轉化一般屬于整合型轉化，常常載體攜帶的真菌基因和載體本身會同時整合到受體染色體上。DNA進入受體細胞后，是通過同源重組和非同源重組兩種方式而

29、整合到受體菌的染色體上的。2.選擇標記 所用的選擇標記分兩類，一類是營養(yǎng)互補標記，另一類是顯性標記(抗生素或藥物抗性)。三、絲狀真菌轉化子的表達及其穩(wěn)定性 克隆基因在轉化受體菌中的表達水平與多種因素有關，包括載體中所用啟動子及其其它調控序列的存在、目的基因整合位置、整入拷貝數(shù)和受體菌株等。 一般來說，無論整合型轉化子還是復制型轉化子，其在有絲分裂過程中是穩(wěn)定的，大多數(shù)轉化DNA在經過幾十代的有絲分裂后仍保持穩(wěn)定性。但經過減數(shù)分裂表現(xiàn)出高度的不穩(wěn)定，尤其是粗糙脈孢菌。經過有性過程導致轉化DNA丟失的機制有:質粒的丟失、DNA的切離、DNA重排等。 第六節(jié) 絲狀真菌中的質粒質粒最初是在細菌中發(fā)現(xiàn)的

30、，后來在真核生物中也發(fā)現(xiàn)質粒。真核生物中記載最多的是真菌中含有質粒，少數(shù)植物含有質粒，動物細胞內沒有質粒。真菌細胞中的質粒一般是環(huán)狀或線狀的雙鏈DNA分子，而且大多是不編碼任何表型性狀的隱蔽質粒，位于細胞核或線粒體內。一、絲狀真菌中的天然質粒及其分布到目前為止，已經發(fā)現(xiàn)很絲狀真菌中都具有質粒，絲狀真菌中的質粒有環(huán)狀和線狀兩種類型，位于真菌的線粒體內(表2-3)。表2-3 含有質粒的真菌名稱Absidia glauca 灰色梨頭霉Agaricus spp. 傘菌Ascobolus immerses 埋生糞盤菌Ascosphaeria apis 蜂狀囊菌Alternaria alternata 鏈

31、格孢菌Claviceps purpurea 麥角菌Cochliobolus 旋孢腔菌Epichloe typhina 香柱菌Erisyphe graminis 禾白粉菌Fusarium solani 茄腐皮鐮刀菌Fusarium oxysporum 尖孢鐮刀菌Leptosphaeria maculans 十字花科子囊腔菌Morchella conica 尖頂羊肚菌Nectria haematococca 赤球叢赤殼菌Neurospora crassa 粗糙脈孢菌Neurospora intermedia 中脈孢菌Podospora anserine 四孢殼孢菌Phythium spp. 腐霉菌

32、Rhizoctonia solani 立枯絲核菌Tilletia spp. 腥黑粉菌Tricoderma viride 綠木霉a有些絲狀真菌中質粒的命名最早是根據(jù)質粒寄主的采集地點而定的。如粗糙脈孢霉菌中的Mauriceville質粒，中脈孢菌中的Lebelle和Fiji質粒等。對脈孢霉屬的質粒概況研究表明，該屬含有11種不同的質粒，質粒具有線狀和環(huán)狀兩種類型(見表2-4)。對尖胞鐮刀菌、立枯絲核菌的研究表明，每種真菌中都含有一種或一種以上的質粒。值得注意的是，在研究最多的曲霉中尚還沒有發(fā)現(xiàn)質粒。表2-4 脈胞霉菌中的質粒同源組質粒類型 同源組環(huán)狀 Mauriceville，F(xiàn)iji，LaBe

33、lle，Java，MBI，VS，Harbin-2線狀 Kalilo，Maranhar，Moorea，Zhisi 二、質粒的表型和質粒結構實際上，對所有絲狀真菌中的質粒而言，其對寄主表型的影響仍然不清楚。在大多數(shù)情況下，沒有發(fā)現(xiàn)對寄主真菌的生長有明顯的影響作用。也許質粒能夠賦予寄主選擇優(yōu)勢，如在線粒體代謝或分裂的某些方面。另外，有些質粒與宿主真菌的老化有關。上面例舉的具有質粒的真菌很多都是寄生真菌。真菌中的天然質粒最常見的是線狀，環(huán)狀質粒主要存在于在脈胞霉菌中，其它個別種如：旋孢腔菌、麥角菌和灰綠梨頭霉中也有環(huán)狀質粒。 據(jù)DNA的雙向電泳和脈沖電泳，可將線性質粒與線粒體DNA區(qū)分開。大多數(shù)線型質

34、粒在兩條DNA鏈的5末端各有一個共價結合的蛋白，保護DNA免受酶的降解。在真菌中，環(huán)狀質粒的檢測比較復雜，常用探針檢測線粒體部分，根據(jù)帶型來進行確定。1.線型質粒 研究最深入的是脈孢霉菌中的天然質粒，對環(huán)狀質粒和線狀質粒都進行了全序列分析研究，特征見圖。線狀質粒Kalilo和Maranhar的總體結構是目前發(fā)現(xiàn)的大多數(shù)其它絲狀真菌中線狀質粒的典型代表。其特點如下：(1)有末端反向重復序列 (TIR)，其長度因每種質粒而異；(2)在質粒的兩個5末端各有一個結合蛋白，保護質粒不受核酸外切酶的破壞；(3)有兩個非重疊的ORF，每個ORF都起始于末端反向重復序列內，但轉錄方向相反，即轉錄方向都是從末端

35、指向中央。其中一個ORF編碼DNA 聚合酶，另一個編碼RNA 聚合酶，它們與噬菌體和酵母線粒體中的多聚酶具有相似性。在兩個ORF之間有基因間隔區(qū)，雖然含有轉錄信號，但尚未發(fā)現(xiàn)有什么功能。大多數(shù)真菌的線狀質粒有兩個類似的ORF，但有些只有一個ORF。不同的質粒，其ORF的排列可能也不同。立枯絲核菌中的3個線狀質粒在幾方面表現(xiàn)出非典型性，首先它們的末端似乎是閉合的發(fā)夾結構，其次是ORF都不大于91個氨基酸。2.環(huán)狀質粒脈孢菌屬中的環(huán)狀質粒也不具有抗性特征。Fiji 和LaBelle這兩種環(huán)狀質粒編碼DNA 聚合酶；Mauriceville和 Varkud這兩種環(huán)狀質粒編碼反轉錄酶(reverse

36、transcriptase)。脈孢菌屬中的環(huán)狀質粒都產生全長的RNA轉錄物,特別是在Mauriceville 和 Varkud質粒中。VS質粒只存在于含有Varkud質粒的真菌菌株中，自己本身沒有編碼蛋白質的ORF，可能依賴于Varkud質粒提供的功能，但確在體內發(fā)現(xiàn)VS的轉錄物。三、質粒的遺傳一般線粒體質粒的遺傳與線粒體和線粒體DNA(mtDNA)有相同的遺傳方式。在有性雜交中，母本的質粒絕大多數(shù)或全部地傳遞給子代，一個例外是四孢殼孢菌AL2菌株中的pAL2-1質粒，當AL2在雜交中作為母本時，有些后代不含質粒。 實驗室內的研究表明,在種內和種間存在著水平轉移。粗糙脈孢霉菌中的Kalilo

37、和Maranhar質粒能通過異核現(xiàn)象在菌株間進行水平轉移。另外，中脈孢霉菌和粗糙脈孢霉菌混合培養(yǎng)時，前者的Kalilo質粒能夠進入粗糙脈孢霉菌不含質粒的菌株中，一定是通過部分或瞬間異核體。 在麥角菌中，天然質粒通過原生質融合能從一個菌株轉移到另一個菌株中。研究也發(fā)現(xiàn)Kalilo質粒存在于脈孢菌和Gelasinospora species中，可能是種間轉移的結果，也可能是來自相同的祖先。四、質粒整合到mtDNA 中脈孢霉菌的 Kalilo質粒和粗糙脈孢霉菌中的 Mauriceville質粒能整合到線粒體DNA上，引起寄主菌株的衰老和死亡。大多數(shù)野生型菌株并衰老，而是在長的生長管中繼續(xù)生長。衰老表

38、型是一種反常現(xiàn)象，表明質粒的存在與菌株的衰老呈正相關，質粒的轉移也引起衰老表型在菌株間的轉移，最終在寄主死亡之前或死亡之時，幾乎所有衰老菌株的mtDNA分子都是整合型，但游離的質粒也存在于培養(yǎng)物中。DNA的致死作用還不清楚,但有證據(jù)表明，質粒的過度復制使線粒體蛋白的合成受到抑制，則引起宿主菌的衰老。a 質粒 Mauriceville和Kalilo插入方式與以前在真核或原核生物中觀察到的插入方式完全不同。其機理還有待深入研究。五、質粒的復制 1.環(huán)狀質粒的復制 脈孢菌環(huán)狀質粒的復制一直是較有興趣的研究課題。最新研究表明，Mauriceville 編碼的反轉錄酶，與質粒的復制有關。 2.線狀質粒的

39、復制 許多絲狀真菌中的線型質粒，都具有末端重復序列TIR和共價結合蛋白TP(表 )。 表 絲狀真菌中具有TIR和TP的線型質粒 質粒 來源 大小 TIR TP pA12 Ascobolus immerses 5.6 kb 700 bp 有 pMC32 Morchella cortica 6 kb 750 bp 不詳 pCF637 Ceratocystis fimbriata 8.2 kb 不詳 有 pFQ501 Ceratocystis fimbriata 6 kb 750 bp 不詳 pRS64 立枯絲核菌(Rhizoctonia solani) 2.6 kb 不詳 不詳 pEM Agaricus bitorquis 7.3 1 kb 不詳 pMPJ Agaricus bitorquis 3.6 不詳 不詳 kal DNA 中脈孢菌(Neurospora intermedia) 9 kb 1361 bp 有 pFOXC1 尖胞鐮刀菌(Fusarium oxysporum) pFOXC2 尖胞鐮刀菌(Fusarium oxysporum) 1.9 kb 50 bp 有 pFOXC3 尖胞鐮刀菌(Fusarium oxysporum) pCIK1 Claviceps purpurea 6.