1、微生物檢驗概述一、臨床微生物檢驗的目的和要求二、標本的和運送三、微生物檢驗四、血清學五、臨床微生物六、動物試驗七、免疫檢測技術八、發光分析技術九、鱟試驗安全措施和質量保證十、分子生物學在病原微生物中的應用微生物檢驗即臨床微生物學或微生物學，是在醫學微生物學的范疇內，與臨床醫學密切結合，側重和防止性疾病快速、準確地檢出病原體的策略與方法，為臨床繼續擴散的學科。提供依據，并指導進一步合理用藥臨床微生物工作的第一步就是要正確、規范地和運送標本，然后根據微生物檢驗的特點和臨床要求進行初步和確定。注意不要將從分離的一種非病原菌輕易認為是污染菌，也不要輕易認為發現的病原微生物就一定是該的病原，一定要結合臨

2、床，具體問題具體分析。另外要配合臨床醫生，積極參與臨床選擇抗菌藥物的工作，促進抗生素的合理使用。臨床細菌物，為臨床的主要工作是從臨床標本中分離出病原菌并進行準確鑒定，同時指導臨床合理應用藥、治療、預后和流行病學以及醫院內的提供可靠的依據。一、臨床微生物檢驗的目的和要求（一）臨床微生物檢驗的目的1.為臨床性疾病的提供病原學依據。2.為臨床性疾病的治療提供參考用藥的信息。3.為醫院提供病原微生物及其耐藥性動態信息。4.改進或更新臨床微生物檢驗的方法。（二）臨床微生物學檢驗的要求1.快速、準確地提出檢驗。2.檢驗必須有較豐富的微生物學基礎知識和熟練、正確的操作技能，必須養成有菌觀點和無菌操作的。3.

3、臨床微生物檢驗必須進行全面質量控制，并參加和接受質量控制考核。4.重視（三）滅菌工作。試驗的選擇原則1.選擇有鑒定價值的試驗 要對兩種細菌進行鑒定，須選擇一項兩種菌呈現截然不同結果的試驗，即一種菌呈現陽性（陽性反應的菌株陽性率須大于 90%），另一種菌為反應的菌株陽性率應小于 10%），這項試驗才有鑒定價值。否則，就沒有鑒定價值。2.選擇簡易、快速、方便的試驗鑒定一種細菌可能有多種特異的方法，只選擇其中一或兩種達到目的即可，多選無意義。如金黃色葡萄球菌凝固酶試驗、耐熱 DNA 酶試驗、甘露醇分解試驗均陽性，只選較簡單的凝固酶試驗就足夠了。選擇操作簡便、快速的方法。選用復合培養基，一次操作可同時

4、看幾個生化反應。3.綜合考慮試驗的敏感性和特異性敏感性所有陽性結果數所有數，試驗敏感性越高，假結果就越少。特異性結果總數未數，特異性越高，假陽性結果越少。試驗的敏感性和特異性是相互聯系的，試驗的敏感性增加，會使特異性下降，反之亦然。二、標本的（一）標本1.早期和運送的一般原則時間最好是病程早期、急性期或癥狀典型時，而且必須在使用抗生素或其他抗菌藥物之前。2.無菌的標本應無外源性污染。在血液、腦脊液、胸腔積液、關節液等無菌標本時，應注意對局部及周圍皮膚的，嚴格進行無菌操作；對于與外界相通的腔道，如竇道標本應由竇道底部取活組織檢查，而不應從竇道口取標本，以免受皮膚表面正常菌群的污染，造成和誤診；對

5、于從正常菌群寄生部位（如口腔）的標本，應明確檢查的目的菌，在進行分離培養時，采用特殊選擇性培養基。的標本均應盛于無菌容器內，盛標本的容器須先經高壓滅菌、煮沸、干熱等物理方法滅菌，或用無菌容器，而不能用劑或酸類處理。3.根據目的菌的特性用不同的方法厭氧菌、需氧或兼性厭氧菌，以及 L 型菌采用的方法不同。如尿液標本，疑為厭氧菌時，應以無菌注射器從恥骨上緣行穿刺術抽取；若懷疑是需氧或兼性厭氧菌的，則可通過自然導尿獲取標本。4.適量標本量不應過少，而且要有代表性，同時有些標本還要注意在不同時間不同部位標本。如腸熱癥患者，發病的第 1血液，第 2糞便和尿液，否則影響細菌檢出率。5.安全標本時不僅要防止皮

6、膚和黏膜正常菌群對標本的污染，同時也要注意安全，防止和自身。（二）標本的處理腦膜炎菌、菌和流感桿菌等應保溫并立即送檢；其他所有的標本后最好在 2h 之內送到。若不送檢，尸檢組織、支氣管洗液、心包液、痰、尿等標本應保存在 4環境中;腦脊液、滑膜液等則要在 25保存;用于細菌培養的標本保存時間不應超過 24h。標本中可能致病菌，不管標本運送距離遠近，都必須注意安全防護。標本切勿污染容器的瓶口和外壁，容器必須包裝好，防止送檢過程中倒翻或碰破流出。對于烈性傳染病標本運送時更要特別嚴格，必須按規定包裝，由專人運送。厭氧性標本應放在專門的運送瓶或試管內運送，有時可直接用抽取標本的注射器運送。三、微生物檢驗

7、臨床微生物學接到標本后應立即進行微生物檢驗。主要包括直接鏡檢、檢測特異性抗原或病原體成分、進行分離培養和鑒定、體外藥敏試驗等，各種檢查方法的比較見表。微生物檢查方法、判斷和速度方法鑒定類型速遞直接鏡檢初步510min免疫熒光（直接法）快速12h乳膠凝集快速1530min對流免疫電泳快速2h氣-液相色譜鑒定1.52h（一）直接鏡檢標本經涂片染色或濕片鏡檢，有些標本如尿液、腦脊液等經過離心濃縮后鏡檢出其初步結果對疾病有參考價值。直接鏡檢對于確定進一步檢出步驟及鑒定方法也很有幫助。另外，直接鏡檢還可評價標本是否符合檢驗要求。（二）快速快速檢測病原體成分主要是指特異性抗原和核酸檢測。特異性抗原檢測包括

8、免疫熒光技術、膠乳凝集試驗、酶免疫技術、對流免疫電泳、化學發光免疫測定等。核酸檢測包括核酸探針雜交、PCR 技術。其他快速檢測法還有氣-液相色譜法、化學發光、生物發光測定法和（三）直接藥敏試驗或蛋白微型陣列技術等。直接藥敏試驗即在分離培養病原體的同時，直接將臨床標本接種于平板，用抗生素紙片作藥物敏感性試驗，在 1824h 內可獲得結果。但因其在試驗時接種量難以標準化，且對混有雜菌和混合易明確其結果，故分離出純培養物后應再作體外藥物敏感試驗。（四）常規檢驗的標本不1.分離培養通常由正常無菌部位采取的標本接種血平板，置于空氣或含 5%10%CO2 的氣缸中培養，大部分細菌可于 2448h 生長良好

9、。若原始培養為，但據鏡檢結果和臨床信息提示可能有病原菌存在，則應再大量標本，離心濃縮或溶解離心法處理，取沉淀接種營養豐富的需氧或厭氧培養基來培養。對于存在正常菌群部位的標本，分離時應采用選擇培養基以利于病原菌生長，也可加某些抗生素抑制污染菌的生長。對于某些標本中發現的細菌，如的尿液中檢出大腸，可能是病原菌，也可能是污染菌或正常菌群，其臨床意義的確定有賴于定量培養法。即取一定量的標本如液體標本用液體培養基作一系列稀釋；組織標本稱量后制成懸液，并稀釋成 10-1，10-2，10-3 等。分別取 0.1ml 涂布于血瓊脂平板或傾注培養，35 24h 后計算每毫升或每克標本所含細菌數。鑒定 分離出的細

10、菌一般應經過細菌形態、菌落特點、生化反應、血清學試驗、動物接種等鑒定。目前尚有某些微量鑒定系統，其鑒定快速、簡便，值得推廣。體外純菌藥物敏感性試驗 常用方法包括抑菌試驗、殺菌試驗、聯合藥敏試驗和檢測細菌產生的抗生素滅活酶等。（五）直接鏡檢要求 2h 內，說明標本是否合格，發現微生物的情況和特點；初步鑒定和直接藥敏結果于24h 或次晨，可能的病原菌和直接藥敏結果；最后鑒定和細菌藥敏結果一般不超過 3d，還規定除血培養外，所有送檢標本必須在 24h 內預報。四、血清學血清學即用已知抗原檢測血清中抗體的方法，微生物的血清學見下表。病原體后經過一定時間產生特異性抗體，這種抗體在體內一般可持續數月或更長

11、，故檢測抗體可用于病原體，在作血清學時，一般要在病程早期和晚期分別采血清標本 23 份檢查，抗體效價呈 4 倍或以上增長才有價值。除非檢測 IgM，單份血清一般意義不大。如表：微生物的血清學試驗抗原疾病（舉例）凝集試驗細菌全細胞抗原傷寒、副傷寒（肥達反應）斑疹傷寒、恙蟲病（反應）、布魯菌病、土拉DNA 探針快速、鑒定13 天PCR快速數小時微量鑒定系統鑒定36h常規法確定數天或以上續表續表五、臨床微生物（一）安全措施和質量保證來源1.在檢驗操作過程中的各個環節都可能產生的微生物氣溶膠。2.接觸材料或使之附著于衣服帶出室外以及其他偶然事故如菌液滴落于物體表面，注射時不慎刺破皮膚等。針對以上源，若

12、不進行正當防護或及時處理均易引起。故臨床微生物工作者應注意個人防護，檢驗時必須穿工作服、戴、帽子，根據需要戴防護眼鏡和橡膠手套，離去時更衣、洗手。臺面在工作完畢或被材料污染時應立即用液處理。（二）性廢棄物的處理1.任何污染材料不能拿出。2.液體廢棄物必須收集在防漏、未破的容器內，經高濃度的化學劑處理。3.對剩余標本、接種過的培養基、菌種等丟棄前均需適當。4.動物房的廢物在處理前及動物籠被前均需，最好經高壓蒸氣滅菌。5.對于任何有污染的銳器如針頭、注射器、玻片等在處理前不要用手接觸。（三）微生物微生物對細菌檢驗操作手冊；的室內質控的室內質控包括：的要求；試驗抗原疾病（舉例）放射免疫測定微生物抗原

13、乙型肝炎ELISA微生物全細胞或可溶性抗原各類微生物腸毒素血凝抑制試驗呼吸道、蟲媒中和試驗大部分病鏈球菌體外產物風濕熱（溶血素 O,DNA 酶等）鏈球菌咽部試驗抗原疾病（舉例）乳膠凝集試驗乳膠吸附微生物可溶性抗原腦膜炎菌、新型隱球菌腦膜炎，流感桿菌、等間接血細胞凝集試驗紅細胞吸附微生物可溶性抗原、肝炎補體結合試驗微生物全細胞或可溶性抗原許多病，一些真菌病、Q 熱間接免疫熒光技術微生物抗原或細胞內形成的抗原各類微生物人O 型紅細胞熱、鉤體病、支原體（冷凝集）沉淀試驗（包括絮狀沉積、免疫擴散、對流免疫電泳）心類脂-卵磷脂-膽固醇 微生物可溶性抗原（VDRL、RPP）真菌病、肝炎等儀器設備的功能監測

14、；培養基的質量控制；試劑、染色液以及抗生素的質量控制；標本檢驗的質量控制；標準菌株的來源和保存及室內質量的全面控制。六、動物試驗（一）動物試驗種類、原理動物實驗主要用于分離和鑒定病原微生物，檢測細菌毒性產物，觀察病原微生物的致病性。常用實驗動物有大鼠、小鼠、豚鼠、家兔及綿羊等。（二）試驗動物選擇原則和動物接種法1.試驗動物選擇 原則選擇合適的試驗動物是十分必要的，主要包括對待試微生物敏感性、動物的遺傳種系特征及動物體內和體表微生物群鑒定，以及動物根據實際情況選擇敏感動物和選用等級動物。、體重、和數量等。進行動物試驗時應2.動物接種法 主要有皮內接種法、皮下接種法、肌肉接種法、靜脈接種法、腹腔接

15、種法和腦內接種法。動物接種后應觀察 12 次，并按試驗要求作詳細試驗。（三）動物試驗的應用1.分離和鑒定病原菌 有些微生物必須通過動物試驗進行分離，如菌的致病性也只有動物試驗才能最終確定。次體及某些等，結核分枝桿2.細菌毒素檢測 用動物試驗檢測細菌毒素是了解病原微生物毒力和致病力的一個重要方面，常用方法有白喉棒狀桿菌毒力試驗、破傷風梭菌毒力保護試驗、大腸腸毒素檢測。七、免疫檢測技術微生物學中常用的免疫檢測技術包括凝集反應、沉淀反應、補體結合試驗、免疫熒光技術、酶免疫測定及皮膚反應等。八、發光分析技術發光分析技術是依賴酶或化學反應能量引起發光物質（如、熒光素等）發光的檢測方法。具有操作簡便、快速

16、、敏感度高、無污染特點。根據發光原理，主要分為生物及化學發光兩種方法。九、鱟試驗鱟變形細胞溶解物試驗簡稱鱟試驗。其基本原理是內毒素在堿性金屬離子存在下激活鱟試劑中凝固酶原轉變為凝固酶，凝固酶使存在于鱟試劑中的凝固蛋白原生成凝固蛋白，產生凝膠。凝膠的形成速度及其堅固程度與內毒素濃度有關。鱟試驗陽性表明有革蘭染色菌或內毒素血癥，也可用于生物制品或注射液的內毒素污染檢測。十、分子生物學在病原微生物中的應用（一）分子生物學概念分子生物學是一門從分子水平上物的生命活動及其規律的科學，是當命科學中的前沿學科。檢驗醫學領域毫無例外地得益于分子生物學的滲透，利用核酸大分子的遺傳信息庫，為進技術。疾病提供了先（

17、二）概念是指應用工程技術對生物體的組 DN段及其轉錄產物進行定性和定量分析，進而對狀態和疾病作出。技術可克服病原微生物的傳統檢測方法靈敏度低、特異性低及速度慢等不足之處，并可用于流行病學的大量現場篩查工作。【例題】臨床微生物學檢驗的目的不包括為臨床為臨床 C.為醫院性疾病的提供病原學依據性疾病的治療提供參考用藥的信息提供病原微生物及其耐藥性動態信息D.改進或更新臨床微生物學檢驗的方法E.無論是何標本，要培養出菌，就要鑒定出來并做出藥敏正確E臨床微生物檢驗的目的為臨床為臨床為醫院性疾病的提供病原學依據。性疾病的治療提供參考用藥的信息。提供病原微生物及其耐藥性動態信息。4.改進或更新臨床微生物檢驗的方法。【例題】下面關于直接鏡檢的說法不正確的是A.尿液、腦脊液等標本經過離心濃縮后可鏡檢出初步結果B.510min 內即出結論C.直接