1、第七章 環境內分泌干擾物毒理學主講教師：劉主講教師：劉 薇薇大連理工大學大連理工大學 環境學院環境學院生態毒理學生態毒理學 (Ecotoxicology)(Ecotoxicology)內容內容2一、環境內分泌干擾物的分類一、環境內分泌干擾物的分類二、環境內分泌干擾物的危害二、環境內分泌干擾物的危害三、環境內分泌干擾物的作用機制三、環境內分泌干擾物的作用機制四、環境內分泌干擾物的篩檢方法四、環境內分泌干擾物的篩檢方法一、環境內分泌干擾物的分類一、環境內分泌干擾物的分類（一）內分泌干擾物名稱由來1997年年掠奪未來掠奪未來, 提出了內分泌干擾提出了內分泌干擾(endocrine disruptin

2、g，ED)物質的概念。物質的概念。31996年年 “Our Stolen Future”提出。提出。環境中存在著一類化學物質，當進入動物體內之后環境中存在著一類化學物質，當進入動物體內之后能起到干擾體內正常激素分泌的作用，從而影響生能起到干擾體內正常激素分泌的作用，從而影響生殖功能，導致惡性腫瘤的產生，這類化學物質即所殖功能，導致惡性腫瘤的產生，這類化學物質即所謂的謂的“外源性內分泌干擾物質外源性內分泌干擾物質” 內分泌干擾物質是指可通過干擾生物或人為保持自身平衡和調節發育過程而在體內產生的天然激素的合成、分泌、運輸、結合、反應和代謝等，從而對生物或人體的生殖、神經和免疫系統等的功能產生影響的

3、外源性化學物質。 美國 EPA的定義 內分泌調節物：引起完好無損生物體或其后代中內分泌功能變化不利影響的外源物質，它們主要是通過人類的生產和生活排放到環境中的污染物，又可以稱之為環境激素。 歐盟定義（二）內分泌干擾物的定義（二）內分泌干擾物的定義4(三三)環境內分泌干擾物的分類環境內分泌干擾物的分類5EDCs天然天然化學物化學物人工合成人工合成化學物化學物天然雌激素天然雌激素植物雌激素植物雌激素真菌雌激素真菌雌激素人工合成的雌激素人工合成的雌激素環境化學污染物環境化學污染物雌二醇、雌酮、雌三醇大豆異黃酮香豆雌酚玉米赤霉烯酮己烯雌酚、己烷雌酚炔雌醇、炔雌醚等二噁英、多氯聯苯雙酚A、鄰苯二甲酸酯類

4、等6按照按照EDCs的干擾功能分類的干擾功能分類EDCs雌激素干擾物雌激素干擾物雄激素干擾物雄激素干擾物甲狀腺干擾物甲狀腺干擾物胰島素干擾物胰島素干擾物糖皮質激素干擾物糖皮質激素干擾物腎上腺皮質激素干擾物腎上腺皮質激素干擾物 按照對按照對EDCsEDCs的認識程度分類的認識程度分類二、環境內分泌干擾物的危害二、環境內分泌干擾物的危害危害危害致癌致畸致癌致畸生殖異常生殖異常 動物雌性化現象動物雌性化現象神經毒性神經毒性其他其他如阻止植物固氮如阻止植物固氮免疫毒性免疫毒性1.1.男嬰出生率下降男嬰出生率下降 自20世紀70年代以來，加拿大男嬰的出生率下降了0.22%，美國下降了0.1%。2.2.男

5、性精子異常且不育患者增加，男子女性化程度加劇男性精子異常且不育患者增加，男子女性化程度加劇 從1940年到1990年這50年間，人類的精子密度下降了50%3.3.誘發女性生殖系統問題誘發女性生殖系統問題 性早熟、月經失調、子宮內膜炎癥、不孕癥、卵巢癌、乳性早熟、月經失調、子宮內膜炎癥、不孕癥、卵巢癌、乳腺癌等增加腺癌等增加 現在全球每年約有50萬名婦女死于乳腺癌，且發病率以每年520的速度上升；20世紀60年代，美國女性一生中乳腺癌的發生幾率僅為1/20，而20世紀90年代上升為1/8( (一一) )對人體健康的影響對人體健康的影響4. 對發育的影響對發育的影響 胎兒和嬰兒胎兒和嬰兒出現先天性

6、畸形、發育不全和癡呆的出現先天性畸形、發育不全和癡呆的病例增加。病例增加。5. 引起人的引起人的神經系統神經系統功能障礙、智力低下。功能障礙、智力低下。6. 可損害人體可損害人體免疫系統免疫系統，降低免疫力。，降低免疫力。7. 誘發誘發腫瘤發生腫瘤發生( (一一) )對人體健康的影響對人體健康的影響日本米糠油事件中日本米糠油事件中PCBs（多氯聯苯）受害者的慘狀（多氯聯苯）受害者的慘狀（二）對野生生物的危害（二）對野生生物的危害上世紀上世紀50年代：年代：英國水獺英國水獺種群數量下降；種群數量下降；1952年：年：佛羅里達鷹佛羅里達鷹的數量下降；的數量下降； 上世紀上世紀60年代：年代：蜜歇根

7、湖貂類蜜歇根湖貂類喪失生殖能力喪失生殖能力，出生率下降；，出生率下降； 1970年：安大略湖年：安大略湖80%鷗鳥鷗鳥死亡；死亡； 1980年：佛羅里達鱷魚發育異常；年：佛羅里達鱷魚發育異常；1988年：年：北歐大批海豹北歐大批海豹死亡；死亡；上世紀上世紀90年代早期：年代早期：地中海大批海豚地中海大批海豚死亡死亡19981998年發現多只年發現多只北極熊北極熊生殖器官變異；生殖器官變異；19941994年年4 4月，日本月，日本7 7條河流中的條河流中的雄鯉魚雄鯉魚有有1/41/4雌性化；雌性化；Missing back left legExtra back right legTail no

8、t absorbed 19961996年夏天在明尼蘇達州發現的畸形青蛙年夏天在明尼蘇達州發現的畸形青蛙（二）對野生生物的危害（二）對野生生物的危害三、環境內分泌干擾物的作用機制三、環境內分泌干擾物的作用機制 EDCs能干擾體內內源激素的合成、分泌、運輸、結合、代謝，影響內分泌系統的正常生理功能，而內分泌系統紊亂又使免疫系統和中樞神經系統受到傷害。（一）影響機體正常內分泌功能的機制（一）影響機體正常內分泌功能的機制 1.與受體直接結合 （1）與雄激素受體結合，表現出抗雄激素效應 烯菌酮、殺蟲劑N-（3、5-二氯苯基）-1、2-二甲基環丙烷-1、2-二甲酰亞胺和p、p-DDE2,2-雙-(對氯苯基

9、)-1,1-二氯乙烯 1.與受體直接結合 （2）雌激素受體（ER）介導的反應這些化學品的效應與這些化學品的效應與-雌二醇（雌二醇（E2E2）等內源雌激素相似，）等內源雌激素相似，包括包括DDTDDT、烷基苯酚、雙酚、烷基苯酚、雙酚A A等等（一）影響機體正常內分泌功能的機制（一）影響機體正常內分泌功能的機制2：與生物體內激素競爭靶細胞上的受體 通過競爭的結果，環境激素與靶細胞上的受體結合，減少受體對天然激素的吸附或阻礙天然激素與受體結合，從而減少了天然激素的作用。天然激素與受體的結合受環境激素的阻礙，進而影響激素信號在細胞、器官、組織的傳遞，導致機體功能失調。（一）影響機體正常內分泌功能的機制

10、（一）影響機體正常內分泌功能的機制3：有些內分泌干擾物可產生類似雌激素的效應，卻與雌激素受體的信號傳遞途徑無關。 芳烴受體（AhR）即為性激素受體外的一種信號傳遞途徑，它可以與許多環境污染物如二惡英和呋喃結合，產生抗雌激素活性，包括增加雌激素代謝（降低內源雌激素水平）、降低雌激素受體ER的結合活性以及降低ER介導的基因表達等。（一）影響機體正常內分泌功能的機制（一）影響機體正常內分泌功能的機制 EDCs影響大腦皮層、下丘腦、腦垂體等對激素的調節作用，導致激素合成、釋放、運輸異常。 如有機磷農藥能與體內膽堿酯酶結合，形成穩定的磷酸化膽堿酯酶，使膽堿酯酶失去活性，喪失分解乙酰膽堿的能力，造成體內膽

11、堿的蓄積，從而引起神經傳導功能紊亂，出現一系列中毒癥狀。（二）影響神經遞質的傳導，毒害神經系統（二）影響神經遞質的傳導，毒害神經系統 金屬鉛和許多農藥都對睪丸有較強的毒性作用； 在雌性生殖系統中，環境激素可以影響卵泡的發育和成熟、性激素的合成與釋放。 有機氯農藥能使鳥類產蛋數目減少，蛋殼變薄和胚胎不易發育。(三三)作用于生物體的生殖腺，影響性激素分泌作用于生物體的生殖腺，影響性激素分泌 環境毒物通過影響肝腎代謝功能，改變體內的激素水平。 有機磷、有機氯農藥可以誘導肝臟甾醇羥化酶、微粒體酶，從而加速內源性激素的代謝和排泄。 艾氏劑和狄氏劑可使大鼠的谷丙轉氨酶和醛縮酶的活性升高 DDT對ATP酶有

12、抑制作用。(四四) 作用于生物體的肝臟腎臟作用于生物體的肝臟腎臟 人的免疫系統在環境激素的長期作用下，會發生免疫失調和病理反應。 Pb、Hg可使機體產生過敏性發病綜合癥； 一些殺蟲劑可引起免疫性溶血性貧血。(五五) 影響機體免疫細胞對抗原的識別影響機體免疫細胞對抗原的識別（六）致癌、致畸作用（六）致癌、致畸作用 一些環境激素可作用于染色體，使其數目或結構發生變化，改變某些基因的序列，使得組織、細胞生長失控，產生腫瘤，如發生在生殖細胞，則可造成流產、畸胎或遺傳性疾病；胎兒出生后體細胞遺傳物質的突變易引起腫瘤。DEHP處理導致的子代小鼠無尾畸形處理導致的子代小鼠無尾畸形右邊個體為對照組右邊個體為對

13、照組箭頭所示的紅點處為箭頭所示的紅點處為本應長尾的位置本應長尾的位置25Perinatal Exposure to the Phthalates DEHP, BBP, and DINP, but Not DEP, DMP, or DOTP, Alters Sexual Differentiation of the Male RatEffect of DEHP on testicular development.研究范例研究范例 L. Earl Gray Jr et al. / TOXICOLOGICAL SCIENCES 58, 350365 (2000)Testis were malform

14、ation and stunting after DINP treatmentLeft: Maternal treatment with corn oil 0.75 g/kg/dayRight: Maternal treatment with DINP 0.75 g/kg/dayCompared to control testes, this DINP-treated male right testes display atrophic tubules that lack any evidence of spermatogenesis. In addition, the lumen of bo

15、th the left and right caudae epididymidis from this male contain cellular debris and reduced numbers of sperm.controlDINP27研究范例研究范例Leon E. Gray, Jr et al. / TOXICOLOGICAL SCIENCES 123(1), 206216 (2011)Dose-Response Assessment of Fetal Testosterone Production and GeneExpression Levels in Rat Testes F

16、ollowing In Utero Exposure to DEHP, DIBP, DIHP,DINP28With the drug concentration increased, testosterone levels gradually decline.研究范例研究范例Leon E. Gray, Jr et al. / TOXICOLOGICAL SCIENCES 123(1), 206216 (2011)研究范例研究范例Leon E. Gray, Jr et al. / TOXICOLOGICAL SCIENCES 123(1), 206216 (2011)Insl3:胰島素樣因子胰島

17、素樣因子3StAR:類固醇激素合成急性調節蛋白類固醇激素合成急性調節蛋白Cyp11A:細胞色素細胞色素P450亞家族成員亞家族成員四、環境內分泌干擾物篩檢方法四、環境內分泌干擾物篩檢方法（一）體內實驗 1.動物喂養實驗 2.嚙齒動物切除卵巢后子宮肥大實驗或動情期 實驗（二）體外實驗 1.雌激素受體競爭性抑制法 2.標志基因鑒定30 1.動物喂養實驗（一）體內實驗（一）體內實驗31EDCs妊娠鼠妊娠鼠皮下注射皮下注射雄性子代雄性子代后代不育情況后代不育情況成年后睪丸發育情況成年后睪丸發育情況生殖腺損害情況生殖腺損害情況通過測定EDCs對動物是否具有促進子宮生長的作用來評價其雌激素活性。該種實驗直

18、接作用于雌激素效應器，可以直接顯示化學物的類雌激素功能。2.2.嚙齒類動物切除卵巢后子宮肥大實驗或動情嚙齒類動物切除卵巢后子宮肥大實驗或動情期實驗期實驗32動物實驗的優缺點：動物實驗的優缺點：優點：優點：1.最具真實性最具真實性 2.最具說服力最具說服力缺點：缺點：1.實驗過程繁瑣實驗過程繁瑣 2.實驗結果受動物年齡、性別、品系、個實驗結果受動物年齡、性別、品系、個 體差別及取樣誤差等影響體差別及取樣誤差等影響 3.對環境低濃度暴露不易獲得正確結果對環境低濃度暴露不易獲得正確結果（一）體內實驗（一）體內實驗1.1.雌激素受體競爭性抑制法雌激素受體競爭性抑制法基于基于ELISA的受體競爭結合法檢

19、測環境雌激素的受體競爭結合法檢測環境雌激素方法：采用免疫測定介導受體競爭結合試驗定量檢測環境雌激素將17-雌二醇-BSA固定在微孔板上，環境雌激素與微孔板上的17-雌二醇-BSA競爭性的與雌激素受體結合，與微孔板上17-雌二醇-BSA結合的受體與雌激素受體的抗體、雌激素受體抗體的二抗形成一個三明治形式的復合物，通過顯色劑顯色，最后用比色法對試驗結果進行定量。結果：整個反應中環境雌激素濃度越高，溶液的吸光度值的變化就越小，環境雌激素的濃度與吸光度值成負相關。（二）體外實驗（二）體外實驗34（1）酵菌轉基因獲得的性激素受體表達實驗）酵菌轉基因獲得的性激素受體表達實驗 主要檢測雌激素受體結合依賴性轉

20、錄和轉錄活性。 此法是用具有完整的人雌激素受體DNA的表達質粒和帶有-半乳糖苷酶結構基因上游的雌激素反應元件的標志質粒轉化酵母菌釀酒酵母菌形成激素依賴性轉錄活化因子，然后加入雌激素或待測的物質培養當雌性物質結合到受體上激活相應的激素反應元件合成-半乳糖苷酶，利用酶-底物法檢測其活性。 2.2.標志基因鑒定標志基因鑒定人雌激素受體人雌激素受體DNA-半乳糖苷酶結構基因上游雌激素反應元件半乳糖苷酶結構基因上游雌激素反應元件待測物質待測物質有顏色顯示有顏色顯示無顏色顯示無顏色顯示 (2) 質粒載體轉染法 構建含有由雌激素、雄激素或視黃酸應答的DNA加強元件的激素誘導控制下的瑩蟲酶基因的標志質粒載體，

21、然后將這些載體短暫轉染入含有相應受體的人類卵巢瘤BG-1細胞系中，顯示它們同各自激素反應誘導瑩蟲酶的能力 。2.2.標志基因鑒定標志基因鑒定3.細胞增殖實驗細胞增殖實驗 人乳癌細胞（MCF-7）增殖實驗實驗原理實驗原理MCF- 7：激素依賴性細胞系，加入雌激素后誘導細胞增殖。實驗結果判斷實驗結果判斷比較在加入10%血清后的培養液中，加或不加 E2 或類雌激素物質培養后的細胞數量。研究實例Harris 等利用此細胞系研究二噁英（TCDD）及其結構類似物對雌激素受體的影響，認為TCDD及TCDD類似物通過誘導CYP1A1基因表達而產生抗雌激素作用。 39實驗原理實驗原理卵黃黃素：卵生脊椎動物幼年期

22、由肝臟合成的 雌激素依賴性蛋白前體，成年雌性體內含量極微或不能檢出，但在 雌激素或類雌激素物質作用下可過度表達。實驗結果判斷實驗結果判斷檢測VTG或其mRNA含 量即可判斷該化合物有無雌激素活性或其作用強度。應用價值應用價值 作為魚、 蟾蜍、爬行動物等卵生動物的雌性激素的一種生物標志，其誘導實 驗檢測環境雌激素干擾物質暴露。4.卵黃黃素誘導實驗卵黃黃素誘導實驗 這種鑒定利用原代肝細胞受試，原代培養的細胞剛剛離體，其生物學特征未發生很大變化，保留了細胞的代謝活性，可最接近和反映體內生長特性。 這種鑒定的終點是雌激素反應蛋白或蛋白mRNA，與雌激素受體結合實驗相比，結果更具可信性。4.卵黃黃素誘導

23、實驗卵黃黃素誘導實驗五五. 我國我國EDCs防治現狀防治現狀問題及對策問題及對策我國我國EDCs污染研究控制中的問題污染研究控制中的問題 基礎研究較薄弱，識別和鑒定存在一定困難，基礎研究較薄弱，識別和鑒定存在一定困難，名錄的確定存在很大爭議；名錄的確定存在很大爭議； 很多很多EDCs的具體作用機制仍不明朗，各種環的具體作用機制仍不明朗，各種環境激素的致毒濃度等參數仍需進一步研究；境激素的致毒濃度等參數仍需進一步研究； 國內的國內的EDCs研究正處于起步階段，所得數據研究正處于起步階段，所得數據有限；有限；v EDCs的來源十分廣泛，垃圾焚燒、汽車尾氣、的來源十分廣泛，垃圾焚燒、汽車尾氣、烹飪油煙、烹飪油煙、 化工生產過程等均可產生化工生產過程等均可產生EDCs；v農藥、化肥的大量使用，有機廢水的排放農藥、化肥的大量使用，有機廢水的排放;v自來水廠加氯消毒的副產物，工業固體廢棄物的自來水廠加氯消毒的副產物，工業固體廢棄物的隨意堆放等因素導致隨意堆放等因素導致EDCs滲入水環境；滲入水環境；v渤海每年鉛入海量渤海每年鉛入海量612.6t，鎘，鎘79.5t，汞，汞10.4t，砷，砷 530.8t，有機錫的年使用量高達，有機錫的年使用量高達7500t；五五. 我國我國EDCs防治現狀防治現狀問題及對策問題及對策