1、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)及海水魚類細(xì)胞系的建立動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)及海水魚類細(xì)胞系的建立秦啟偉，黃曉紅秦啟偉，黃曉紅有害生物控制與資源利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室有害生物控制與資源利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院2345細(xì)胞培養(yǎng)的材料準(zhǔn)備細(xì)胞培養(yǎng)的材料準(zhǔn)備1 細(xì)胞培養(yǎng)液2 胰酶消化液3 PBS緩沖洗滌液4 潔凈無菌的細(xì)胞培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)板67 培養(yǎng)前準(zhǔn)備 在開始實(shí)驗(yàn)前要制定好實(shí)驗(yàn)計(jì)劃和操作程序。有關(guān)數(shù)據(jù)的計(jì)算要事先做好。根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求，準(zhǔn)備各種所需器材和物品放置操作場所(培養(yǎng)室、超凈臺)內(nèi)消毒。這可以避免開始實(shí)驗(yàn)后，因物品不全往返拿取而增加污染機(jī)會(huì)。 培養(yǎng)室的消毒 無菌培養(yǎng)室每天都要用0.2%的新潔爾滅

2、拖洗地面次(拖布要專用)，紫外線照射消毒30-50min，超凈工作臺臺面每次實(shí)驗(yàn)前要用75酒精擦洗。然后紫外線消毒30min。些操作用具如移液器、廢液缸、污物盒、試管架等用75%酒精擦洗后置于臺內(nèi)同時(shí)紫外線消毒。 洗手和著裝 原則上和外科手術(shù)相同。并于開始操作前要用75酒精消毒手和前臂。如果實(shí)驗(yàn)過程中手觸及可能污染的物品和出入培養(yǎng)室都要重新用消毒液洗手。進(jìn)入原代培養(yǎng)室需徹底洗手還要戴口罩、著消毒衣帽。 培養(yǎng)過程中的無菌操作 在無菌環(huán)境進(jìn)行培養(yǎng)或做其它無菌工作時(shí)，首先要點(diǎn)燃酒精燈。以后一切操作，如按裝吸管帽、打開或封閉瓶口等，都需在火焰近處并經(jīng)過燒灼進(jìn)行。 進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，動(dòng)作要準(zhǔn)確敏捷，但又不必太

3、快，以防空氣流動(dòng)，增加污染機(jī)會(huì)。不能用手觸及已消毒器皿，如已接觸，要用火焰燒灼消毒或取備品更換。 89動(dòng)物細(xì)胞原代培養(yǎng)過程圖動(dòng)物細(xì)胞原代培養(yǎng)過程圖 取材 切割 消化接種培養(yǎng)10原代細(xì)胞的取材原代細(xì)胞的取材 11（3 3）取材和原代細(xì)胞制作時(shí)，要用鋒利的器械，如手術(shù)刀）取材和原代細(xì)胞制作時(shí)，要用鋒利的器械，如手術(shù)刀或剃須刀片切碎組織，盡可能減少對細(xì)胞的機(jī)械損傷。或剃須刀片切碎組織，盡可能減少對細(xì)胞的機(jī)械損傷。（4 4）要仔細(xì)去除所取材料上的血液（血塊）、脂肪、壞死）要仔細(xì)去除所取材料上的血液（血塊）、脂肪、壞死組織及結(jié)締組織，切碎組織時(shí)應(yīng)避免組織干燥，可在含少組織及結(jié)締組織，切碎組織時(shí)應(yīng)避免組織

4、干燥，可在含少量培養(yǎng)液的器皿中進(jìn)行。量培養(yǎng)液的器皿中進(jìn)行。（5 5）取材應(yīng)注意組織類型、分化程度、年齡等，一般來講，）取材應(yīng)注意組織類型、分化程度、年齡等，一般來講，胚胎組織較成熟個(gè)體組織容易培養(yǎng)，分化低的較分化高的胚胎組織較成熟個(gè)體組織容易培養(yǎng)，分化低的較分化高的組織容易生長，腫瘤組織較正常組織容易培養(yǎng)。取材時(shí)應(yīng)組織容易生長，腫瘤組織較正常組織容易培養(yǎng)。取材時(shí)應(yīng)盡量選用易培養(yǎng)的組織進(jìn)行培養(yǎng)。盡量選用易培養(yǎng)的組織進(jìn)行培養(yǎng)。（6 6）原代細(xì)胞取材時(shí)要同時(shí)留好組織學(xué)標(biāo)本和電鏡標(biāo)本。）原代細(xì)胞取材時(shí)要同時(shí)留好組織學(xué)標(biāo)本和電鏡標(biāo)本。對組織的來源、部位、包括供體的一般情況要做詳細(xì)的記對組織的來源、部位、

5、包括供體的一般情況要做詳細(xì)的記錄，以備以后查詢。錄，以備以后查詢。12原代細(xì)胞的分離和制作原代細(xì)胞的分離和制作 人或動(dòng)物體內(nèi)（或胚胎組織）由于多種細(xì)胞結(jié)合緊密，不利于各個(gè)細(xì)人或動(dòng)物體內(nèi)（或胚胎組織）由于多種細(xì)胞結(jié)合緊密，不利于各個(gè)細(xì)胞在體外培養(yǎng)中生長繁殖，即使采用胞在體外培養(yǎng)中生長繁殖，即使采用1mm3的組織塊，也只有少量處于的組織塊，也只有少量處于周邊的細(xì)胞可能生存和生長，若需獲取大量細(xì)胞，必須將現(xiàn)有的組織塊周邊的細(xì)胞可能生存和生長，若需獲取大量細(xì)胞，必須將現(xiàn)有的組織塊充分散開，使細(xì)胞解離出來，常采用的方法如下：充分散開，使細(xì)胞解離出來，常采用的方法如下：一、懸浮細(xì)胞的分離方法組織材料若來自

6、血液、羊水、胸水或腹水的懸液材料組織材料若來自血液、羊水、胸水或腹水的懸液材料，最簡單的方，最簡單的方法是采用法是采用1000r/min的低速離心的低速離心10分鐘，分鐘，若懸液量大，可適當(dāng)延長離心若懸液量大，可適當(dāng)延長離心時(shí)間，但速度不能太高，延時(shí)也不能太長，以避免擠壓或機(jī)械損傷細(xì)胞，時(shí)間，但速度不能太高，延時(shí)也不能太長，以避免擠壓或機(jī)械損傷細(xì)胞，離心沉淀用無鈣、鎂離心沉淀用無鈣、鎂PBS洗兩次，用培養(yǎng)基洗一次后，洗兩次，用培養(yǎng)基洗一次后，調(diào)整適當(dāng)細(xì)胞濃調(diào)整適當(dāng)細(xì)胞濃度后再分瓶培養(yǎng)，若選用懸液中某些細(xì)胞，常采用離心后的細(xì)胞分層液，度后再分瓶培養(yǎng)，若選用懸液中某些細(xì)胞，常采用離心后的細(xì)胞分層液

7、，因?yàn)椋?jīng)離心后由于各種細(xì)胞的比重不同可在分層液中形成不同層，這因?yàn)椋?jīng)離心后由于各種細(xì)胞的比重不同可在分層液中形成不同層，這樣可根據(jù)需要收獲目的細(xì)胞樣可根據(jù)需要收獲目的細(xì)胞 13二、實(shí)體組織材料的分離方法 （一）機(jī)械分散法（一）機(jī)械分散法所取材料若纖維成分很少，如腦組織，部分胚胎組織可采用剪刀剪切、用吸管吹打分所取材料若纖維成分很少，如腦組織，部分胚胎組織可采用剪刀剪切、用吸管吹打分散組織細(xì)胞或?qū)⒁殉浞旨羲榉稚⒌慕M織放在注射器內(nèi)（用九號針），使細(xì)胞通過針頭散組織細(xì)胞或?qū)⒁殉浞旨羲榉稚⒌慕M織放在注射器內(nèi)（用九號針），使細(xì)胞通過針頭壓出，或在不銹鋼紗網(wǎng)內(nèi)用鈍物壓擠（常用注射器鈍端）使細(xì)胞從網(wǎng)孔中

8、壓擠出。此壓出，或在不銹鋼紗網(wǎng)內(nèi)用鈍物壓擠（常用注射器鈍端）使細(xì)胞從網(wǎng)孔中壓擠出。此法分離細(xì)胞雖然簡便、快速，但對組織機(jī)械損傷大，而且細(xì)胞分散效果差。此法僅適法分離細(xì)胞雖然簡便、快速，但對組織機(jī)械損傷大，而且細(xì)胞分散效果差。此法僅適用于處理用于處理纖維成分少的軟組織纖維成分少的軟組織。14（二）消化分離法1、酶消化分離法、酶消化分離法酶消化分離法常采用胰蛋白酶和膠原酶，其分離方法如下：酶消化分離法常采用胰蛋白酶和膠原酶，其分離方法如下：（）胰蛋白酶分散技術(shù)（）胰蛋白酶分散技術(shù) 胰蛋白酶（簡稱胰酶）是廣泛應(yīng)用的消化劑。胰蛋白酶是一種胰臟制品，對蛋白質(zhì)有水胰蛋白酶（簡稱胰酶）是廣泛應(yīng)用的消化劑。胰

9、蛋白酶是一種胰臟制品，對蛋白質(zhì)有水介作用，主要作用于賴氨酸或精氨酸相連接的肽鍵，使細(xì)胞間質(zhì)中的蛋白質(zhì)水介而使細(xì)胞介作用，主要作用于賴氨酸或精氨酸相連接的肽鍵，使細(xì)胞間質(zhì)中的蛋白質(zhì)水介而使細(xì)胞分散開胰蛋白酶對細(xì)胞的作用，取決于細(xì)胞類型、酶的活力、配制的濃度、消化的溫度、分散開胰蛋白酶對細(xì)胞的作用，取決于細(xì)胞類型、酶的活力、配制的濃度、消化的溫度、無機(jī)鹽離子、無機(jī)鹽離子、pH以及消化時(shí)間的長短等。以及消化時(shí)間的長短等。細(xì)胞類型細(xì)胞類型 胰蛋白酶適于消化細(xì)胞間質(zhì)較少的軟組織胰蛋白酶適于消化細(xì)胞間質(zhì)較少的軟組織, ,能有效地分離肝、腎、甲狀腺、能有效地分離肝、腎、甲狀腺、羊膜、胚胎組織、上皮組織等。而

10、對含結(jié)締組織較豐富的組織羊膜、胚胎組織、上皮組織等。而對含結(jié)締組織較豐富的組織, ,如如 乳腺、滑膜、子宮、纖乳腺、滑膜、子宮、纖維肉瘤、腫瘤組織等就無效維肉瘤、腫瘤組織等就無效酶的濃度酶的濃度 胰蛋白酶一般采用的濃度為胰蛋白酶一般采用的濃度為0.1%-0.25%(活力活力1:200或或1:250)分離方法如下：分離方法如下：過夜冷消化過夜冷消化 將取得的組織用將取得的組織用Hanks液洗三次，剪成碎塊大小為液洗三次，剪成碎塊大小為4毫米左右，用毫米左右，用Hanks液洗液洗23次以除去血球和脂肪組織，再加入次以除去血球和脂肪組織，再加入0.25%的胰蛋白酶，搖勻后放的胰蛋白酶，搖勻后放4過夜

11、，次日再過夜，次日再用用Hanks液洗滌，棄去上清，共洗液洗滌，棄去上清，共洗23次，然后，加入少量營養(yǎng)液吹打分散，細(xì)胞計(jì)數(shù)，次，然后，加入少量營養(yǎng)液吹打分散，細(xì)胞計(jì)數(shù)，按適當(dāng)?shù)臐舛确制颗囵B(yǎng)。按適當(dāng)?shù)臐舛确制颗囵B(yǎng)。（）膠原酶（）膠原酶（Collagenase）消化法）消化法適于消化纖維性組織、上皮組織以及癌組織，它對細(xì)胞間質(zhì)有較好的消化作用可用適于消化纖維性組織、上皮組織以及癌組織，它對細(xì)胞間質(zhì)有較好的消化作用可用PBS和含血清的培養(yǎng)液配制，即操作簡便又可提高細(xì)胞成活率，最終濃度和含血清的培養(yǎng)液配制，即操作簡便又可提高細(xì)胞成活率，最終濃度200u/mL或或0.10.3mg/mL。152、非酶消

12、化法（、非酶消化法（EDTA消化法）消化法）常用不含鈣、鎂離子的常用不含鈣、鎂離子的PBS配成配成0.02%的工作液，對一些組織，尤其是上的工作液，對一些組織，尤其是上皮組織分散效果好皮組織分散效果好 消化分離法的操作步驟：消化分離法的操作步驟：（1）剪切）剪切 把組織塊剪碎，呈把組織塊剪碎，呈15mm3大小的組織塊。大小的組織塊。（）加液漂洗（）加液漂洗 將碎組織塊在平皿（或三角燒瓶）中用無鈣鎂將碎組織塊在平皿（或三角燒瓶）中用無鈣鎂PBS洗洗2-3次（采次（采用傾斜，自然沉降法）。用傾斜，自然沉降法）。（3）消化）消化 加入消化液（胰蛋白酶或膠原酶或加入消化液（胰蛋白酶或膠原酶或EDTA）

13、于）于37水浴中作用適當(dāng)時(shí)水浴中作用適當(dāng)時(shí)間（中間可輕搖間（中間可輕搖12次），若組織塊膨松呈絮狀可終止，若變化不大可更換一次消次），若組織塊膨松呈絮狀可終止，若變化不大可更換一次消化液，繼續(xù)消化直至膨松絮狀為止。胰蛋白酶消化時(shí)間不宜過長。化液，繼續(xù)消化直至膨松絮狀為止。胰蛋白酶消化時(shí)間不宜過長。（4）棄去消化液）棄去消化液 采用傾斜自然沉降或低速離心法盡量棄去消化液。采用傾斜自然沉降或低速離心法盡量棄去消化液。（5）漂洗）漂洗 將含有鈣、鎂離子的培養(yǎng)基沿瓶壁緩緩加入，中止消化反應(yīng)，采用將含有鈣、鎂離子的培養(yǎng)基沿瓶壁緩緩加入，中止消化反應(yīng)，采用漂洗法洗漂洗法洗2-3次后，加入完全培養(yǎng)基。次后，

14、加入完全培養(yǎng)基。（6）機(jī)械分散）機(jī)械分散 采用吸管吹打或振蕩法，使細(xì)胞充分散開后用紗網(wǎng)或采用吸管吹打或振蕩法，使細(xì)胞充分散開后用紗網(wǎng)或34層無菌層無菌紗布過濾后分瓶培養(yǎng)，若要求不高可采用傾斜自然沉降紗布過濾后分瓶培養(yǎng)，若要求不高可采用傾斜自然沉降510分鐘，吸上層細(xì)胞懸分鐘，吸上層細(xì)胞懸液進(jìn)行分瓶培養(yǎng)。液進(jìn)行分瓶培養(yǎng)。161、組織塊培養(yǎng)法、組織塊培養(yǎng)法(1)按照前述方法取材，將組織剪成或切成按照前述方法取材，將組織剪成或切成1mm3大小的小塊，并加入少大小的小塊，并加入少許培養(yǎng)基使組織濕潤。許培養(yǎng)基使組織濕潤。(2)將小塊均勻涂布于瓶壁，每小塊間距將小塊均勻涂布于瓶壁，每小塊間距0.2 cm0

15、.5cm，一般在，一般在25mL培培養(yǎng)瓶養(yǎng)瓶(底面積為底面積為17.5cm2)可接種可接種2030小塊為宜小塊為宜,小塊放置后小塊放置后,輕輕翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)輕輕翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶瓶,使瓶底朝上使瓶底朝上,然后于瓶內(nèi)加入適量培養(yǎng)基蓋好瓶塞然后于瓶內(nèi)加入適量培養(yǎng)基蓋好瓶塞,將瓶傾斜放置在將瓶傾斜放置在37溫箱內(nèi)。溫箱內(nèi)。(3)培養(yǎng)培養(yǎng)24小時(shí)，待小塊貼附后，將培養(yǎng)瓶緩慢翻轉(zhuǎn)平放，靜置培養(yǎng)，小時(shí)，待小塊貼附后，將培養(yǎng)瓶緩慢翻轉(zhuǎn)平放，靜置培養(yǎng)，動(dòng)作要輕，嚴(yán)禁搖動(dòng)和來回振蕩，以防由于沖動(dòng)而使小塊漂起而造成培養(yǎng)動(dòng)作要輕，嚴(yán)禁搖動(dòng)和來回振蕩，以防由于沖動(dòng)而使小塊漂起而造成培養(yǎng)失敗，若組織塊不易貼壁可預(yù)先在瓶壁涂一薄層血清

16、、胎汁或鼠尾膠原等。失敗，若組織塊不易貼壁可預(yù)先在瓶壁涂一薄層血清、胎汁或鼠尾膠原等。開始培養(yǎng)時(shí)培養(yǎng)基不宜多，以保持組織塊濕潤即可，培養(yǎng)開始培養(yǎng)時(shí)培養(yǎng)基不宜多，以保持組織塊濕潤即可，培養(yǎng)24小時(shí)后再補(bǔ)液，小時(shí)后再補(bǔ)液，培養(yǎng)初期移動(dòng)和觀察時(shí)要輕拿輕放，開始幾天盡量不去搬動(dòng)，以利貼壁和培養(yǎng)初期移動(dòng)和觀察時(shí)要輕拿輕放，開始幾天盡量不去搬動(dòng)，以利貼壁和生長，培養(yǎng)生長，培養(yǎng)35天時(shí)可換液，一方面補(bǔ)充營養(yǎng)，一方面去除代謝產(chǎn)物和漂浮天時(shí)可換液，一方面補(bǔ)充營養(yǎng)，一方面去除代謝產(chǎn)物和漂浮小塊所產(chǎn)生的毒性作用。小塊所產(chǎn)生的毒性作用。原代細(xì)胞的培養(yǎng)方法原代細(xì)胞的培養(yǎng)方法 17182.消化培養(yǎng)法消化培養(yǎng)法該方法是采用

17、前述的消化分散法，將妨礙細(xì)胞生長的細(xì)胞間質(zhì)（包括基質(zhì)、纖維等）該方法是采用前述的消化分散法，將妨礙細(xì)胞生長的細(xì)胞間質(zhì)（包括基質(zhì)、纖維等）去除，使細(xì)胞分散形成細(xì)胞懸液，然后分瓶培養(yǎng)。去除，使細(xì)胞分散形成細(xì)胞懸液，然后分瓶培養(yǎng)。193.懸浮細(xì)胞培養(yǎng)法懸浮細(xì)胞培養(yǎng)法對于懸浮生長的細(xì)胞，如白血病細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、骨髓細(xì)胞、胸水和腹水中的癌對于懸浮生長的細(xì)胞，如白血病細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、骨髓細(xì)胞、胸水和腹水中的癌細(xì)胞和免疫細(xì)胞無需消化，可采用低速離心分離，直接培養(yǎng)，或經(jīng)淋巴細(xì)胞分層細(xì)胞和免疫細(xì)胞無需消化，可采用低速離心分離，直接培養(yǎng)，或經(jīng)淋巴細(xì)胞分層液分離后接種培養(yǎng)。液分離后接種培養(yǎng)。20原代和傳代細(xì)胞的培養(yǎng)

18、和維持原代和傳代細(xì)胞的培養(yǎng)和維持一、原代細(xì)胞的培養(yǎng)與維持一、原代細(xì)胞的培養(yǎng)與維持 1、靜置貼壁細(xì)胞、靜置貼壁細(xì)胞(包括半貼壁細(xì)胞的培養(yǎng)包括半貼壁細(xì)胞的培養(yǎng))凡經(jīng)消化液處理實(shí)體組織來源的細(xì)胞要通過凡經(jīng)消化液處理實(shí)體組織來源的細(xì)胞要通過充分漂洗充分漂洗，以盡量除去消化液的，以盡量除去消化液的毒性，細(xì)胞接種時(shí)濃度要稍大一些，至少為毒性，細(xì)胞接種時(shí)濃度要稍大一些，至少為5 5108108細(xì)胞細(xì)胞/L/L，培養(yǎng)基可用，培養(yǎng)基可用Eagle(MEM)Eagle(MEM)或或DNEMDNEM培養(yǎng)，小牛血清濃度為培養(yǎng)，小牛血清濃度為10%10%80%80%在起始的在起始的2 2天中天中盡量減少振盡量減少振蕩蕩

19、，以防止剛貼壁的細(xì)胞發(fā)生脫落，漂浮。，以防止剛貼壁的細(xì)胞發(fā)生脫落，漂浮。貼壁細(xì)胞長成網(wǎng)狀或基本單層時(shí)，由于營養(yǎng)缺乏，代謝產(chǎn)物增多，貼壁細(xì)胞長成網(wǎng)狀或基本單層時(shí)，由于營養(yǎng)缺乏，代謝產(chǎn)物增多，pH變酸，變酸，不適宜細(xì)胞生長，此時(shí)細(xì)胞還未長成單層，未達(dá)到飽和密度，仍需繼續(xù)培養(yǎng)，因不適宜細(xì)胞生長，此時(shí)細(xì)胞還未長成單層，未達(dá)到飽和密度，仍需繼續(xù)培養(yǎng)，因此，需采此，需采取換液方式取換液方式來更新營養(yǎng)成分以滿足細(xì)胞繼續(xù)生長繁殖的需要。其換液方來更新營養(yǎng)成分以滿足細(xì)胞繼續(xù)生長繁殖的需要。其換液方法比較簡單，即棄去舊液，加入與原培養(yǎng)液相同的等量完全培養(yǎng)基。法比較簡單，即棄去舊液，加入與原培養(yǎng)液相同的等量完全培養(yǎng)

20、基。 212、懸浮細(xì)胞的培養(yǎng)、懸浮細(xì)胞的培養(yǎng)凡來自外周血、胸腹水、脾臟、淋巴結(jié)、骨髓的淋巴細(xì)胞、造血干細(xì)胞以及凡來自外周血、胸腹水、脾臟、淋巴結(jié)、骨髓的淋巴細(xì)胞、造血干細(xì)胞以及白血病細(xì)胞，在原代培養(yǎng)時(shí)要盡量去除紅細(xì)胞若要將淋巴細(xì)胞及白血病細(xì)胞進(jìn)白血病細(xì)胞，在原代培養(yǎng)時(shí)要盡量去除紅細(xì)胞若要將淋巴細(xì)胞及白血病細(xì)胞進(jìn)行長期培養(yǎng)，淋巴細(xì)胞中要加入生長因子，白血病細(xì)胞中要加入少量的原患者血行長期培養(yǎng)，淋巴細(xì)胞中要加入生長因子，白血病細(xì)胞中要加入少量的原患者血清，以利細(xì)胞生長，待細(xì)胞開始增殖甚至結(jié)成小團(tuán)塊，培養(yǎng)基中清，以利細(xì)胞生長，待細(xì)胞開始增殖甚至結(jié)成小團(tuán)塊，培養(yǎng)基中pH變酸，說明變酸，說明細(xì)胞生長繁殖

21、良好，一般每隔細(xì)胞生長繁殖良好，一般每隔3天需半量換液一次（換液時(shí)盡量使細(xì)胞不丟失），天需半量換液一次（換液時(shí)盡量使細(xì)胞不丟失），待細(xì)胞增殖加快，濃度明顯增加，待細(xì)胞增殖加快，濃度明顯增加，pH發(fā)生明顯變化時(shí)，此時(shí)可考慮傳代。發(fā)生明顯變化時(shí)，此時(shí)可考慮傳代。懸浮細(xì)胞在未達(dá)到飽和密度時(shí)，但培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分并不能維持細(xì)胞的營養(yǎng)懸浮細(xì)胞在未達(dá)到飽和密度時(shí)，但培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分并不能維持細(xì)胞的營養(yǎng)需求時(shí)，只能采用半量換液的方式需求時(shí)，只能采用半量換液的方式 22二、原代細(xì)胞培養(yǎng)的首次傳代二、原代細(xì)胞培養(yǎng)的首次傳代 (Subculture)這種使原代細(xì)胞經(jīng)分散接種的過程稱之為傳代。每進(jìn)行一次分離再培養(yǎng)

22、稱之為傳一代，傳至510代以內(nèi)的細(xì)胞通常稱為次代培養(yǎng)細(xì)胞，傳至1020代以上的細(xì)胞，通常確定為傳代細(xì)胞（或稱傳代細(xì)胞系）。傳代細(xì)胞系的建立，關(guān)鍵是初代培養(yǎng)的首次傳代。應(yīng)注意如下幾點(diǎn)：(1)細(xì)胞生長密度不高時(shí)，或未能達(dá)到覆蓋整個(gè)瓶底時(shí)不能急于傳代。(2)原代培養(yǎng)的貼壁細(xì)胞多為混雜細(xì)胞，形態(tài)各異，往往是上皮樣細(xì)胞和成纖維樣細(xì)胞并存，采用胰蛋白酶消化時(shí)要掌握好消化時(shí)間，因成纖維細(xì)胞易于脫壁，上皮細(xì)胞不易脫壁，因此，可根據(jù)需要選用適當(dāng)?shù)南瘯r(shí)間及時(shí)中止消化。在早先傳代時(shí)，其消化時(shí)間比一般已建系的細(xì)胞相對長一些。(3)吹打已消化的細(xì)胞要輕巧，既不能聽到有明顯的吹打聲，又不能有大量泡沫在懸液中形成，以盡可

23、能減少對細(xì)胞的機(jī)械損傷。(4)首次傳代時(shí)細(xì)胞接種數(shù)量要多一些，以利于細(xì)胞的生存和繁殖。如果消化分離的細(xì)胞懸液有組織塊，也一并傳入到培養(yǎng)瓶，盡量減少細(xì)胞損失。(5)首次傳代培養(yǎng)時(shí)的pH不能高，寧可偏低一些。此外，小牛血清濃度可適當(dāng)加大至15%20%左右。 23三、傳代細(xì)胞的傳代培養(yǎng)三、傳代細(xì)胞的傳代培養(yǎng)(1)吸除或倒掉原瓶中的舊培養(yǎng)基（以吸除或倒掉原瓶中的舊培養(yǎng)基（以25mL培養(yǎng)瓶為例）。培養(yǎng)瓶為例）。(2)每瓶加入每瓶加入2mL，無鈣、鎂，無鈣、鎂PBS，漂洗一次后倒掉。，漂洗一次后倒掉。(3)每瓶加入每瓶加入1mL消化液（消化液（0.25%胰蛋白酶或胰蛋白酶或0.02%EDTA或混合液），輕

24、輕搖動(dòng)培養(yǎng)瓶，或混合液），輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)瓶，經(jīng)消化液鋪滿所有細(xì)胞表面，待細(xì)胞層略有松動(dòng)，肉眼可觀察到經(jīng)消化液鋪滿所有細(xì)胞表面，待細(xì)胞層略有松動(dòng)，肉眼可觀察到“薄膜薄膜”現(xiàn)象時(shí)，倒掉消現(xiàn)象時(shí)，倒掉消化液，再繼續(xù)作用化液，再繼續(xù)作用23分鐘，輕輕搖動(dòng)，細(xì)胞層可隨殘留的消化液呈片狀從瓶壁上脫落分鐘，輕輕搖動(dòng)，細(xì)胞層可隨殘留的消化液呈片狀從瓶壁上脫落下來，在顯微鏡下可發(fā)現(xiàn)細(xì)胞回縮變圓，細(xì)胞間隙增大，此時(shí)應(yīng)立即終止消化。下來，在顯微鏡下可發(fā)現(xiàn)細(xì)胞回縮變圓，細(xì)胞間隙增大，此時(shí)應(yīng)立即終止消化。(4)加入完全培養(yǎng)基加入完全培養(yǎng)基5mL，用吸管反復(fù)吹打瓶壁上的細(xì)胞，吹打時(shí)要按順序進(jìn)行，以確保，用吸管反復(fù)吹打瓶壁上

25、的細(xì)胞，吹打時(shí)要按順序進(jìn)行，以確保所有瓶壁均吹打到，吹打時(shí)動(dòng)作要輕柔，不要用力過大，盡可能不要出現(xiàn)泡沫，以避免所有瓶壁均吹打到，吹打時(shí)動(dòng)作要輕柔，不要用力過大，盡可能不要出現(xiàn)泡沫，以避免細(xì)胞的機(jī)械損傷細(xì)胞的機(jī)械損傷(5)用計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，計(jì)算細(xì)胞的濃度，并用培養(yǎng)基調(diào)整適當(dāng)?shù)募?xì)胞濃度后再分瓶培養(yǎng)。用計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，計(jì)算細(xì)胞的濃度，并用培養(yǎng)基調(diào)整適當(dāng)?shù)募?xì)胞濃度后再分瓶培養(yǎng)。 24四、傳代細(xì)胞的建系和維持四、傳代細(xì)胞的建系和維持 1.細(xì)胞檔案細(xì)胞檔案要記錄好，如組織來源、生物學(xué)特性（由形態(tài)、生長繁殖曲線、染色體核型情況、代謝特性、分化特性、病毒敏感性、致瘤特性、有無支原體和潛存病毒等）、培養(yǎng)基的要求、傳代換

26、液時(shí)間、擴(kuò)增時(shí)間(分裂指數(shù))，細(xì)胞的特殊遺傳標(biāo)志(標(biāo)記染色體)等，這些記錄對于保證細(xì)胞的正常生長，保持細(xì)胞的一致和經(jīng)長期培養(yǎng)細(xì)胞特性的變異比較，都有十分重要的意義。 2.換液傳代(1)細(xì)胞系的傳代、換液方法與前相同，但一般都有自身的規(guī)律性，因而在繼續(xù)傳代時(shí)，要注意保持其穩(wěn)定的規(guī)律性，這樣可以減少由于傳代時(shí)細(xì)胞密度的頻繁增減或換液時(shí)間的不規(guī)律而導(dǎo)致細(xì)胞生長特性的改變，給以后的實(shí)驗(yàn)帶來影響。(2)多種細(xì)胞系維持傳代，要嚴(yán)格操作程序，對所用的試劑各系不能交叉每傳5代后，細(xì)胞種子均應(yīng)凍存。傳代時(shí)均應(yīng)作好記錄，培養(yǎng)瓶上要有明顯標(biāo)記，標(biāo)記細(xì)胞系名稱和傳代的代數(shù)及傳代時(shí)間。細(xì)胞種子的及時(shí)凍存不僅可防止污染丟

27、失，而且還可防止因盲目傳代而造成細(xì)胞變異，此外還可提供不同代次的細(xì)胞同時(shí)進(jìn)行對比試驗(yàn)。3.細(xì)胞系（或株）的鑒定和管理25細(xì)胞的純化和克隆細(xì)胞的純化和克隆一、細(xì)胞的純化一、細(xì)胞的純化(一一)自然純化自然純化自然純化即利用某一種類細(xì)胞的增殖優(yōu)勢，在長期傳代過程中靠自然淘汰法，不斷排自然純化即利用某一種類細(xì)胞的增殖優(yōu)勢，在長期傳代過程中靠自然淘汰法，不斷排擠其他生長慢的細(xì)胞，靠自然增殖的潛力，最后留下生長優(yōu)勢旺的細(xì)胞，達(dá)到細(xì)胞純化的擠其他生長慢的細(xì)胞，靠自然增殖的潛力，最后留下生長優(yōu)勢旺的細(xì)胞，達(dá)到細(xì)胞純化的目的目的。 (二二)人工純化人工純化1、細(xì)胞因子依賴純化法、細(xì)胞因子依賴純化法人和動(dòng)物組織中

28、某些細(xì)胞需要有特殊的細(xì)胞因子存在的微環(huán)境才能長期存活和生長繁殖人和動(dòng)物組織中某些細(xì)胞需要有特殊的細(xì)胞因子存在的微環(huán)境才能長期存活和生長繁殖 2、酶消化法、酶消化法不僅對貼壁細(xì)胞可行，能利用上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞對胰蛋白酶的耐受性不同，使兩不僅對貼壁細(xì)胞可行，能利用上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞對胰蛋白酶的耐受性不同，使兩者分開，達(dá)到純化的目的，對貼壁細(xì)胞與半貼壁及粘附細(xì)胞間的分離純化也是十分有效的。者分開，達(dá)到純化的目的，對貼壁細(xì)胞與半貼壁及粘附細(xì)胞間的分離純化也是十分有效的。 3、機(jī)械刮除法、機(jī)械刮除法4、反復(fù)貼壁法、反復(fù)貼壁法5、電烙篩選法、電烙篩選法26二、細(xì)胞的克隆化二、細(xì)胞的克隆化細(xì)胞克隆技術(shù)又

29、稱單個(gè)細(xì)胞分離培養(yǎng)技術(shù)，即從細(xì)胞群體中分離出一個(gè)細(xì)胞，細(xì)胞克隆技術(shù)又稱單個(gè)細(xì)胞分離培養(yǎng)技術(shù)，即從細(xì)胞群體中分離出一個(gè)細(xì)胞，并使其在體外培養(yǎng)體系中能繁殖成新的細(xì)胞群體，這種由單個(gè)細(xì)胞所形成的細(xì)胞群并使其在體外培養(yǎng)體系中能繁殖成新的細(xì)胞群體，這種由單個(gè)細(xì)胞所形成的細(xì)胞群（或集落）稱為一個(gè)克隆，這種純化后的細(xì)胞群體稱為細(xì)胞株（或集落）稱為一個(gè)克隆，這種純化后的細(xì)胞群體稱為細(xì)胞株 (cell strain)。 1.毛細(xì)管法毛細(xì)管法 2.有限稀釋法有限稀釋法 3.平皿克隆分離法平皿克隆分離法4.軟瓊脂克隆分離法軟瓊脂克隆分離法5單細(xì)胞顯微操作法單細(xì)胞顯微操作法272829按照培養(yǎng)細(xì)胞的主要形態(tài)，可分為幾大類型