1、液相色譜基本原理液相色譜基本原理陜西科儀科技有限公司陜西科儀科技有限公司一、概論 一、液相色譜理論發展簡況一、液相色譜理論發展簡況 色譜法的分離原理是：溶于流動相(mobile phase)中的各組分經過固定相時，由于與固定相(stationary phase)發生作用（吸附、分配、離子吸引、排阻、親和）的大小、強弱不同，在固定相中滯留時間不同，從而先后從固定相中流出。又稱為色層法、層析法。 色譜法最早是由俄國植物學家茨維特（Tswett）在1906年研究用碳酸鈣分離植物色素時發現的，色譜法(Chromatography)因之得名。后來在此基礎上發展出紙色譜法、薄層色譜法、氣相色譜法、液相色譜

2、法。二、基本原理 液相色譜法開始階段是用大直徑的玻璃管柱在室溫和常壓下用液位差輸送流動相，稱為經典液相色譜法，此方法柱效低、時間長（常有幾個小時）。高效液相色譜法(High performance Liquid Chromatography，HPLC)是在經典液相色譜法的基礎上，于60年代后期引入了氣相色譜理論而迅速發展起來的。它與經典液相色譜法的區別是填料顆粒小而均勻，小顆粒具有高柱效，但會引起高阻力，需用高壓輸送流動相，故又稱高壓液相色譜法(High Pressure Liquid Chromatography，HPLC)。又因分析速度快而稱為高速液相色譜法(High Speed Liqu

3、id Chromatography，HSLP)。也稱現代液相色譜。 色譜法分類色譜法分類 按兩相的物理狀態可分為：氣相色譜法(GC)和液相色譜法(LC)。氣相色譜法適用于分離揮發性化合物。GC根據固定相不同又可分為氣固色譜法(GSC)和氣液色譜法(GLC)，其中以GLC應用最廣。液相色譜法適用于分離低揮發性或非揮發性、熱穩定性差的物質。LC同樣可分為液固色譜法(LSC)和液液色譜法(LLC)。此外還有超臨界流體色譜法(SFC)，它以超臨界流體（界于氣體和液體之間的一種物相）為流動相（常用CO2），因其擴散系數大，能很快達到平衡，故分析時間短，特別適用于手性化合物的拆分。 按原理分為吸附色譜法(

4、AC)、分配色譜法(DC)、離子交換色譜法(IEC)、排阻色譜法(EC，又稱分子篩、凝膠過濾(GFC)、凝膠滲透色譜法(GPC）和親和色譜法。（此外還有電泳。） 按操作形式可分為紙色譜法(PC)、薄層色譜法(TLC)、柱色譜法。色譜液相色譜柱色譜紙色譜薄層色譜高高效效液液相相色色譜譜H HP PL LC C氣相色譜 四、色譜分離原理四、色譜分離原理 高效液相色譜法按分離機制的不同分為液固吸附色譜法、液液分配色譜法（正相與反相）、離子交換色譜法、離子對色譜法及分子排阻色譜法。 1液固色譜法液固色譜法使用固體吸附劑，被分離組分在色譜柱上分離原理是根據固定相對組分吸附力大小不同而分離。分離過程是一個

5、吸附解吸附吸附解吸附的平衡過程。常用的吸附劑為硅膠或氧化鋁，粒度510m。適用于分離分子量2001000的組分，大多數用于非離子型化合物，離子型化合物易產生拖尾。常用于分離同分異構體。 2液液色譜法液液色譜法使用將特定的液態物質涂于擔體表面，或化學鍵合于擔體表面而形成的固定相，分離原理是根據被分離的組分在流動相和固定相中溶解度不同而分離。分離過程是一個分配平衡分配平衡過程。 涂布式固定相應具有良好的惰性；流動相必須預先用固定相飽和，以減少固定相從擔體表面流失；溫度的變化和不同批號流動相的區別常引起柱子的變化；另外在流動相中存在的固定相也使樣品的分離和收集復雜化。由于涂布式固定相很難避免固定液流

6、失，現在已很少采用。現在多采用的是化學鍵合固定相，如C18、C8、氨基柱、氰基柱和苯基柱。 液液色譜法按固定相和流動相的極性不同可分為正相色譜法(NPC)和反相色譜法(RPC)。 正相色譜法正相色譜法采用極性固定相（如聚乙二醇、氨基與腈基鍵合相）；流動相為相對非極性的疏水性溶劑（烷烴類如正已烷、環已烷），常加入乙醇、異丙醇、四氫呋喃、三氯甲烷等以調節組分的保留時間。常用于分離中等極性和極性較強的化合物（如酚類、胺類、羰基類及氨基酸類等）。 反相色譜法反相色譜法一般用非極性固定相（如C18、C8）；流動相為水或緩沖液，常加入甲醇、乙腈、異丙醇、丙酮、四氫呋喃等與水互溶的有機溶劑以調節保留時間。適

7、用于分離非極性和極性較弱的化合物。RPC在現代液相色譜中應用最為廣泛，據統計，它占整個HPLC應用的80%左右。 隨著柱填料的快速發展，反相色譜法的應用范圍逐漸擴大，現已應用于某些無機樣品或易解離樣品的分析。為控制樣品在分析過程的解離，常用緩沖液控制流動相的pH值。但需要注意的是，C18和C8使用的pH值通常為2.57.5（28），太高的pH值會使硅膠溶解，太低的pH值會使鍵合的烷基脫落。有新商品柱可在pH 1.512范圍操作。 3離子交換色譜法離子交換色譜法固定相是離子交換樹脂，常用苯乙烯與二乙烯交聯形成的聚合物骨架，在表面未端芳環上接上羧基、磺酸基（稱陽離子交換樹脂）或季氨基（陰離子交換樹

8、脂）。被分離組分在色譜柱上分離原理是樹脂上可電離離子與流動相中具有相同電荷的離子及被測組分的離子進行可逆交換可逆交換，根據各離子與離子交換基團具有不同的電荷吸引力而分離。 緩沖液常用作離子交換色譜的流動相。被分離組分在離子交換柱中的保留時間除跟組分離子與樹脂上的離子交換基團作用強弱有關外，它還受流動相的pH值和離子強度影響。pH值可改變化合物的解離程度，進而影響其與固定相的作用。流動相的鹽濃度大，則離子強度高，不利于樣品的解離，導致樣品較快流出。離子交換色譜法主要用于分析有機酸、氨基酸、多肽及核酸。 4離子對色譜法離子對色譜法又稱偶離子色譜法，是液液色譜法的分支。它是根據被測組分離子與離子對試

9、劑離子形成中性的離子對化合物后，在非極性固定相中溶解度增大，從而使其分離效果改善。主要用于分析離子強度大的酸堿物質。 分析堿性物質常用的離子對試劑為烷基磺酸鹽，如戊烷磺酸鈉、辛烷磺酸鈉等。另外高氯酸、三氟乙酸也可與多種堿性樣品形成很強的離子對。 分析酸性物質常用四丁基季銨鹽，如四丁基溴化銨、四丁基銨磷酸鹽。 離子對色譜法常用ODS柱（即C18），流動相為甲醇-水或乙腈-水，水中加入310 mmol/L的離子對試劑，在一定的pH值范圍內進行分離。被測組分保時間與離子對性質、濃度、流動相組成及其pH值、離子強度有關。 5排阻色譜法排阻色譜法固定相是有一定孔徑的多孔性填料，流動相是可以溶解樣品的溶劑

10、。小分子量的化合物可以進入孔中，滯留時間長；大分子量的化合物不能進入孔中，直接隨流動相流出。它利用分子篩對分子量大小不同的各組分排阻能力排阻能力的差異而完成分離。常用于分離高分子化合物，如組織提取物、多肽、蛋白質、核酸等被分離組分在柱中的洗脫原理 二、二、HPLC的特點和優點的特點和優點HPLC有以下特點：高壓壓力可達150300 Kg/cm2。色譜柱每米降壓為75 Kg/cm2以上。高速流速為0.110.0 ml/min。高效可達5000塔板每米。在一根柱中同時分離成份可達100種。高靈敏度紫外檢測器靈敏度可達0.01ng。同時消耗樣品少。HPLC與經典液相色譜相比有以下優點：速度快通常分析

11、一個樣品在1530 min，有些樣品甚至在5 min內即可完成。分辨率高可選擇固定相和流動相以達到最佳分離效果。靈敏度高紫外檢測器可達0.01ng，熒光和電化學檢測器可達0.1pg。柱子可反復使用用一根色譜柱可分離不同的化合物。樣品量少，容易回收樣品經過色譜柱后不被破壞*，可以收集單一組分或做制備。三、高效液相色譜儀 高效液相色譜儀由 高壓輸液系統、進樣系統、分高壓輸液系統、進樣系統、分離系統、檢測系統、數據處理系統離系統、檢測系統、數據處理系統 等五大部分組成。見下圖 分析前，選擇適當的色譜柱和流動相，開泵，沖洗柱子，待柱子達到平衡而且基線平直后，用微量注射器把樣品注入進樣口，流動相把試樣帶

12、入色譜柱進行分離，分離后的組分依次流入檢測器的流通池，最后和洗脫液一起排入流出物收集器。當有樣品組分流過流通池時，檢測器把組分濃度轉變成電信號，經過放大，用記錄器記錄下來就得到色譜圖。色譜圖是定性、定量和評價柱效高低的依據。一、高壓輸液系統 高壓輸液系統由 溶劑貯存器、高壓泵、梯度洗脫溶劑貯存器、高壓泵、梯度洗脫裝置和壓力表裝置和壓力表 等組成。 1. 1.溶劑貯存器溶劑貯存器 溶劑貯存器一般由玻璃、不銹鋼或氟塑料制成，容量為1到2 L，用來貯存足夠數量、符合要求的流動相。 2. 2.高壓輸液泵高壓輸液泵 高壓輸液泵是高效液相色譜儀中關鍵部件之一，其功能是 將溶劑貯存器中的流動將溶劑貯存器中的

13、流動相以高壓形式連續不斷地送入液路系統，使樣品相以高壓形式連續不斷地送入液路系統，使樣品在色譜柱中完成分離過程在色譜柱中完成分離過程。由于液相色譜儀所用色譜柱徑較細，所填固定相粒度很小，因此，對流動相的阻力較大，為了使流動相能較快地流過色譜柱，就需要高壓泵注入流動相。 對泵的要求：輸出壓力高、流量范圍大、流量恒定、無脈動，流量精度和重復性為0.5%左右。此外，還應耐腐蝕，密封性好。 高壓輸液泵，按其性質可分為恒壓泵恒壓泵和恒流泵恒流泵兩大類。 恒流泵是能給出恒定流量的泵，其流量與流動相粘度和柱滲透無關。 恒壓泵是保持輸出壓力恒定，而流量隨外界阻力變化而變化，如果系統阻力不發生變化，恒壓泵就能提

14、供恒定的流量。目前恒流泵正逐漸取代恒壓泵。恒流泵又稱機械泵，它又分機械注射泵和機械往復泵兩種，應用最多的是機械往復泵。3. 3. 梯度洗脫裝置梯度洗脫裝置 梯度洗脫梯度洗脫就是在分離過程中使兩種或兩種以上不同極性的溶劑按一定程序連續改變它們之間的比例，從而使流動相的強度、極性、pH值或離子強度相應地變化，達到提高分離效果，縮短分析時間的目的。 梯度洗脫裝置分為兩類： 一類是外梯度裝置外梯度裝置（又稱低壓梯度），流動相在常溫常壓下混合，用高壓泵壓至柱系統，僅需一臺泵即可。 另一類是內梯度裝置內梯度裝置（又稱高壓梯度），將兩種溶劑分別用泵增壓后，按電器部件設置的程序，注入梯度混合室混合，再輸至柱系

15、統。 梯度洗脫的實質梯度洗脫的實質是通過不斷地變化流動相的強度，來調整混合樣品中各組分的k值，使所有譜帶都以最佳平均k值通過色譜柱。它在液相色譜中所起的作用相當于氣相色譜中的程序升溫，所不同的是，在梯度洗脫中溶質k值的變化是通過溶質的極性、pH值和離子強度來實現的，而不是借改變溫度（溫度程序）來達到。二、進樣系統二、進樣系統 進樣系統包括進樣口、注射器和進樣閥等，它的作用是把分析試樣有效地送入色譜柱上進行分離。進樣裝置要求：密封性好，死體積小，重復性好，保證中心進樣，進樣時對色譜系統的壓力、流量影響小。HPLC進樣主要方式可分為：閥進樣（手動）、自動進樣。 三、分離系統三、分離系統 分離系統包

16、括色譜柱、恒溫器和連接管等部件。色譜柱一般用內部拋光的不銹鋼制成。其內徑為2 6mm，柱長為10 50cm，柱形多為直形，內部充滿微粒固定相。柱溫一般為室溫或接近室溫。 色譜柱是液相色譜的心臟部件，它包括柱管與固定相兩部分。柱管材料有玻璃、不銹鋼、鋁、銅及內襯光滑的聚合材料的其他金屬。玻璃管耐壓有限，故金屬管用得較多。一般色譜柱長530cm，內徑為45mm，凝膠色譜柱內徑312mm，制備往內徑較大，可達25mm 以上。一般在分離前備有一個保護柱，保護柱內填充物和分離柱完全一樣，這樣可使流動相由于經過保護柱為其中的固定相飽和，使它在流過分離柱時不再洗脫其中固定相，保證分離技的性能不受影響。四、檢測器四、檢測器 檢測器是液相色譜儀的關鍵部件之一。對檢測器的要求是：靈敏度高，重復性好、線性范圍寬、靈敏度高，重復性好、線性范圍寬、死體積小以及對溫度和流量的變化不敏感等死體積小以及對溫度和流量的變化不敏感等。 在液相色譜中，有兩種類型的檢測器，一類是溶質性檢測器溶質性檢測器，它僅對被分離組分的物理或物理化學特性有響應。屬于此類檢測器的有紫外、熒光、