1、人類細胞質RNA的提取宣講人：張藍月制作人：張藍月，張婧靚，李婧婧 RNA是基因表達的中間產物，真核生物的RNA存在于細胞質、細胞核以及線粒體中。其中細胞核RNA包括不均一核RNA（hnRNA）、核小RNA（snRNA）等，細胞質RNA包括rRNA、tRNA和mRNA等。RNA的性質u為多元酸，具有較強的酸性，是線性高分子。u通常以單鏈形式存在，但可以通過鏈內的堿基配對形成局部的雙鏈二級結構和空間的高級結構。u一些非編碼RNA參與基因表達的調控。u在紫外波段有較強的光吸收，在中性條件下，最大吸收值在260nm附近。 根據260nm處的吸光度，可以確定出溶液中的RNA含量；利用A260/A280

2、還可以判斷所提取的核酸樣品的純度，RNA純品的A260/A280應為2.0u具有不穩定性。RNA的不穩定性 由于核糖殘基的2和3位置帶有羥基，RNA易于被RNA酶切割水解。 RNA酶含量豐富，加熱后仍能夠正確折疊恢復活性，不易失活。 所以提取RNA時必須在無RNA酶的環境中在提取RNA的過程中需要RNA酶抑制劑來抑制RNA酶的活性，保護RNA分子不被降解。常用的RNA酶抑制劑 異硫氰酸胍：目前被認為是最有效的RNA酶抑制劑，它在裂解組織的同時也使RNA酶失活。它既可破壞細胞結構使核酸從核蛋白中解離出來，又對RNA酶有強烈的變性作用。 氧釩核糖核苷復合物：是由氧化釩離子和核苷形成的復合物，它和R

3、NA酶結合形成過渡態類物質，幾乎能完全抑制RNA酶的活性。 RNA酶的蛋白抑制劑（RNasin）：是從大鼠肝或人胎盤中提取得來的酸性糖蛋白。RNasin是RNA酶的一種非競爭性抑制劑，可以和多種RNA酶結合，使其失活。 焦碳酸二乙酯（DEPC）：是一種強烈但不徹底的RNA酶抑制劑。它通過和RNA酶的活性基團組氨酸的咪唑環結合使蛋白質變性，從而抑制酶的活性。 其它：SDS、尿素、硅藻土等對RNA酶也有一定抑制作用。細胞質RNA提取的一般步驟與常用方法u 一般步驟 破碎組織分離RNA沉淀RNA洗滌RNA融解RNA保存RNAu常用方法 由于RNA的種類和來源很多，因而提取制備方法各異，一般有苯酚法、

4、去污劑法和鹽酸胍法，其中苯酚法（即Trizol法）實驗室最常用。u工業上常用稀堿和濃鹽酸法提RNA，且用這兩種方法提取的核酸均為變性RNA，主要用于制備核苷酸。Trizol法提取細胞質RNA的優點 無論是人、動物、植物還是細菌，Trizol法對其均有較好的分離效果。 TRIZOL試劑操作上的簡單性允許同時處理多個樣品，所有的操作可以在一小時內完成。 TRIZOL抽提的總RNA能夠避免DNA和蛋白的污染。如果是用于PCR，當兩條引物位于單一外顯子內時，建議用級聯擴大的DNase I(Cat.No. 18068)來處理抽提的總RNA。 TRIZOL 試劑能促進不同種屬不同分子量大小的多種RNA 的

5、析出。Trizol法提取細胞質RNA的基本原理 由于細胞內的大部分RNA是以核糖體的形式存在，所以在提取RNA時要利用高濃度的蛋白質變性劑，迅速破壞細胞結構，使核蛋白與RNA分離，釋放出RNA。 組織勻漿后再通過苯酚、氯仿等有機溶劑處理離心，RNA即溶于上層被酚飽和的水相中，向水相加冷乙醇后， RNA即以白色絮狀沉淀析出。Trizol法提取細胞質RNA的試劑 苯酚、異硫氰酸胍、B-巰基乙醇、氯仿、異丙醇、乙醇等 因為這些試劑都會影響后續實驗，所以要用酒精洗一到兩遍。 提取緩沖液中一般含SDS（十二烷基硫酸鈉）、酚、氯仿、胍鹽等蛋白質變性劑，也能抑制RNA酶活性，并有助于除去非核酸成分。Trizol法提取細胞質RNA的步驟破碎組織RNA分離RNA沉淀RNA洗滌RNA異丙醇RNA的上清液提取細胞質RNA的應用及意義 分析不同發育時期基因的表達狀況 獲得新基因 研究基因的拼接 分