1、.VEGF對非小細胞肺癌轉歸的影響對非小細胞肺癌轉歸的影響中國武警醫學院附屬醫院腫瘤中心中國武警醫學院附屬醫院腫瘤中心 穆海玉穆海玉 .前言前言n 肺癌是當今世界上對人類健康和生命危害最大的惡性腫瘤，隨著傳統肺癌是當今世界上對人類健康和生命危害最大的惡性腫瘤，隨著傳統化療進入了一個平臺期，靶向治療引起人們的高度關注。實驗顯示新生化療進入了一個平臺期，靶向治療引起人們的高度關注。實驗顯示新生血管生成是腫瘤生長與轉移的解剖學和生理學基礎，因此研究可能影響血管生成是腫瘤生長與轉移的解剖學和生理學基礎，因此研究可能影響肺癌血管生成的因素，尋找有效的抗血管生成藥物，可望在很大程度上肺癌血管生成的因素，尋

2、找有效的抗血管生成藥物，可望在很大程度上改變肺癌治療的現狀。研究顯示：血管內皮生長因子（改變肺癌治療的現狀。研究顯示：血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor VEGF）是肺癌血管生成的關鍵因素。本）是肺癌血管生成的關鍵因素。本實驗采用實驗采用SP免疫組織化學方法，檢測肺癌組織中免疫組織化學方法，檢測肺癌組織中VEGF的陽性表達，分的陽性表達，分析研究它與微血管密度（析研究它與微血管密度（microvessel density MVD）之間的關系及）之間的關系及與臨床病理、組織分型和轉移之間的聯系，以探討與臨床病理、組織分型和轉移之間的聯系，以探討

3、VEGF在肺癌血管生在肺癌血管生成中的作用。成中的作用。.對象及分組對象及分組 （1） 肺癌組：共肺癌組：共40例，平均年齡例，平均年齡52.6歲，其中男歲，其中男21例，女例，女19例。所有患者術前均未接受放化療。所有標本均重新切片后經例。所有患者術前均未接受放化療。所有標本均重新切片后經HE染色證實為肺癌。其中鱗癌染色證實為肺癌。其中鱗癌21例，腺癌例，腺癌14例，小細胞未分例，小細胞未分化癌化癌 5例；高分化例；高分化20例，中分化例，中分化7例，低分化例，低分化8例；例；期期期期21例，例，期期期期14例。例。 （2） 肺良性病組：共肺良性病組：共12例，男例，男9例，女例，女3例；平

4、均年齡例；平均年齡49.8歲。歲。標本重新切片后經標本重新切片后經HE染色證實染色證實7例為結核球、例為結核球、5例為肺炎。例為肺炎。 （3） 正常對照組：共正常對照組：共10例，男例，男6例，女例，女4例；平均年齡例；平均年齡47.6歲。歲。經經HE染色證實為正常肺組織。染色證實為正常肺組織。.方法方法 所有石蠟標本均行所有石蠟標本均行5切片，連續切切片，連續切4片，置片，置60度烤箱內烤度烤箱內烤30分鐘。分鐘。所有切片分別經二甲苯脫蠟，無水酒精及其它不同濃度酒精脫苯，所有切片分別經二甲苯脫蠟，無水酒精及其它不同濃度酒精脫苯，自來水洗自來水洗2分鐘水化。必選一張切片行分鐘水化。必選一張切片

5、行HE染色核實病理診斷。采染色核實病理診斷。采用用SP免疫組織化學染色法，按藥盒操作規程進行。以免疫組織化學染色法，按藥盒操作規程進行。以PBS代替一代替一抗作陰性對照，用武漢博士德生物工程有限公司提供的已知陽性抗作陰性對照，用武漢博士德生物工程有限公司提供的已知陽性切片作陽性對照。切片作陽性對照。.結果判定結果判定n VEGF表達的判定：鏡下癌細胞漿呈棕黃色顆粒狀表達的判定：鏡下癌細胞漿呈棕黃色顆粒狀者為陽性，細胞漿呈透明或無色者為陰性，每張切者為陽性，細胞漿呈透明或無色者為陰性，每張切片中觀察片中觀察5個高倍視野個高倍視野200， 每一視野記數每一視野記數100個細胞，陽性染色細胞個細胞，

6、陽性染色細胞10%為為陰性，陰性，10%為陽性。為陽性。.nMVD的測定：的測定：參考參考Weidner方法，先在低倍鏡下掃視整個切方法，先在低倍鏡下掃視整個切片，確定對片，確定對FAg明顯著棕褐色微血管密度最高區，即明顯著棕褐色微血管密度最高區，即 “熱點熱點”。然后換成高倍鏡進行記數。凡在腫瘤組織中與鄰近微血管、腫瘤然后換成高倍鏡進行記數。凡在腫瘤組織中與鄰近微血管、腫瘤細胞及其它結締組織分界清楚的任何一個染成棕褐色的細胞或細細胞及其它結締組織分界清楚的任何一個染成棕褐色的細胞或細胞簇均被認為是一個血管；只要結構不相連，其分枝結構也算作胞簇均被認為是一個血管；只要結構不相連，其分枝結構也算

7、作一個血管。但不能用有無紅細胞的出現及是否形成管腔來記數血一個血管。但不能用有無紅細胞的出現及是否形成管腔來記數血管數。已形成明顯肌層的血管不參與計數，結果以管數。已形成明顯肌層的血管不參與計數，結果以3個視野血管個視野血管的均數表示。的均數表示。.n計量資料數據采用計量資料數據采用均數均數標準差表示標準差表示，所得，所得數據采用數據采用t檢驗和方差分析；計數資料采用檢驗和方差分析；計數資料采用x2檢驗。檢驗。統計學處理統計學處理.結果結果1-三種肺組織中三種肺組織中MVD分布情況分布情況 n陽性染色局限于血管內皮細胞膜，呈棕褐陽性染色局限于血管內皮細胞膜，呈棕褐色，微血管形態不規則，在癌組織

8、中的分色，微血管形態不規則，在癌組織中的分布呈異質性，大多集中在腫瘤邊緣。布呈異質性，大多集中在腫瘤邊緣。 . n MVD肺癌組肺癌組 40 20.78 5.86 良性組良性組 12 6.83 1.23 正常組正常組 10 5.20 1.13P值值 P良良=0.003 P正正=0.002表表1 MVD在三種肺組織中的表達在三種肺組織中的表達. VEGF著色為棕黃色顆粒，陽性染色主要分布于癌細著色為棕黃色顆粒，陽性染色主要分布于癌細胞胞漿中，在腫瘤壞死灶周圍尤為明顯。肺癌組織胞胞漿中，在腫瘤壞死灶周圍尤為明顯。肺癌組織VEGF陽性率顯著高于肺良性病變和正常對照組。陽性率顯著高于肺良性病變和正常對

9、照組。見表見表2結果結果2-VEGF在三種肺組織中的表達在三種肺組織中的表達. 例數例數 VEGF+ VEGF- P值值肺癌肺癌 40 25 15 P癌癥癌癥-良性良性=0.014肺良肺良 12 2 10 P癌癥癌癥-正常正常=0.001正常正常 10 0 10 P良性良性-正常正常=0.542表表2 VEGF在三種肺組織中的表達在三種肺組織中的表達.結果結果3 MVD、 VEGF表達與臨床參數之間的關系表達與臨床參數之間的關系nMVD與原發腫瘤大小、組織學分級、淋巴轉移有關，與原發腫瘤大小、組織學分級、淋巴轉移有關，而與病理分型無關，見表而與病理分型無關，見表3。nVEGF與原發腫瘤大小、淋

10、巴轉移有關，而與組織與原發腫瘤大小、淋巴轉移有關，而與組織學分級、病理分型無關，見表學分級、病理分型無關，見表3。.臨床病理特征臨床病理特征 N MVD P VEGF P + -腫瘤大小腫瘤大小 5cm 19 17.16 4.11 0.003 11 8 0.0215cm 16 25.63 4.77 14 2組織學分級組織學分級 高 20 17.35 4.22 0.000 13 7 0.629 中 7 23.14 4.38 0.023 5 2 0.897 低 8 28.25 4.20 7 1病理分型病理分型鱗癌 21 20.24 56.1 0.72 14 7 0.504腺癌 14 22.21 6

11、.74 11 3 淋巴結轉移淋巴結轉移有 13 26.62 4.58 0.002 12 1 0.02無 22 17.73 4.13 13 9 表表3 非小細胞肺癌非小細胞肺癌MVD、VEGF表達與臨床參數之間的關系表達與臨床參數之間的關系.VEGF MVD P值值 陽性（陽性（ 25 例例 ） 23.405.29 P=0.012陰性（陰性（15例）例） 16.403.85結果結果4-肺癌肺癌VEGF表達與表達與MVD的關系的關系表表4.討論討論 n一、肺癌的微血管密度：腫瘤是代謝高度旺盛的細胞，在腫瘤發生的一、肺癌的微血管密度：腫瘤是代謝高度旺盛的細胞，在腫瘤發生的早期，腫瘤細胞可通過組織滲透

12、而維持其生長，此期腫瘤處于高增生早期，腫瘤細胞可通過組織滲透而維持其生長，此期腫瘤處于高增生和高凋亡平衡的休眠狀態當腫瘤直徑和高凋亡平衡的休眠狀態當腫瘤直徑1mm后，腫瘤必須產生提供后，腫瘤必須產生提供自身營養的新血管，血管新生是腫瘤生長與發展的必經之路自身營養的新血管，血管新生是腫瘤生長與發展的必經之路,與實體與實體瘤的發生和轉移有著不可分割的密切關系瘤的發生和轉移有著不可分割的密切關系 。應用特異性抗體標記腫。應用特異性抗體標記腫瘤組織血管內皮細胞，記數單位面積中的微血管數目，即為微血管密瘤組織血管內皮細胞，記數單位面積中的微血管數目，即為微血管密度（度（MVD），通過它可衡量腫瘤血管生成

13、的活躍程度。），通過它可衡量腫瘤血管生成的活躍程度。.n資料報道：包括肺癌在內的腫瘤組織內資料報道：包括肺癌在內的腫瘤組織內MVD明顯增高，并與預后呈明顯增高，并與預后呈顯著負相關。我們的試驗顯示：微血管在癌組織中的分布呈異質性，顯著負相關。我們的試驗顯示：微血管在癌組織中的分布呈異質性，大多集中在腫瘤邊緣，肺癌組織大多集中在腫瘤邊緣，肺癌組織MVD顯著高于肺良性病變和正常組顯著高于肺良性病變和正常組織，差異具有統計學意義（織，差異具有統計學意義（p0.01），）， 而肺良性病變和正常組織而肺良性病變和正常組織的的MVD無顯著差異。通過比較非小細胞肺癌不同狀態下無顯著差異。通過比較非小細胞肺癌

14、不同狀態下MVD表達，表達，我們發現肺癌的我們發現肺癌的MVD與原發腫瘤的大小、淋巴結轉移狀態、腫瘤的與原發腫瘤的大小、淋巴結轉移狀態、腫瘤的分化程度密切相關（分化程度密切相關（p0.01），）， 證實肺癌組織新生血管活躍，證實肺癌組織新生血管活躍，MVD是反映和判斷肺癌血管生成狀態以及臨床轉歸的一個獨立、相是反映和判斷肺癌血管生成狀態以及臨床轉歸的一個獨立、相關性良好的指標，關性良好的指標， .n二、肺癌的血管內皮生長因子高表達：肺癌血管生成過程主要兩二、肺癌的血管內皮生長因子高表達：肺癌血管生成過程主要兩類因子調節類因子調節:血管生成促進因子和抑制因子，前者中功能最強、血管生成促進因子和抑

15、制因子，前者中功能最強、作用最直接的是作用最直接的是VEGF 。 在肺癌組織中，腫瘤的快速增殖導致細在肺癌組織中，腫瘤的快速增殖導致細胞乏氧等一系列因素它誘導胞乏氧等一系列因素它誘導VEGF的異常分泌，表現為腫瘤組織的異常分泌，表現為腫瘤組織內的高表達。內的高表達。.nVEGF能夠特異性地與血管內皮細胞膜上的受體結合，刺激能夠特異性地與血管內皮細胞膜上的受體結合，刺激內皮細胞的分裂、增殖、遷移，促使毛細血管絆形成并向瘤內皮細胞的分裂、增殖、遷移，促使毛細血管絆形成并向瘤體內延伸，誘導腫瘤血管新生，導致腫瘤內大量結構和功能體內延伸，誘導腫瘤血管新生，導致腫瘤內大量結構和功能異常的微血管數量增加，

16、滿足腫瘤對代謝的需要。異常的微血管數量增加，滿足腫瘤對代謝的需要。 VEGF信信號傳導通路在腫瘤的血管生長調控中非常重要，國內外許多號傳導通路在腫瘤的血管生長調控中非常重要，國內外許多實驗都通過干擾這個通路來研究調控腫瘤的血管生長。實驗都通過干擾這個通路來研究調控腫瘤的血管生長。.n一些研究發現：無論是在體外培養的腫瘤細胞、動物模型，還是一些研究發現：無論是在體外培養的腫瘤細胞、動物模型，還是人體腫瘤組織中均有人體腫瘤組織中均有VEGF的高表達，肺癌組織的高表達，肺癌組織VEGF表達的陽表達的陽性率、陽性細胞數和染色強度均高于癌旁正常組織。本研究檢測性率、陽性細胞數和染色強度均高于癌旁正常組織

17、。本研究檢測了了40例肺癌患者組織標本顯示：例肺癌患者組織標本顯示： VEGF主要分布于腫瘤胞漿中，主要分布于腫瘤胞漿中，在腫瘤壞死灶中尤為明顯。癌組織中在腫瘤壞死灶中尤為明顯。癌組織中 VEGF陽性率顯著高于肺良陽性率顯著高于肺良性病變組織及正常對照組織（性病變組織及正常對照組織（ p0.01）;肺良性病變組織及正肺良性病變組織及正常對照組織的常對照組織的VEGF陽性率差異無顯著性，表明陽性率差異無顯著性，表明VEGF與肺癌的與肺癌的血管生成具有極其密切關系。血管生成具有極其密切關系。.n三、三、VEGF的高表達與臨床特征：的高表達與臨床特征：VEGF的過表達促使肺癌組織新生的過表達促使肺癌

18、組織新生血管增加，而腫瘤新生幼稚血管的結構缺乏完整性，管壁僅排列一血管增加，而腫瘤新生幼稚血管的結構缺乏完整性，管壁僅排列一層內皮細胞，并且由于缺乏平滑肌，基底膜變薄或消失缺如，肺癌層內皮細胞，并且由于缺乏平滑肌，基底膜變薄或消失缺如，肺癌細胞易于侵蝕血管，使腫瘤細胞極易脫離母體進入血管，造成肺癌細胞易于侵蝕血管，使腫瘤細胞極易脫離母體進入血管，造成肺癌的血行轉移。學者們通過對手術切除的肺癌患者的血行轉移。學者們通過對手術切除的肺癌患者VEGF表達高低的測表達高低的測定以及術后生存率的觀測發現：肺癌患者中定以及術后生存率的觀測發現：肺癌患者中VEGF高表達者的術后生高表達者的術后生存時間較短，

19、且較早復發。另外一些研究也顯示：肺癌組織血管新存時間較短，且較早復發。另外一些研究也顯示：肺癌組織血管新生與患者的生存期密切關聯，呈十分良好的相關性，生與患者的生存期密切關聯，呈十分良好的相關性，.n通過評價非小細胞肺癌通過評價非小細胞肺癌VEGF表達與臨床特征的關系，我們注意表達與臨床特征的關系，我們注意到：腫瘤直徑到：腫瘤直徑5cm組組VEGF陽性率與腫瘤直徑陽性率與腫瘤直徑5cm組相比差組相比差異顯著（異顯著（ p0.05） ；淋巴結轉移組；淋巴結轉移組VEGF陽性率與無淋巴結轉陽性率與無淋巴結轉移組相比有差異統計學意義（移組相比有差異統計學意義（ p0.05） 。這個結果表明：在。這個

20、結果表明：在非小細胞肺癌中，非小細胞肺癌中，VEGF的高表達與原發腫瘤的大小、淋巴結轉的高表達與原發腫瘤的大小、淋巴結轉移狀態密切相關移狀態密切相關 ,是肺癌病灶生長、遠處轉移極其重要的因素，是肺癌病灶生長、遠處轉移極其重要的因素，它的存在使肺癌的預后向不良方向迅速發展。它的存在使肺癌的預后向不良方向迅速發展。.n四、四、 VEGF與與MAD的關系：為進一步確定的關系：為進一步確定VEGF與肺癌組織血管與肺癌組織血管新生的關聯性，我們分析了不同新生的關聯性，我們分析了不同VEGF表達的組織中表達的組織中MAD的表達，的表達，實驗表明：實驗表明：VEGF陽性高表達組陽性高表達組MAD計數顯著增高

21、，而計數顯著增高，而VEGF低低表達組表達組MAD則較低，兩者差異具有統計學意義（則較低，兩者差異具有統計學意義（P=0.012），），說明說明VEGF與與MAD之間確實存在正相關的密切關系，進一步證實之間確實存在正相關的密切關系，進一步證實了了VEGF在促使肺癌新血管生成方面所發揮的重要作用。在促使肺癌新血管生成方面所發揮的重要作用。.結論結論n（1） MVD是評估和判斷肺癌血管生成狀態一個獨立的、相關性是評估和判斷肺癌血管生成狀態一個獨立的、相關性良好的指標良好的指標,它與肺癌的進展密切相關；（它與肺癌的進展密切相關；（2） VEGF在肺癌組織在肺癌組織中呈現陽性過表達，中呈現陽性過表達，

22、 VEGF表達與表達與MVD具有良好的相關性；（具有良好的相關性；（3）VEGF表達與非小細胞肺癌腫瘤病灶大小，淋巴結轉移密切相關，表達與非小細胞肺癌腫瘤病灶大小，淋巴結轉移密切相關，而與腫瘤的分化程度、病理分型無關。提示：而與腫瘤的分化程度、病理分型無關。提示：VEGF通過促使血管通過促使血管新生成而影響非小細胞肺癌的發展和預后；新生成而影響非小細胞肺癌的發展和預后； VEGF的靶向治療將的靶向治療將通過阻斷肺癌血管的生長，而控制非小細胞肺癌的侵襲和遠處轉通過阻斷肺癌血管的生長，而控制非小細胞肺癌的侵襲和遠處轉移。移。. 參考文獻n1 Bun PA1 Bun PA，et al. New th

23、erapeutic strategies for lung et al. New therapeutic strategies for lung cancercancer：biology and molecular biology come age. Chest biology and molecular biology come age. Chest 20002000，117117（4 Suppl 14 Suppl 1）：）：s163-s168s163-s168n2. Yuan A2. Yuan A，et al. Correlation of total VEGF mRNA and et al. Correlation of total VEGF mRNA and protein expre