1、克隆載體基本性質基本特征（或載體的構建）原理機制常用的載體克隆載體質粒載體質粒能利用寄主細胞的DNA復制系統進行自主復制；不相容性；可轉移性（基因工程中采用非接合性質粒）（1）具有合適的復制起始位點（ORI）（2）具有合適的選擇性標記基因（3）若干限制性內切酶的單一位點（4）具有較小的分子量和較高的拷貝數。當帶有抗菌素抗性基因的載體進入受體菌后，受體菌才能生長。不帶有抗菌素抗性基因的受體菌不能在含有抗菌素的培養基（選擇培養基）中生長。（抗菌素選擇原理）pSC101ColE1pBR322pUC18pUC19TA載體噬菌體載體噬菌體其DNA兩端的5末端各帶有12個堿基的互補單鏈，即cos位點。有可

2、替代區，即非必需區。用外源DNA片段替代這個區域，不會影響噬菌體顆粒的形成。(1)基因組大小；去除非必需區，建立外源DNA片段的克隆或替換位點（2）在DNA的非必需區插入選擇標記：lacZ 基因；基因 c 失活（cI基因：溶源過程控制基因）；Spi 篩選（野生型 噬菌體在帶有 P2 原噬菌體的溶源性 E.coli 中 的生長會受到限制的表型，稱作 Spi+ ，即對 P2 噬菌體的干擾敏感）1) 通過裂解過程增殖載體2)載體與外源DNA的酶切3) 外源DNA與載體的連接4)重組噬菌體的體外包裝5) 包裝噬菌體顆粒的感染6)篩選（噬菌體載體的克隆原理）插入式載體置換型載體（取代型載體）M13噬菌體

3、載體M13 噬菌體的基因組為單鏈 DNA。噬菌體顆粒的大小受其DNA端點制約的，不存在包裝限制。只感染雄性大腸桿菌基因間隔區（intergenic region, IG區） 基因II與基因IV之間存在一段507bp的基因間隔區，內含有復制起始位點，是實施改造、構建人工載體的重點區域。 IG區內只有一個 Bsu I 切點。（2）加入酶切位點，在IG區內加入單一內切酶位點。M13mp1 在IG區內插入一個大腸桿菌的LacZ（a-肽序列)。使克隆的DNA片段以特定單鏈的形式輸出受體細胞外，M13重組分子篩選簡便，被M13噬菌體感染的受體細胞生長緩慢，形成混濁斑，易于辨認挑選。而且重組分子越大，混濁斑

4、的混濁度亦越大 但M13-DNA載體的最大缺陷是裝載量小，只有1.5 kb1、以（+）鏈DNA為摸板，合成互補（）鏈，該雙鏈稱復制型DNA（RFDNA）。2、RFDNA在宿主細胞內能快速增殖，可增加到每個細胞約200個拷貝。3、單鏈特異的DNA結合蛋白結合在（+）鏈上，從而阻斷了其互補鏈，即（）鏈的合成，這樣，細胞就會不斷的合成（+）鏈DNA 4、游離出來的（+）鏈DNA先與基因V的編碼產物形成特異的DNA-蛋白質復合物，然后轉移到寄主細胞膜，同時基因V的蛋白質從（+）DNA鏈上脫落下來，余下的M13（+）鏈DNA則是從其感染的寄主細胞的細胞膜溢出的過程中，被外殼蛋白包裝成病毒顆粒的。 （M1

5、3噬菌體產生單雙鏈DNA的機制）M13mpn n代表系列數字 對M13mp1的改進加上常用的酶切位點。 M13mp2：LacZ 5端的第13個核苷酸G突變成A，產生了一個EcoR I切點噬菌體-質粒雜合載體黏粒載體考斯質粒是一類人工構建的含有-DNA cos序列和質粒復制子的的特殊類型載體。能像l -DNA那樣進行體外包裝，并高效轉染受體細胞；能像質粒那樣在受體細胞中自主復制具有較高容量的克隆能力：45kb；具有與同源性序列的質粒進行重組的能力粘粒（cosmid）是帶有 cos 序列的質粒。 cos 序列是 l 噬菌體 DNA 中將 DNA 包裝到噬菌體顆粒中所需的 DNA 序列。黏粒的組成包

6、括質粒復制起點（colE1），抗性標記（ampr）， cos 位點，因而能象質粒一樣轉化和增殖。克隆的最大 DNA 片段可達 45kb 。有的粘粒載體含有兩個 cos 位點，在某種程度上可提高使用效率。設計構建的柯斯質粒一般長46kb。其上的cos位點的一個重要作用是識別噬菌體的外殼蛋白。凡具有cos位點的任何DNA分子只要在長度相當于噬菌體基因組，就可以同外殼蛋白結合而被包裝成類似噬菌體的顆粒。因此，插入柯斯質粒的外源DNA可大于40kb。重組的柯斯質粒可象噬菌體一樣感染大腸桿菌，并在細菌細胞中復制。噬菌粒載體能像質粒那樣在受體細胞中自主復制能像M13-DNA那樣體外包裝，并高效轉染受體細胞

7、 裝載量比常規的M13mp系列要大很多（10 kb通過克隆雙鏈DNA能獲得同等長度的單一單鏈DNA重組操作簡便，篩選容易 噬菌粒載體綜合了質粒載體和M13噬菌體載體優點，含有ColEl復制起始位點、抗生素抗性選擇標記和絲狀體噬菌體DNA間隔區(含有噬菌體DNA復制起始、終止以及噬菌體顆粒形態發生所必需的全部順式作用元件)它具有質粒的復制起點、選擇性標記、多克隆位點等，方便DNA的操作，可在細胞內穩定存在；又具有單鏈噬菌體的復制起點，在輔助噬菌體的存在下，可進行噬菌體的繁殖，產生單鏈的子代噬菌體1. 具有較小分子量基因組DNA，可克隆10kb的外源DNA片段，并易于進行分離與操作；2. 編碼一個

8、ampr基因作為選擇記號，便于轉化子的選擇；3. 拷貝數含量高4. 存在著一個多克隆位點區，因此多種不同類型的外源DNA片段，不經修飾便可直接插入到載體分子上；5.多克隆位點區阻斷了大腸桿菌lacZ基因的5-端編碼區，可按照IPTG顯色反應試驗篩選6. lacZ基因是置于lac啟動子的控制之下，插入的外源基因便會以融合蛋白質的形式表達；7含有質粒的復制起點，可復制形成大量的雙鏈DNA分子8. 帶有一個M13噬菌體的復制起點，在有輔助噬菌體感染的寄主細胞中，可以合成出單DNA拷貝，并包裝成噬菌體顆分泌到培養基中；9.；在pUC118和pUC119這兩個載體中，多克隆位點區的核苷酸序列取向是彼此相

9、反的，于是它們當中的一個可轉錄克隆基因的正鏈DNA，另一個則可轉錄出負鏈DNApUC118和pUC119人工染色體染色體具有復制功能，利用染色體的復制元件來驅動外源DNA片段復制的載體稱為人工染色體載體其裝載外源DNA的容量比質粒、噬菌體和噬菌體-質粒雜合載體等有很大的拓展，甚至可以跟染色體的大小相媲美。 人工染色體載體拷貝數少，制備困難，通常采取“穿梭載體”的策略來解決含有質粒載體所必備的第一受體(大腸桿菌)質粒復制起始位點，這樣的載體在大腸桿菌內可以按質粒復制形式進行高拷貝復制， 含有第二受體(如酵母)端粒(TEL)、DNA復制起始位點(ARS)和著絲粒(CEN)以及合適的選擇標記。載體在

10、體外與目的DNA重組后轉化到第二受體細胞，按照染色體復制的形式進行復制和傳遞。 篩選第一受體的克隆子一般采用抗生素抗性選擇標記；篩選第二受體的克隆子常用與受體互補的營養缺陷型。酵母人工染色體載體YAC細菌人工染色體載體 BACP1噬菌體人工染色體載體PAC質粒載體總結質粒載體類型長度選擇標記克隆位點pSC101天然質粒，屬嚴緊型、低拷貝型9.09 kb四環素抗性Tetr7個克隆位點： EcoR I、Xho I、Pvu I、Hind III、BamH I、Sal I 、Sam I主要使用EcoR IColE1天然質粒，屬松弛型多拷貝型6.3 kb大腸桿菌素（colicin）E1和對E1免疫的基因

11、（immE1）EcoR I位于E1內部，插入外源DNA會導致E1失活，使受體菌不能合成E1（ColE1-），但仍然表現出對E1免疫型（ImmE1+）pBR322元件來源 復制起點 orip MB1系列（來源于ColE1）的高拷貝型復制起點 Ampr基因 pSP2124質粒的Ampr基因 Tetr基因 pSC101的Tetr 基因。4363bp氨芐青霉素和四環素抗性24個克隆位點。其中9個會導致Tetr基因失活（如BamH I、Hind 、Sal I）； 3個會導致Ampr基因失活（Sca I、PvuI、Pst I）。 pUC系列（i）來自pBR322質粒的復制起點（ori）；（ii）氨芐青霉素

12、抗性基因（ampr），但它不再含有原來的核酸內切限制酶的單識別位點；（iii）大腸桿菌-半乳糖酶基因（lacZ）的啟動子及其編碼-肽鏈的DNA序列，此結構特稱為lacZ基因；（iv）位于lacZ基因中的靠近5-端的一段多克隆位點（MCS）區段，但它并不破壞該基因的功能2.7kbAmpicillin 抗性和 lacZ的 肽互補（藍白斑）相結合。10個連續的單一限制酶切位點，位于lacZ基因的5端。TA載體耐熱聚合酶可在PCR產物的3端加上一個非配對的脫氧腺嘌呤核苷(A)。根據這一特點研制出線性TA質粒載體，其5端各帶有一個不配對的脫氧胸腺嘧啶(T)，用該載體可進行PCR產物的直接克隆。TA載體構

13、建：在一般質粒載體的基礎上構建。方法1：先采用限制性內切核酸酶酶切使質粒載體線性化，再通過K1enow片段將酶切的線性載體末端補平方法2：利用產生平末端的限制性內切核酸酶酶切產生平末端，最后將線性化鈍末端質粒載體加T反應形成。目前有很多公司推出了TA質粒載體。噬菌體載體噬菌體載體分類插入式載體一種只具有一個可供外源DNA插入的克隆位點的派生載體噬菌體載體相對于質粒載體來說，克隆片段較大，所以一般用于cDNA文庫或基因組文庫的構建。 cI基因插入失活：如 gt10、NM1149等載體，在cI基因上有EcoR I及Hind III的酶切位點。外源基因插入后將導致cI基因的失活。cI基因失活后將導致

14、噬菌體不能溶原化，產生清晰的噬菌斑。相反，產生混濁的噬菌斑。 Lac Z基因插入失活：如charon16A載體，在非必須區段引入lac Z基因，在lac Z基因上有EcoR I位點，插入失活后利用X-gal法篩選（藍白篩選）置換型載體（取代型載體）具有成對的克隆位點，在這 兩個位點之間的DNA區段可以被外源DNA 片段所取代。野生型噬菌體染色體的中段對于噬菌體的感染和復制是非必要的，外源DNA可以取代這一片段這些載體是用Lac 5 替換入噬菌體的中間區段，同時將Lac 5 作為選擇標記使用時用EcoRI水解，去掉中間的片段，再與欲克隆片段在體外進行重組、包裝。而后，感染E.coli使之在E.c

15、oli內繁殖，并裂解E.coli，形成空斑。置換型噬菌體是使用最廣泛的載體。人工染色體類別元件優點酵母人工染色體載體YAC是最常用來克隆很大DNA片段（2Mb）的系統。為構建YAC需要結合四個短序列：即二個端粒、一個著絲粒和一個ARS元件，并將一適當大小的外源DNA連接成一線性DNA分子，而端粒序列位于正確的末端。 YAC的構建有比在細菌中克隆的一些優點，因為某些真核細胞的序列，特別是重復序列是難以甚至不可能在細菌中繁殖的，酵母細胞卻具有這樣的能力細菌人工染色體載體 BAC是基于大腸桿菌的 F 質粒構建的，高通量低拷貝的質粒載體每個環狀 DNA 分子中攜帶一個抗生素抗性標記，一個來源于大腸桿菌

16、 F 因子（致育因子）的嚴謹型控制的復制子 oriS （ Shizuya et al. 1992 ），一個易于 DNA 復制的由 ATP 驅動的解旋酶（ （RepE） 以及三個確保低拷貝質粒精確分配至子代細胞的基因座 （ parA , parB , 和 parC ）以大腸桿菌為寄主，轉化率高，構建BAC文庫比YAC文庫更容易；BAC載體以環型超螺旋狀態存在，從大腸桿菌中提取質粒較方便，而從酵母中分離DNA較困難； BAC的復制子來源于F因子，可穩定遺傳，嵌合及重組現象少；可以通過菌落原位雜交來篩選目的基因，方便快捷；BAC載體在克隆位點的兩側具有T7和Sp6聚合酶啟動子，可以用于轉錄獲得RNA

17、探針或直接用于插入片段的末端測序。表達載體分類結構組成及表達元件特點或優點備注質粒表達載體原核表達載體1啟動子、2轉錄終止子（防止克隆的外源基因表達干擾載體的穩定性）3核糖體結合位點表達方式有：組成型表達，誘導型表達。 融合型表達， 分泌型表達。啟動子類型：根據作用方式及功能分類組成型啟動子組織特異啟動子又稱器官特異性啟動子。誘導型啟動子酵母表達載體來自pBR322基本骨架 含有該質粒復制起始位點(ori)，lacZ基因、bla或ampr、tetr等基因。含有URA3、HIS3、LEU2、TRPl、LYS2與特定的宿主營養缺陷突變體互補篩選或利用zeocin、basticidin（殺稻瘟菌素）

18、的抗性基因篩選。啟動子有GAP、AOXl、AUGl和GAL1等。 GAP是組成型啟動子。其余是誘導型啟動子。酵母表達載體多為穿梭載體：既可以在大腸桿菌中繁殖，獲得足夠的載體DNA進行體外操作，又可以在酵母中復制、表達和選擇。融合蛋白表達載體：于外源基因插入位點的C端或N端插入了1個6×His標簽，或在5端插入了-因子作為分泌信號由于原核生物和真核生物存在糖基化、酰基化等翻譯后修飾反應機制的差異，真核基因的原核表達難以獲得有活性的蛋白。酵母成為真核表達的首選系統。Ti質粒表達載體一元載體 一元載體就是含目的基因的中間表達載體與改造后的受體(Ti質粒)通過同源重組所產生的一種復合型載體，

19、也稱為共整合載體。由于該載體的T-DNA區與Vir區緊密連鎖，也稱為順式載體(cis-vector)Ti質粒是根癌農桿菌中發現的可引發植物產生冠癭瘤的質粒。根據冠癭瘤合成的冠癭堿種類，Ti質粒可分為章魚堿、農桿堿、農桿菌素和琥珀堿4種不同類型Ti質粒可分為T-DNA、Vir、Con和Ori 4個功能區。T-DNA區 是Ti質粒中能轉移到植物細胞內的區域。Vir區 位于T-DNA區的上游，其表達產物可激活T-DNA向植物細胞的轉移，這一個區域也稱為致病區。Con區 該區含有與農桿菌之間接合轉移有關的基因(tra)，這些基因受宿主細胞合成的冠癭堿激活，使Ti質粒在細菌之間轉移。Ori區 調控Ti質

20、粒的自我復制，為復制起始區構建的基本原理： 引入分子質量較小的中間載體，將欲轉化的目的基因及抗性標記基因構建到中間載體上。 將Ti質粒上T-DNA的致瘤基因全部去掉，僅保留其兩邊界及與T-DNA轉移所必需的25個堿基序列，構建成所謂卸甲載體。在卸甲載體的T-DNA區被刪除致瘤基因位點插入中間載體同源的質粒序列，將中間載體轉入含有卸甲載體的根癌農桿菌中，構建在中間載體上目的基因可通過同源重組整合到卸甲載體Ti質粒的T-DNA區，并與卸甲載體Ti質粒一起復制。二元載體 雙元表達載體系統主要包括兩個部分：一部分為卸甲Ti質粒，這類Ti質粒由于缺失了TDNA 區域，完全喪失了致瘤作用，主要是提供Vir

21、基因功能，激活處于反式位置上的TDNA的轉移。另一部份是微型Ti質粒，它在TDNA左右邊界序列之間提供植株選擇標記如NPTII基因以及Lac Z基因等。 雙元載體系統的構建的原理是Ti質粒上的Vir基因可以反式激活TDNA 的轉移。 與共整合載體所不同的是，它不依賴兩個質粒之間的同源序列，不需要共整合過程就能在農桿菌內獨立復制雙元表達載體構件方便，轉化效率高于一元載體。病毒表達載體桿狀病毒表達載體桿狀病毒表達系統的基本元件： (1)啟動子：多個啟動子同時表達多個外源基因。(2)poly A加尾信號： (3)同源重組序列。 (4)穿梭載體必需元件。除帶有病毒自身的復制起始位點外，還帶有pUC質粒

22、的復制子及以ampr，可以在細菌內進行擴增。(5)篩選標記。重組蛋白具有完整的生物學功能：接近天然蛋白。能進行翻譯后的加工修飾：研究糖基化對蛋白質結構與功能影響方面的理想模型。表達水平高：最高可使目的蛋白的量達到細胞總蛋白的50。能容納大分子的插入片段：上限未知。能同時表達多個基因：在同一細胞內同時表達多個基因。能表達基因組DNA：昆蟲桿狀病毒表達系統具有剪切的功能。對重組蛋白進行定位的功能：如將核蛋白轉送到細胞核上，膜蛋白則定位在膜上，分泌蛋白則可分泌到細胞外等。桿狀病毒科病毒，桿狀病毒顆粒，雙鏈閉合環狀DNA病毒，專一性感染無脊椎動物將外源基因先克隆到轉移載體上，再與病毒基因組共同轉染細胞

23、，通過細胞內的同源重組獲得帶有外源基因的重組病毒的策略。 腺病毒載體腺病毒DNA末端結構突出特點 1）帶有100bp反向的末端重復序列(ITR)，而且在每一條單鏈的5-末端還共價地連接著末端結合蛋白，對病毒的復制有重要作用。2）當它從病毒顆粒中分離出來之時，便會自發地環化起來，爾后許多環形分子又聚合成多聚體腺病毒載體是目前最為廣泛應用的基因載體，也是唯一基因藥物的載體雙鏈DNA的分子大小約為36kb.可應用于1.基因治療2.表達真核基因3.研制疫苗首先構建一個含多克隆位點和篩選標志的轉移質粒，該質粒含有病毒基因組某段早期序列；然后將一個含有啟動子一外源基因-poly A的表達盒插入到上述質粒中

24、腺病毒E1、E3或E4至右側的ITR區之間，構建成載有外源基因的穿梭質粒。反轉錄病毒載體泡沫病毒類從5端開始依次是：5長末端重復序列(5-LTR)，帶有增強子和啟動子序列；psi序列，又稱序列，是病毒包裝所必須的信號序列；gag，編碼病毒衣殼蛋白；pol，編碼反轉錄酶和整合酶(Int)；env，編碼病毒顆粒外層包裝蛋白；3長末端重復序列(3-LTR)，帶有poly A加尾信號序列。一類含單鏈RNA的動物病毒。它的基因組含有2條相同的正鏈RNA分子，包裝成二倍體病毒顆粒。（1）在大多數情況下，反轉錄病毒的腫瘤基因(onc)都能夠在正常的細胞中轉錄。 2）反轉錄病毒的寄主范圍相當廣，包括無脊椎動物

25、和脊椎動物。3）反轉錄病毒具有強啟動子，外源基因可得到有效表達。4）反轉錄病毒不但感染效率高，而且不招致寄主細胞的死亡載體的構建:分離原病毒DNA刪去部分序列組入選擇性標記基因、目的基因和調控元件克隆到含有大腸桿菌復制起始位點的克隆載體轉化大腸桿菌獲得反轉錄病毒克隆載體 輔助細胞系(包裝細胞系) 擴增慢病毒類致癌病毒類SV40病毒型轉化載體根據SV40 DNA進入敏感動物細胞的轉方向，分為早期轉錄區和晚期轉錄區。早期轉錄區包括與病毒感染相關的t抗原基因(small T-antigen)和T抗原基因(large T-antigen)等；含有BamHI等限制性內切核酸酶識別位點；晚期轉錄區包括與病毒殼蛋白合成相關的基因，含有EcoRi等限制性內切核酸酶識別位點。含有能夠被真核細胞識別的有效的啟動子。有許多種動物病毒，在其感染周期中都能夠持續地復制，使其基因組拷貝數達到相當高的水平。有些動物病毒具有控制自己復制的順式元件和反式作用因子。有些動物病毒，在它們的復制過程中能高效穩定地整合到寄主核基因組上。病毒的外殼蛋白質能夠識別細胞接受器。用病毒外殼蛋白質包裝重組質粒DNA形成的假病毒顆粒