1、第二章第二章滅活劑、保護劑與免疫佐劑滅活劑、保護劑與免疫佐劑本章內容本章內容第一節第一節 滅活劑滅活劑123滅活與滅活劑概念滅活與滅活劑概念常用滅活劑的滅活機理與應用常用滅活劑的滅活機理與應用影響滅活作用的因素影響滅活作用的因素滅活與滅活劑滅活與滅活劑一一滅活滅活: : 是指破壞微生物的生物學活性、繁殖能力和致病是指破壞微生物的生物學活性、繁殖能力和致病性，但盡可能不影響其免疫原性，被滅活的微生物主性，但盡可能不影響其免疫原性，被滅活的微生物主要用于生產滅活疫苗；或指破壞要用于生產滅活疫苗；或指破壞 診斷血清或待檢血診斷血清或待檢血清中的補體活性，以避免補體對診斷試驗的干擾作用。清中的補體活性

2、，以避免補體對診斷試驗的干擾作用。滅活劑滅活劑: : 用于滅活微生物的化學試劑或藥物稱為滅活劑。用于滅活微生物的化學試劑或藥物稱為滅活劑。第一節第一節 滅活劑滅活劑滅活方法滅活方法: : 物理方法（不用），化學方法（常用）物理方法（不用），化學方法（常用）常用滅活劑的常用滅活劑的滅活機理與應用滅活機理與應用二二甲醛溶液甲醛溶液烷化劑烷化劑苯酚苯酚-丙酰內酯丙酰內酯使微生物核酸烷基化使微生物核酸烷基化, ,滅活后加滅活后加2%2%硫代硫代 硫酸鈉中斷滅活硫酸鈉中斷滅活用于診斷抗原的制備：雞白痢抗原用于診斷抗原的制備：雞白痢抗原第一節第一節 滅活劑滅活劑甲醛甲醛滅活機理：滅活機理：第一節第一節 滅

3、活劑滅活劑 甲醛甲醛 醛基醛基 氨基氨基 甲基胺甲基胺 羧基羧基 亞甲基二醇單酯亞甲基二醇單酯 巰基巰基 亞甲基二醇亞甲基二醇 羥基羥基 羥基甲酚羥基甲酚甲醛甲醛滅活濃度：滅活濃度：多數為多數為0.10.10.30.3第一節第一節 滅活劑滅活劑滅活原則：滅活原則：低濃度、短時間而又能達到徹底滅活目的；低濃度、短時間而又能達到徹底滅活目的；必要時可在滅活后加入硫代硫酸鈉，以中斷其反應。必要時可在滅活后加入硫代硫酸鈉，以中斷其反應。烷化劑烷化劑滅活機制：滅活機制：第一節第一節 滅活劑滅活劑1. 烷化烷化DNA分子中的分子中的鳥嘌呤或腺嘌呤鳥嘌呤或腺嘌呤等，引起單鏈等，引起單鏈斷裂或雙螺旋鏈交聯，因

4、改變斷裂或雙螺旋鏈交聯，因改變DNA的結構而破壞其的結構而破壞其功能，功能，妨礙妨礙RNA的合成，的合成，從而抑制細胞的有絲分裂。從而抑制細胞的有絲分裂。2. 與酶系統和核蛋白起作用而干擾核酸代謝。與酶系統和核蛋白起作用而干擾核酸代謝。優點：優點：能破壞病毒的核酸芯髓，使病毒完全喪失感能破壞病毒的核酸芯髓，使病毒完全喪失感染力，而不損害其蛋白衣殼，保留其保護性抗原。染力，而不損害其蛋白衣殼，保留其保護性抗原。滅活時間滅活時間滅活溫度滅活溫度微生物微生物種類和特性種類和特性滅活劑特滅活劑特異性異性滅活劑濃滅活劑濃度度滅活滅活PH值值第一節第一節 滅活劑滅活劑影響影響因素因素有機物存在有機物存在第

5、二節保護劑（穩定劑）第二節保護劑（穩定劑）123保護劑概念及用途保護劑概念及用途保護劑的分類保護劑的分類影響保護效能的因素影響保護效能的因素4常用的凍干保護劑（穩定劑）常用的凍干保護劑（穩定劑）5獸醫生物制品常用的保護劑獸醫生物制品常用的保護劑第二節第二節 保護劑（穩定劑）保護劑（穩定劑）一、保護劑一、保護劑 （stabilizer） 保護劑用途保護劑用途不同用途加不同保護劑不同用途加不同保護劑, 主要針對活的微生物或細胞。主要針對活的微生物或細胞。p菌種或毒種保存：常用甘油作保護劑菌種或毒種保存：常用甘油作保護劑第二節第二節 保護劑（穩定劑）保護劑（穩定劑）二、保護劑的分類二、保護劑的分類根

6、據作用機理根據作用機理滲透劑滲透劑:如二甲基亞如二甲基亞砜砜(DMSO),甘油和甘油和蔗糖等蔗糖等.非滲透劑非滲透劑:如聚乙烯如聚乙烯吡咯啶酮吡咯啶酮(PVP)和和蛋白質等蛋白質等.根據分子量大小根據分子量大小高分子物質高分子物質低分子物質低分子物質根據化學性質根據化學性質復合物、糖類、復合物、糖類、鹽類、醇類、酸鹽類、醇類、酸類和聚合物類和聚合物第二節第二節 保護劑（穩定劑）保護劑（穩定劑） 復合物復合物 脫脂乳、明膠、蛋白質、蛋白胨、糊精、血清、甲基纖維素等脫脂乳、明膠、蛋白質、蛋白胨、糊精、血清、甲基纖維素等糖類糖類 蔗糖、乳糖、麥芽糖、葡萄糖、果糖等蔗糖、乳糖、麥芽糖、葡萄糖、果糖等鹽

7、類鹽類 乳酸鈣、谷氨酸鈉、氯化鈉、氯化鉀、醋酸銨、硫代硫酸鈉等乳酸鈣、谷氨酸鈉、氯化鈉、氯化鉀、醋酸銨、硫代硫酸鈉等醇類醇類 山梨醇、甘油、甘露醇、肌醇、木糖醇等山梨醇、甘油、甘露醇、肌醇、木糖醇等酸類酸類 檸檬酸、酒石酸、氨基酸等檸檬酸、酒石酸、氨基酸等聚合物聚合物 葡聚糖、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮葡聚糖、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)等等一些常用的冷凍干燥保護劑一些常用的冷凍干燥保護劑分分 類類 保保 護護 劑劑第二節第二節 保護劑（穩定劑）保護劑（穩定劑）凍干保護劑作用組成凍干保護劑作用組成1. 營養液營養液3. 抗氧化劑抗氧化劑第二節第二節 保護劑（穩定劑）保護劑（穩定劑）2. 賦

8、形劑賦形劑可修復因凍干而受損可修復因凍干而受損的細胞，使凍干制品含的細胞，使凍干制品含有一定量水分；有一定量水分； 可促進高分子物質形可促進高分子物質形成骨架，使凍干制品呈成骨架，使凍干制品呈多孔的海綿狀。多孔的海綿狀。防止低分子物質的碳防止低分子物質的碳化和氧化，保護活性物化和氧化，保護活性物質不受加熱影響，質不受加熱影響，使凍干制品形成多孔使凍干制品形成多孔性、疏松的海綿狀物，性、疏松的海綿狀物，增加溶解度。增加溶解度。 抑制凍干制品中的抑制凍干制品中的酶作用，增加生物活性酶作用，增加生物活性物質在凍干后貯存期間物質在凍干后貯存期間的穩定性，如維生素的穩定性，如維生素C、維生素維生素E和硫

9、代硫酸鈉和硫代硫酸鈉等。等。凍干保護劑作用機制凍干保護劑作用機制1、 防止活性物質失去結構水及阻止結構水防止活性物質失去結構水及阻止結構水形成結晶而導致生物活性物質的損傷；形成結晶而導致生物活性物質的損傷；第二節第二節 保護劑（穩定劑）保護劑（穩定劑）2、降低細胞內外的滲透壓差、防止細胞、降低細胞內外的滲透壓差、防止細胞內結構水結晶，以保持細胞的活力；內結構水結晶，以保持細胞的活力；3、保護或提供細胞復蘇所需的營養物質，、保護或提供細胞復蘇所需的營養物質，有利于生活力的復蘇和迅速修復自身。有利于生活力的復蘇和迅速修復自身。1234第二節第二節 保護劑（穩定劑）保護劑（穩定劑）三、影響保護劑效能

10、的因素三、影響保護劑效能的因素不同種類微生物需要添加不同保護劑不同種類微生物需要添加不同保護劑 （一）細菌的保護劑（一）細菌的保護劑四、常用的凍干保護劑四、常用的凍干保護劑(穩定劑穩定劑)第二節第二節 保護劑（穩定劑）保護劑（穩定劑）（二）病毒的保護劑（二）病毒的保護劑四、常用的凍干保護劑四、常用的凍干保護劑(穩定劑穩定劑)第二節第二節 保護劑（穩定劑）保護劑（穩定劑）五、獸醫生物制品常用的保護劑五、獸醫生物制品常用的保護劑1.5%1.5%蔗糖脫脂乳蔗糖脫脂乳 蔗糖蔗糖(或乳或乳糖糖)5g,加脫脂乳加脫脂乳至至100ml,充分充分后后,110116高高壓滅菌壓滅菌3040 min.3.SPGA

11、3.SPGA保護劑保護劑蔗糖蔗糖76.62g76.62g、磷酸、磷酸二氫鉀二氫鉀0.52g0.52g、磷酸、磷酸氫二鉀氫二鉀1.64g1.64g、谷氨、谷氨酸鈉酸鈉0.83g0.83g、牛血清、牛血清白蛋白白蛋白10g10g、加去離、加去離子水至子水至1000ml1000ml，混，混合溶解合溶解, ,過濾除菌過濾除菌。 2.根據化學性質根據化學性質明膠明膠:2%-3%(g/m1):2%-3%(g/m1)、蔗糖蔗糖5%(g/m1)5%(g/m1)、硫脲硫脲1%-2%(g/m1)1%-2%(g/m1)。 先將先將12%-18%12%-18%明膠液、明膠液、30%30%蔗糖液和蔗糖液和6%-12%6

12、%-12%硫脲液加熱溶解，硫脲液加熱溶解，1 1 6 1 1 6 高 壓 滅 菌高 壓 滅 菌3040min3040min； 第二節第二節 保護劑（穩定劑）保護劑（穩定劑）一、佐劑概念與作用機理一、佐劑概念與作用機理1. 1. 佐劑佐劑( (新新):):凡是可以增強抗原特異性免疫應答的物質。凡是可以增強抗原特異性免疫應答的物質。2. 2. 佐劑佐劑( (舊舊):):當一種物質先于抗原或與抗原混合或同當一種物質先于抗原或與抗原混合或同時注射于動物體內，能非特異性地改變或增強機體對該時注射于動物體內，能非特異性地改變或增強機體對該抗原的特異性免疫應答抗原的特異性免疫應答, ,發揮其輔佐作用的物質發

13、揮其輔佐作用的物質. . 以前作為佐劑使用時沒有免疫原性以前作為佐劑使用時沒有免疫原性, ,但現在有所改變但現在有所改變, ,如如IL-2IL-2佐劑和佐劑和IL-8IL-8一類細胞因子佐劑卻不一樣一類細胞因子佐劑卻不一樣, ,具有免具有免疫調節和免疫增強作用疫調節和免疫增強作用, ,單獨使用時卻具有免疫原性。單獨使用時卻具有免疫原性。注意注意: :佐劑和免疫增強劑的關系佐劑和免疫增強劑的關系? ? 有時佐劑也是免疫增強劑有時佐劑也是免疫增強劑. .第三節第三節 免疫佐劑免疫佐劑一、佐劑概念與作用機理一、佐劑概念與作用機理3.3.作用特點作用特點1)1)明顯增強抗原性微弱的物質誘導機體產生特異

14、明顯增強抗原性微弱的物質誘導機體產生特異性免疫應答。性免疫應答。2)2)用最少的抗原和最少的接種次數，產生足用最少的抗原和最少的接種次數，產生足 夠的免疫應答。夠的免疫應答。第三節第三節 免疫佐劑免疫佐劑一、佐劑概念與作用機理一、佐劑概念與作用機理4.4.作用方式作用方式 1）改變正常免疫機能,吸引大量巨噬細胞以吞噬抗原. 2）改變抗原構型,使抗原物質降解,并加強其免疫原性； 3）延長抗原在組織內的貯存時間,使抗原緩慢降解和緩釋,并發揮免疫系統的細胞間協同作用（巨噬細胞與T細胞，T細胞與B細胞）。 第三節第三節 免疫佐劑免疫佐劑一、佐劑概念與作用機理一、佐劑概念與作用機理5.5.作用機理作用機

15、理 1 1）抗原遞呈（）抗原遞呈（antigen presentationantigen presentation） 2 2）抗原尋的（）抗原尋的（antigen targetingantigen targeting） 3 3）免疫調節（）免疫調節（immune modulationimmune modulation）第三節第三節 免疫佐劑免疫佐劑1)1)抗原遞呈抗原遞呈: :指抗原分子遞呈給指抗原分子遞呈給T T細胞的方法。細胞的方法。第三節第三節 免疫佐劑免疫佐劑 佐 劑 與佐 劑 與疫苗聯合使疫苗聯合使用，有助于用，有助于抗原性物質抗原性物質在胞內被加在胞內被加工，被工，被MHCMHC分

16、分子特異性的子特異性的結合、保護、結合、保護、運輸并遞呈運輸并遞呈給效應細胞。給效應細胞。2)2)抗原尋的抗原尋的: :指抗原傳遞給免疫系統中適當效應細胞的效指抗原傳遞給免疫系統中適當效應細胞的效率。包括吸引巨噬細胞到達組織部位、活化吞噬細胞、促進率。包括吸引巨噬細胞到達組織部位、活化吞噬細胞、促進抗原與細胞受體的結合等有重要作用。抗原與細胞受體的結合等有重要作用。第三節第三節 免疫佐劑免疫佐劑3)3)免疫調節免疫調節: : 是指任何可以修飾的免疫效應細胞對抗原或是指任何可以修飾的免疫效應細胞對抗原或表位進行加工的機制表位進行加工的機制. .通過這種機制，可以改變特異性免疫通過這種機制，可以改

17、變特異性免疫應答的本質或強度應答的本質或強度.T.T細胞有細胞有Th1Th1和和Th2Th2兩個亞類兩個亞類. .同一抗原和同一抗原和不同佐劑一起使用能夠引起不同的免疫反應不同佐劑一起使用能夠引起不同的免疫反應. .因此因此, ,通過篩通過篩選特定的佐劑選特定的佐劑, ,可以達到誘導正確的免疫應答的目的。可以達到誘導正確的免疫應答的目的。 第三節第三節 免疫佐劑免疫佐劑1.1.按物理性質按物理性質l顆粒型佐劑顆粒型佐劑l非顆粒型佐劑非顆粒型佐劑2.2.按生物學性質按生物學性質l微生物及其組分微生物及其組分l非微生物物質非微生物物質3.3.按佐劑在體內存留的時間按佐劑在體內存留的時間l貯存型佐劑

18、（貯存型佐劑（depot type adjuvant）l非貯存型（非貯存型（non-depot type adjuvant）二、佐劑的分類二、佐劑的分類第三節第三節 免疫佐劑免疫佐劑第三節第三節 免疫佐劑免疫佐劑1 1鹽類佐劑鹽類佐劑 氫氧化鋁膠、明礬、磷酸鋁等。氫氧化鋁膠、明礬、磷酸鋁等。2 2油水乳劑佐劑油水乳劑佐劑 弗氏完全佐劑（弗氏完全佐劑（FreundFreunds complete adjuvant, FCAs complete adjuvant, FCA） 弗氏不完全佐劑（弗氏不完全佐劑（ FIAFIA）和礦物油白油佐劑。）和礦物油白油佐劑。3 3免疫刺激復合物佐劑（免疫刺激復合

19、物佐劑（ISCOMISCOM）4 4蜂膠佐劑（蜂膠佐劑（propolispropolis）5 5脂質體佐劑（脂質體佐劑（liposomesliposomes）。）。6 6其他：其他：MF59MF59佐劑、微囊化佐劑（佐劑、微囊化佐劑（micro-encapsulation)micro-encapsulation)、 硬脂酰酪氨酸佐劑和硬脂酰酪氨酸佐劑和菊粉等。菊粉等。（一）顆粒型佐劑（一）顆粒型佐劑第三節第三節 免疫佐劑免疫佐劑（一）顆粒型佐劑（一）顆粒型佐劑1.1.鹽類佐劑：氫氧化鋁膠、明礬、磷酸鋁等。鹽類佐劑：氫氧化鋁膠、明礬、磷酸鋁等。氫氧化鋁膠合成方法氫氧化鋁膠合成方法: : （1）用

20、鋁粉加燒堿合成法 2Al(OH)3+12H2O+3H2SO4Al2(SO4)318H2O A12(SO4)318H2O+6NaOH2Al(OH)3+2Na2SO4+18H2O（2）用明礬加碳酸鈉合成法 2KAl(SO4)2+3Na2CO3+3H2O2Al(OH)3+3Na2SO4+3CO2 （3）用三氯化鋁與氫氧化鈉合成 A1C13+3NaOHAl(OH)3+3NaCl 用鋁粉加燒堿合成法：用鋁粉加燒堿合成法： 2Al(OH)3+12H2O+3H2SO4Al2(SO4)318H2O A12(SO4)318H2O+6NaOH2Al(OH)3+2Na2SO4+18H2O用銅紗篩濾過，用布袋脫水過夜

21、，收用銅紗篩濾過，用布袋脫水過夜，收存于容器內，可約得存于容器內，可約得600kg600kg鋁膠。鋁膠。取氫氧化鋁干粉取氫氧化鋁干粉505055kg55kg，加入加入6 6萬毫升沸水中，攪拌均萬毫升沸水中，攪拌均勻勻; ;倒入硫酸倒入硫酸100kg100kg，爆沸至，爆沸至棕褐色，經棕褐色，經303060min60min后，加后，加溫水，邊加邊攪拌約至總量溫水，邊加邊攪拌約至總量為為3535萬毫升；用前加水稀釋萬毫升；用前加水稀釋至至100100萬毫升，溫度約為萬毫升，溫度約為8080，盛裝在一個缸內盛裝在一個缸內另一缸盛另一缸盛80kg80kg燒堿，加水至燒堿，加水至100100萬毫升，加溫

22、至萬毫升，加溫至7575兩液等量逐漸流入另一耐酸搪瓷缸兩液等量逐漸流入另一耐酸搪瓷缸內，蒸汽吹沸熟化內，蒸汽吹沸熟化10min，調節，調節pH 6.9土土0.1，繼續熟化，繼續熟化3min，穩定，穩定pH 6.9土土0.1靜置沉淀，棄上清后加入約靜置沉淀，棄上清后加入約5 5倍量軟倍量軟化水，攪拌洗滌、棄上清，如此化水，攪拌洗滌、棄上清，如此3 35 5次，檢查至硫酸鹽合格為止。次，檢查至硫酸鹽合格為止。第三節第三節 免疫佐劑免疫佐劑注意事項注意事項p氫氧化鋁吸附力較強，所以要用軟化水或去離子水氫氧化鋁吸附力較強，所以要用軟化水或去離子水洗滌。洗滌。p氫氧化鋁膠為兩性化合物，過酸或過堿都會失去

23、膠氫氧化鋁膠為兩性化合物，過酸或過堿都會失去膠態。故要態。故要 掌握好化合時的掌握好化合時的pHpH值。值。p貯存鋁膠應放在耐酸搪瓷缸或耐酸池中，嚴密封蓋，貯存鋁膠應放在耐酸搪瓷缸或耐酸池中，嚴密封蓋，貯放期不超過貯放期不超過3 3個月。個月。p鋁膠室溫保存，以免破壞膠態。鋁膠室溫保存，以免破壞膠態。 第三節第三節 免疫佐劑免疫佐劑2.2.油水乳劑佐劑油水乳劑佐劑u一種好的乳劑疫苗應是油包水（W/O）或水包油（O/W）型，粘度低，顆粒均勻，穩定性良好，呈乳白色。u“乳劑”是將一種溶液或干粉分散成細小的微粒,混懸于另一不相溶的液體中所成的分散體系.被分散的物質稱為分散相(內相),承受分散相的液體

24、稱連續相（外相），兩相間的界面活性物質稱為乳化劑。第三節第三節 免疫佐劑免疫佐劑u是指一類由油類物質和乳化劑按一定比例混合形成的佐劑。 u該類佐劑主要在抗原尋的過程中起作用，使抗原在注射部位保持穩定，為抗原在淋巴系統中轉運提供載體，增加單核細胞的形成和積聚。u油乳劑疫苗的免疫效力高低，直接與乳化作用的好壞和乳劑成分的質量等有關。p 天然乳化劑天然乳化劑：阿拉伯膠、海藻酸鈉、蛋黃以：阿拉伯膠、海藻酸鈉、蛋黃以及煉乳及煉乳乳化劑乳化劑第三節第三節 免疫佐劑免疫佐劑p 人工合成乳化劑人工合成乳化劑離子型離子型: : 陰離子類乳化劑：十二烷基磺酸鈉和硬脂酸鋁陰離子類乳化劑：十二烷基磺酸鈉和硬脂酸鋁 陽

25、離子類乳化劑：氯化苯甲烴銨、溴化十六烷三甲基陽離子類乳化劑：氯化苯甲烴銨、溴化十六烷三甲基非離子型：非離子型： 月桂酸聚甘油脂、山梨醇脂和單油酸脂、司本月桂酸聚甘油脂、山梨醇脂和單油酸脂、司本-80-80、吐、吐溫溫-80-80 國內外常用白油：國內外常用白油：Drakocel-6VRDrakocel-6VR、Marcol-Marcol-5252和和Lipolul-47Lipolul-47號或號或1010號白油號白油白油白油佐劑佐劑質量標準質量標準:n 無色無味，無色無味，5050運動粘度運動粘度7m27m2s s左右。左右。n 紫外吸收紫外吸收A250-350A250-3500.10.1，紫

26、外消光系數，紫外消光系數1212108108；n 單環芳烴與雙環芳烴含量低于單環芳烴與雙環芳烴含量低于0.50.5, ,無多環芳烴；無多環芳烴；n 小鼠腹腔注射小鼠腹腔注射0.5ml0.5ml或家免皮下注射或家免皮下注射2.0ml2.0ml白油，觀白油，觀察察60d60d，表現正常。，表現正常。第三節第三節 免疫佐劑免疫佐劑（1 1）劑在水中法：）劑在水中法：乳劑配方與乳化方法乳劑配方與乳化方法第三節第三節 免疫佐劑免疫佐劑 將乳化劑直接溶于水中，在激烈攪拌下將油加將乳化劑直接溶于水中，在激烈攪拌下將油加入，可直接生成入，可直接生成O/WO/W乳劑。若欲得乳劑。若欲得W/OW/O型，可繼續加型

27、，可繼續加入油，直到發生變型。該法通常用勻漿器或膠體磨，入油，直到發生變型。該法通常用勻漿器或膠體磨，高速攪拌而得到較好的乳劑。高速攪拌而得到較好的乳劑。（2 2）劑在油中法：）劑在油中法： 將乳化劑溶于油相，將油相直接加入水相中得將乳化劑溶于油相，將油相直接加入水相中得O/WO/W，如水相直接加入油相，得到，如水相直接加入油相，得到W/OW/O型，如欲得型，如欲得O/WO/W，繼續加入至變型。該法制成的乳劑，一般均勻顆粒繼續加入至變型。該法制成的乳劑，一般均勻顆粒直徑在直徑在0.50.5m m左右，比較穩定。左右，比較穩定。免疫實驗動物用的佐劑配制免疫實驗動物用的佐劑配制(1)(1)弗氏佐劑

28、：弗氏佐劑：第三節第三節 免疫佐劑免疫佐劑 礦物油礦物油75%-8575%-85，乳化劑，乳化劑1515-25%-25%，混合，混合后經除菌過濾而成為后經除菌過濾而成為FIAFIA；如向其中加入；如向其中加入0.5mg0.5mgm1m1死結核桿菌即為死結核桿菌即為FCAFCA。使用時，將含抗原的。使用時，將含抗原的水相，與上述任一佐劑等量混合，用力振搖即水相，與上述任一佐劑等量混合，用力振搖即可成為均勻的乳劑。可成為均勻的乳劑。 9 9份油和份油和1 1份司本份司本-80-80混合后加混合后加2 2吐溫吐溫-80-80和和1 12%2%硬脂酸鋁，經高壓滅菌后備用，注射前硬脂酸鋁，經高壓滅菌后備

29、用，注射前將配好的油佐劑與抗原水相將配好的油佐劑與抗原水相1 1：1 1混合，強力振混合，強力振搖，可配制成性狀良好的乳劑疫苗搖，可配制成性狀良好的乳劑疫苗. . (2) (2) 白油佐劑：白油佐劑：大量生產乳劑疫苗大量生產乳劑疫苗油相油相: : 94%94%白油白油.6%.6%司本司本-80.1%-2%-80.1%-2%硬脂酸鋁硬脂酸鋁, ,滅菌；滅菌；水相：水相：抗原液加抗原液加2 2-4%-4%吐溫吐溫-80-80乳化：乳化：將油相與水相按將油相與水相按3:1-2:13:1-2:1比例配制，先緩速比例配制，先緩速混合，再通過膠體磨充分乳化，可獲得穩定的油包混合，再通過膠體磨充分乳化，可獲

30、得穩定的油包水乳劑苗。或者將粘稠的水乳劑苗。或者將粘稠的W/OW/O乳劑疫苗，再加乳劑疫苗，再加2 2吐吐溫溫-80-80生理鹽水，通過攪拌或膠體磨乳化，可制成雙生理鹽水，通過攪拌或膠體磨乳化，可制成雙相乳劑疫苗。相乳劑疫苗。第三節第三節 免疫佐劑免疫佐劑油乳劑檢驗油乳劑檢驗（1 1）粘度測定）粘度測定: :流出法、流出法、SayboltSaybolt粘度計法粘度計法第三節第三節 免疫佐劑免疫佐劑 吸管內口直徑為吸管內口直徑為1.2mm1.2mm，室溫下吸滿，室溫下吸滿lmllml乳劑，乳劑，垂直放出垂直放出0.4ml0.4ml所需時間作為粘度單位。所需時間作為粘度單位。（2 2）乳劑穩定性測

31、定：）乳劑穩定性測定： 加速老化法：疫苗于加速老化法：疫苗于3737貯存貯存10-30d10-30d不破乳。不破乳。 離心加速分層法：離心加速分層法：3000rpm3000rpm離心離心15min15min不分層，不分層，相當于保存相當于保存1 1年以上不破乳。年以上不破乳。胰消化酶的作用胰消化酶的作用3.3.免疫刺激復合物免疫刺激復合物1) ISCOM1) ISCOM由抗原物質與由皂樹皮提取的一種糖苷由抗原物質與由皂樹皮提取的一種糖苷Quil AQuil A和膽固醇按和膽固醇按1:1:11:1:1混合后自發形成的一種混合后自發形成的一種具有較高免疫活性的脂質小泡。具有較高免疫活性的脂質小泡。

32、2) ISCOM2) ISCOM直徑直徑40nm40nm，每個，每個ISCOMISCOM約含約含10101212分子分子的蛋白質。的蛋白質。3) ISCOM3) ISCOM應用于多種細菌、病毒和寄生蟲病的疫應用于多種細菌、病毒和寄生蟲病的疫苗，具有產生苗，具有產生“全面全面”免疫應答的效力，可長期免疫應答的效力，可長期增強特異性抗體應答。增強特異性抗體應答。4) ISCOM4) ISCOM能有效地通過粘膜給藥，從而可以用于能有效地通過粘膜給藥，從而可以用于抗呼吸道感染。抗呼吸道感染。5) 5) 目前，獸用目前，獸用ISCOMISCOM疫苗已在國外投放市場。疫苗已在國外投放市場。 供免疫佐劑用的

33、蜂膠外觀應供免疫佐劑用的蜂膠外觀應具備其固有的特征具備其固有的特征是一種優良的天然藥物是一種優良的天然藥物具有廣泛的生物活性和藥理作用具有廣泛的生物活性和藥理作用( (抗菌、抗病毒、抗腫瘤、消炎抗菌、抗病毒、抗腫瘤、消炎) )4.4.蜂膠佐劑蜂膠佐劑第三節第三節 免疫佐劑免疫佐劑具有免疫增強作用具有免疫增強作用 能保持抗原特性，增強巨噬細胞的吞噬能力，促進能保持抗原特性，增強巨噬細胞的吞噬能力，促進抗體的產生，提高機體的特異性和非特異性免疫力。抗體的產生，提高機體的特異性和非特異性免疫力。 蜂膠佐劑疫苗制備方法蜂膠佐劑疫苗制備方法（1 1）蜂膠的處理：）蜂膠的處理：A.A.蜂膠（蜂膠（44以下

34、貯存）以下貯存） b.b.粉碎過篩粉碎過篩 c.c.按按1:4(W/V)1:4(W/V)加加9595乙醇乙醇, ,室溫浸泡室溫浸泡242448h 48h d.d.冷卻冷卻, ,過濾或離心取上清過濾或離心取上清 e.e.透明栗色純凈蜂膠浸液透明栗色純凈蜂膠浸液,4,4以下保存備用以下保存備用 f.f.除去干渣計算出浸液中含蜂膠量。除去干渣計算出浸液中含蜂膠量。 滅活菌液或病毒液，加入蜂膠乙醇浸液，使每毫升菌液中含蜂膠10mg，邊加邊搖蕩，成為乳濁狀，即可。 （2 2）蜂膠佐劑疫苗的制備：）蜂膠佐劑疫苗的制備：第三節第三節 免疫佐劑免疫佐劑第三節第三節 免疫佐劑免疫佐劑（二）非顆粒性佐劑（二）非顆

35、粒性佐劑1 1肽類佐劑（肽類佐劑（peptidespeptides）：胞壁酰二肽（）：胞壁酰二肽（MDPMDP）及其衍生物、）及其衍生物、 去胞壁酰多肽、脂肽和免疫調節多肽。去胞壁酰多肽、脂肽和免疫調節多肽。2 2表面活性分子類佐劑：海藻糖合成衍生物（表面活性分子類佐劑：海藻糖合成衍生物（TDMTDM）3 3核酸及其衍生物類佐劑：合成核苷酸聚合體、核酸及其衍生物類佐劑：合成核苷酸聚合體、CpG CpG 4 4含硫復合物類佐劑：左旋咪唑含硫復合物類佐劑：左旋咪唑5 5碳水化合物高分子類佐劑：香菇多糖、碳水化合物高分子類佐劑：香菇多糖、DEAE-DEAE-葡聚糖葡聚糖6 6細胞因子類佐劑（細胞因子

36、類佐劑（cytokinecytokine）：）：IL-2IL-2、IL-4IL-4和和-IFN-IFN等。等。7 7脂質分子類佐劑脂質分子類佐劑: :脂多糖、脂多糖、Vit AVit A和和Vit EVit E等脂溶性維生素等脂溶性維生素8 8其他：霍亂毒素（其他：霍亂毒素（CTCT）、百日咳毒素（）、百日咳毒素（PTPT）和破傷風類）和破傷風類 毒素（毒素（TTTT）等；脂磷壁酸（）等；脂磷壁酸（LTALTA）；維生素）；維生素B12B12等。等。細胞因子類免疫佐劑細胞因子類免疫佐劑p細胞因子的細胞因子的概念概念 是機體的各種細胞在其生命周期中所釋放的具是機體的各種細胞在其生命周期中所釋放的

37、具有不同生物學效應的物質，是免疫細胞間相互作用有不同生物學效應的物質，是免疫細胞間相互作用的調節信號。該類物質相互誘生，相互影響，構成的調節信號。該類物質相互誘生，相互影響，構成一個巨大的細胞因子網絡（一個巨大的細胞因子網絡（cytokine networkcytokine network）系）系統，各種細胞借助自己所釋放的細胞因子完成各自統，各種細胞借助自己所釋放的細胞因子完成各自的功能，在免疫應答中發揮作用。的功能，在免疫應答中發揮作用。第三節第三節 免疫佐劑免疫佐劑1細胞因子類免疫佐劑細胞因子類免疫佐劑p細胞因子的細胞因子的分類分類1)1)經典的細胞因子：淋巴毒素（經典的細胞因子：淋巴毒

38、素（LTLT） 腫瘤壞死因子（腫瘤壞死因子（TNFTNF） 干擾素（干擾素（INFINF）2)2)對體液免疫和細胞免疫具有調節作用的因子：對體液免疫和細胞免疫具有調節作用的因子： 白細胞介素（白細胞介素（ILIL） 集落刺激因子（集落刺激因子（CSFCSF）第三節第三節 免疫佐劑免疫佐劑1第三節第三節 免疫佐劑免疫佐劑第三節第三節 免疫佐劑免疫佐劑細胞因子類免疫佐劑細胞因子類免疫佐劑p細胞因子細胞因子作用特點作用特點1)1)多效性：多效性： 免疫調節作用的多樣性免疫調節作用的多樣性 作用方式的非特異性：不表現抗原特異性作用方式的非特異性：不表現抗原特異性2)2)靶細胞的多樣性：構成機體細胞靶細

39、胞的多樣性：構成機體細胞細胞調節網絡細胞調節網絡3)3)多源性：多源性：4)4)高效性：有免疫激素（高效性：有免疫激素（immune hormoneimmune hormone）之稱）之稱5)5)快速反應性：即對激發因素的迅速反應快速反應性：即對激發因素的迅速反應第三節第三節 免疫佐劑免疫佐劑1細胞因子類免疫佐劑細胞因子類免疫佐劑p細胞因子細胞因子應用應用 1) 1)作為免疫佐劑，提高疫苗的免疫效果。作為免疫佐劑，提高疫苗的免疫效果。 2) 2)作為免疫治療劑，預防和治療某些病原感染。作為免疫治療劑，預防和治療某些病原感染。 3) 3)通過基因重組，構建新型基因工程疫苗通過基因重組，構建新型基

40、因工程疫苗IL-2- IL-2- AIV-HAAIV-HA重組痘病毒。重組痘病毒。第三節第三節 免疫佐劑免疫佐劑1細胞因子類免疫佐劑細胞因子類免疫佐劑p幾種重要幾種重要的細胞因子的細胞因子 1)1)白細胞介素白細胞介素-2-2（IL-2IL-2） 2)2)白細胞介素白細胞介素-4-4（IL-4IL-4） 3)3)白細胞介素白細胞介素-12-12（IL-12IL-12） 4) - 4) -干擾素（干擾素（IFN-IFN-）第三節第三節 免疫佐劑免疫佐劑1鹽酸、脂肪、高滲溶液鹽酸、脂肪、高滲溶液白細胞介素白細胞介素-2(-2(IL-2)刺激物為抗原或促有絲分裂原刺激物為抗原或促有絲分裂原(ConA

41、);T(ConA);T細胞分泌；細胞分泌； 無抗原特異性糖蛋白無抗原特異性糖蛋白. .含含133aa,133aa,分子量分子量15-35kDa; 15-35kDa; 7030min7030min及及pHpH值值2-92-9范圍內穩定范圍內穩定. .第三節第三節 免疫佐劑免疫佐劑鹽酸、脂肪、高滲溶液鹽酸、脂肪、高滲溶液白細胞介素白細胞介素-4(IL-4(IL-4) 刺激物刺激物: :抗原或絲裂原抗原或絲裂原; ;由由ThTh細胞產生分子量細胞產生分子量151520kDa.20kDa.有有2 23 3個糖基化部位個糖基化部位.140.140個氨基酸個氨基酸一種強有力的佐劑候選因子一種強有力的佐劑候

42、選因子. .第三節第三節 免疫佐劑免疫佐劑鹽酸、脂肪、高滲溶液鹽酸、脂肪、高滲溶液白細胞介素白細胞介素-12(IL-12(IL-12) 是目前發現的唯一主要由是目前發現的唯一主要由B B細胞產生細胞產生的細胞因子，與的細胞因子，與IL-2IL-2有協同作用，所以曾有協同作用，所以曾被稱為細胞毒淋巴細胞成熟因子（被稱為細胞毒淋巴細胞成熟因子（CLMFCLMF）和天然殺傷細胞刺激因子（和天然殺傷細胞刺激因子（NKSFNKSF）。第三節第三節 免疫佐劑免疫佐劑 糖蛋白，分子量糖蛋白，分子量75kDa75kDa，由，由40kDa40kDa（P40P40）和）和35kDa35kDa（P35P35）兩個亞

43、單位構成，）兩個亞單位構成，兩個亞單位完全由不同的基因所編碼，只兩個亞單位完全由不同的基因所編碼，只有結合為一個完整的分子時才能發揮生物有結合為一個完整的分子時才能發揮生物學活性。學活性。 IL-12IL-12活性高于活性高于IL-2IL-2和和IFNIFN，在極低，在極低濃度時就有顯著活性，對滅活疫苗、腫濃度時就有顯著活性，對滅活疫苗、腫瘤和寄生蟲抗原具有有效的佐劑活性。瘤和寄生蟲抗原具有有效的佐劑活性。 IL-12IL-12誘導產生的誘導產生的Th1Th1應答反應尤為應答反應尤為引人注目，可望用于主要誘導細胞免疫引人注目，可望用于主要誘導細胞免疫應答的疫苗佐劑。應答的疫苗佐劑。 第三節第三

44、節 免疫佐劑免疫佐劑由致敏由致敏T T細胞在活的或滅活的病毒等干擾素誘細胞在活的或滅活的病毒等干擾素誘生劑和某些細胞因子作用下所產生；生劑和某些細胞因子作用下所產生；-干擾素干擾素（IFN-IFN-）第三節第三節 免疫佐劑免疫佐劑糖蛋白，分子量糖蛋白，分子量202025kDa,25kDa,由由144144個氨基酸組成。個氨基酸組成。有抗病毒、抗腫瘤、免疫調節和免疫佐劑等免疫有抗病毒、抗腫瘤、免疫調節和免疫佐劑等免疫生物學活性。生物學活性。有抗病毒、抗腫瘤、免疫調節和免疫佐劑等免疫有抗病毒、抗腫瘤、免疫調節和免疫佐劑等免疫生物學活性。生物學活性。第三節第三節 免疫佐劑免疫佐劑-干擾素干擾素（IFN-IFN-） 目前，我國已開發研制成功豬白細目前，我國已開發研制成功豬白細胞干擾素（胞干擾素（swine interferonswine interferon）。該制）。該制品系用雞新城疫病毒誘導健康豬白細胞，品系用雞新城疫病毒誘導健康豬白細胞，經培養、滅活病毒、除菌、分裝等工藝經培養、滅活病毒、除菌、分裝等工藝制成。用于防治豬流行性腹瀉。制