1、擬南芥擬南芥T-DNA插入突變體的鑒定插入突變體的鑒定 實驗目的實驗目的1熟練掌握植物基因組DNA快速提取的方法；2掌握利用PCR方法鑒定擬南芥T-DNA插入突變體的方法。 T-DNA插入鑒定的原理突變體鑒定的步驟1. T-DNA插入基因的基因組序列；2. T-DNA插入方向的確定；3. T-DNA插入位置的確定；4. 引物設計；5. PCR擴增；6. 電泳檢測。T-DNA插入基因的基因組序列點擊基因編號進入網頁點擊sequence viewer進入http:/www.arabidopsis.o

2、rg點擊nucleotide view進入 點擊突變體編號后進入的網頁進入網站進入網站/cgi-bin/tdnaexpress查找基因突變體及插入方向查找基因突變體及插入方向基因方向T-DNA方向5引物3引物實驗設計引物設計 基因上面引物的設計可以通過下面提供的擬南芥網站/tdnaprimers.html進行自動生成，也可以根據自己的需要進行設計。一般進行鑒定的引物距離T-DNA插入的位置300bp以上為宜，即3

3、00+N bp。 LBa1 of pBIN-pROK2 for SALK lines：TGGTTCACGTAGTGGGCCATCG 植物基因組DNA的快速提取 （1）取植物葉片（擬南芥一片葉子），置于1.5ml離心管中，加入400 ml提取緩沖液；（2）用研磨棒研磨植物材料，直至緩沖液變為綠色；（3）在臺式離心機上13000 rpm離心5分鐘；（4）離心后將上清300 ml轉移至一個新的1.5 ml離心管中；（5）在上清中加入300 ml異丙醇，混勻后于室溫下13000 rpm條件下，離心5分鐘；（6）棄上清后，用70%乙醇潤洗沉淀，并在室溫下干燥沉淀；（7）100 ml TE溶解沉淀，將制備

4、好的樣品在4保存備用。（此方法提取的基因組（此方法提取的基因組DNA只適用于只適用于PCR的鑒定，不適合酶切和大片段基因的擴增）的鑒定，不適合酶切和大片段基因的擴增）PCR鑒定 30ml反應體系： 2ml 植物基因組DNA樣品 3ml 10擴增緩沖液 0.5ml Taqase （5U/ml） 0.5 ml dNTP（10 mmol/L） 1ml 引物1（10 mmol/L） 1ml 引物2（10 mmol/L） 用無菌水補足體積。PCR反應條件94 3min30循環（94/1min，55/1min，72/1min）； 72 延伸10min。注：反應條件需根據所要擴增產物的大小和引物的性質進行合

5、適的調整。PCR安排安排每小組四個PCR反應，引物和DNA模板分別如下： 1.WT基因組模板2個PCR反應：引物分別為基因自身的5和3端引物；5引物和LBa引物。2.突變體基因組為模板2個PCR反應：引物分別為基因自身的5和3端引物；5引物和LBa引物。046號突變體的鑒定（號突變體的鑒定（1-6組）組） 30m ml反應體系反應體系1： 2 ml 植物基因組DNA樣品（WT） 3 ml 10擴增緩沖液 0.5 ml Taqase （5U/ml） 0.5 ml dNTP（10mmol/L） 1 ml 046 5引物（10mmol/L） 1 ml 0463引物（10mmol/L） 30m ml反

6、應體系反應體系2： 2 ml 植物基因組DNA樣品WT 3 ml 10擴增緩沖液 0.5 ml Taqase （5U/ml） 0.5 ml dNTP（10 mmol/L） 1 ml 046 5引物（10 mmol/L） 1 ml LBa 引物（10 mmol/L） 30m ml反應體系反應體系3： 2 ml 植物基因組DNA樣品（111） 3 ml 10擴增緩沖液 0.5 ml Taqase （5U/ml） 0.5 ml dNTP（10mmol/L） 1 ml 046 5引物（10mmol/L） 1 ml 0463引物（10mmol/L） 30m ml反應體系反應體系4： 2 ml 植物基因組

7、DNA樣品（111） 3 ml 10擴增緩沖液 0.5 ml Taqase （5U/ml） 0.5 ml dNTP（10 mmol/L） 1 ml 046 5引物（10 mmol/L） 1 ml LBa 引物（10 mmol/L） 135號突變體的鑒定（號突變體的鑒定（7-11組）組） 30m ml反應體系反應體系1： 2ml 植物基因組DNA樣品（WT） 3ml 10擴增緩沖液 0.5 ml Taqase （5U/ml） 0.5 ml dNTP（10 mmol/L） 1ml 135 5引物（10 mmol/L） 1ml 135 3引物（10 mmol/L） 30m ml反應體系反應體系2：

8、2ml 植物基因組DNA樣品（WT） 3ml 10擴增緩沖液 0.5 ml Taqase （5U/ml） 0.5 ml dNTP（10 mmol/L） 1ml 135 3引物（10 mmol/L） 1ml LBa 引物（10 mmol/L） 30m ml反應體系反應體系3： 2ml 植物基因組DNA樣品（111） 3ml 10擴增緩沖液 0.5 ml Taqase （5U/ml） 0.5 ml dNTP（10 mmol/L） 1ml 135 5引物（10 mmol/L） 1ml 135 3引物（10 mmol/L） 30m ml反應體系反應體系4： 2ml 植物基因組DNA樣品（111） 3ml 10擴增