1、第8章菌種退化與保藏 第一節菌種的退化與防止 一、菌種退化(degeneration) 生產菌種或優良菌種由于傳代或保藏之后，群體中的某些生理特性或形態特征減退或消失。二、菌種退化的原因 1、基因突變是主要原因 2、連續傳代是加速退化的直接原因 3、培養條件和保藏條件有多方面的影響 (1)不同環境條件 (2)培養基 (3)培養條件 (4)保藏條件三、菌種退化的防止 1、減少傳代 2、用單核細胞和單菌落傳代 3、經常進行菌種純化 4、采用良好的培養基和培養條件 5、科學的保藏方法四、菌種復壯 1、菌種復壯：通過自然分離的方法將那些尚未棄衰退的細胞從群體中分離出來，使菌種的優良性壯得以恢復。是一種

2、消極的措施。 2、積極措施：在尚未退化前，經常進行自然分離。第二節 工業微生物菌種保藏技術 在生產發酵中，具有高產有重要經濟價值的某一期待代謝產物主能力的微生物菌種的保存和長期保藏，對于一成功的工業發酵過程極為重要。一、保藏方法應具備的條件(1) 經長期保藏后菌種存活健在；(2) 保證高產突變株不改變表型和基因型，特別是不改變初級代謝產物和次級代謝產物生產的高產能力。(3)菌種保藏的基本措施是低溫、干燥、真空。二、工業微生物菌種保藏技術 (1)冷凍干燥或真空干燥保藏； (2)超低溫或在液氮中冷凍保藏； (3) 轉接培養或斜面傳代保藏； (4)土壤或陶瓷珠等載體干燥保藏。2.12.1 冷凍保藏

3、冷凍保藏為保藏微生物菌種的最簡單而有效的方法。 通過冷凍，使微生物代謝活動停止。一般而言，冷凍溫度愈低，效果愈好。為了獲得滿意的冷凍結果，通常應在培養物中加入一定的冷凍保護劑。冷凍保藏時溫度要求在-20以下，同時應認真掌握好冷凍速度和解凍速變。 冷凍深藏的缺點之一是培養物運輸較困難。冷凍保藏種類 1、普通冷凍保藏技術(-20)2、超低溫冷凍保藏技術(-60一-80)3 3、液氮冷凍保藏技術 1 1、普通冷凍保藏技術(-20)(-20) 將液體培養物或從瓊脂斜面培養物收獲的細胞分接到試管或指管內，然后貯藏于冰箱的冷藏室中，或于溫度范圍在-5-5-20-20的普通冰箱(-20)(-20)中?；蛘?，

4、將菌種培養在小的試管或培養瓶斜面上，待生長適度后，將試管或瓶口用橡膠塞嚴格封好，同上置于冰箱中保存。 用此方法可以維持若干微生物的活力1 12 2年。注意！ 應注意的是經過一次解凍的菌株培養物不宜再用來保藏。 保藏過程中應注意控制保藏溫度，培養瓶或試管應嚴格密封。 這一方法雖簡便易行，但不適宜多數微生物的長期保藏。2 2、超低溫冷凍保藏技術 (-60(-60至-80)-80) 要求長期保藏的微生物菌種，一般都要求在-60以下進行保藏。 在超低溫冷藏柜中保藏菌種的一般方法： 1離心收獲對數生長中期至后期的微生物細胞； 2用新鮮培養基重新懸浮所收獲的細胞； 3加入等體積的20甘油或10二甲亞砜；

5、4混勻后分裝入冷凍指管或安瓿中，于-70超低溫冰箱中保藏。 如果待保藏菌種生長在斜面上，則可用含1010甘油的新配制液體培養基洗滌收獲。超低溫冰箱的冷凍速度一般控制在1-21-2minmin。干細菌和真菌菌種可通過此保藏方法保藏5 5年而活力不受影響。3 3、液氮冷凍保藏技術 (1) 冷凍保護劑 在液氮冷凍保藏中，最常用的冷凍保護劑是二甲亞砜和甘油，最終使用濃度一般為甘油10、二甲亞砜5。所使用的甘油般用高壓蒸汽滅菌，而二甲亞砜最好為過濾滅菌。 (2)(2)液氮冷凍保藏微生物菌種的步驟 1 1待冷凍保藏菌種懸液的制備 (1)(1)從生長斜面制備菌懸液：每一斜面加入5ml5ml含1010甘油的營

6、養液體培養；用巴氏吸管吹吸斜面制成孢子及菌體細胞懸液；0.50.5lmllml分裝玻璃安瓿或液氮冷藏專用塑料瓶。 (2)(2)從浸沒培養物制備菌懸液： 在浸沒培養液中加入等體積20%20%無菌甘油；輕輕振蕩混勻培養液，如果菌體絮凝較緊，則需先用玻璃珠打散；0.5-lml0.5-lml分裝玻璃安瓿或液氮冷藏專用塑料瓶，玻璃安瓿用酒精噴燈封口；將所有封好的安瓿置于55冰箱中3min3min，以使細胞和懸浮培養基之間達到平衡。(1)(1)將安瓿或液氮瓶置于鋁盒或布袋中，然后置于一較大的金屬容器中；(2)(2)將此金屬容器置于控速冷凍機的冷凍室中；(3)(3)以1-2/min1-2/min的致冷速度降

7、溫，直到溫度達到相對溫度之上幾度的細胞凍結點( (通常為- -30)30)；(4)(4)補加一定量的液氮至系統中，使細胞在凍結點時盡可能快地發生相變； 2 2控速冷凍 (5)(5)細胞凍結后，將致冷速度降為1/min1/min，直到溫度達-50-50；(6)(6)將安瓿迅速移入液氮罐中于液相(-)96)(-)96)或氣相(-156)(-156)中保存。 如果無控速冷凍機，則一般可將安瓿或液氮瓶置于一7070冰箱中冷凍4h4h，然后迅速移入液氮罐中保存。1從液氮罐中取出所需的安瓿，立即置于冰浴中；2迅速將安瓿置于37-40水浴中，并輕輕搖動以加速解；3用巴氏吸管將安瓿中貯存培養物移接入含有2m1

8、無菌液體培養基的試管中，用同一支吸管反復抽吸數次，然后取0.1-0.2ml (約4、8滴)轉接入瓊脂斜面上。(三) 復蘇 2.22.2 凍干保藏 冷凍干燥的基本方法：是通過在減壓條件下使凍結的細胞懸液中的水分升華，使培養物干燥。此法是微生物菌種長期保藏的最為有效的方法之一。 冷凍干燥過程中必須使用冷凍保護劑，目前國內常用脫脂乳和蔗糖，國外尚有運用動物血清等的。 大部分微生物菌種可以在凍干狀態下保藏10年之久而不喪失活力。而且經凍干后的菌株無需進行冷凍保藏，便于運輸。培養物的凍干過程1 1啟動冷凍干燥器的致冷單元。當冷凝器的溫度達到-40-40時啟動真空泵，使真空度達到2.672.674.00P

9、a4.00Pa。2 2將冷凍槽置于歧管之下方。槽中裝入2 23 3體積的異丙醇，然后插入溫度計及可調溫控儀降溫探頭打開降溫探頭控制醇浴溫度在-40-40，這過程約需30min30min。( (二) )操作步驟3 3每支斜面加入2ml 202ml 20的脫脂乳，然后用巴氏吸管將斜面上的菌苔吹打下制成孢子或菌體均懸液，最終菌株濃度一般要求在10106 6CFUCFUm1m1用細菌浸沒培養物來保藏時，加入4040的脫脂乳，混合制成含10106 6CFUCFUmlml的均懸液。4 4取下安瓿上的棉塞，然后用lmllml移液管分裝安瓿(0.2ml(0.2ml瓿) )，重新塞好棉塞。5 5輕輕振蕩安瓿，以

10、使細胞重新懸浮。將安瓿與歧管相聯后迅速置于醇浴中，然后調節溫控裝置。使細胞懸液迅速凍結。6 615min15min后，將歧管與真空泵相通。7 7維持-40-40的醇浴溫度90-120min90-120min，然后調節溫控裝置。使醇浴溫度上升至-10-10，維持2h2h。8 8關掉可調溫控裝置的降溫探頭，讓醇浴溫度上升至室溫(25)(25)9 9在冷凍干燥的最初4h4h內應定期測真空度，在安瓿置于真空下后1 h1 h 內，真空度必須達到13.33Pa13.33Pa，并于菌懸液接近干燥時逐漸降到2.672.674.0Pa4.0Pa。10 10 在真空狀態下，讓安瓿保存在冷凍干燥機 中至少16h16

11、h以獲得完全干燥。1111干燥后，在2.672.674.00Pa4.00Pa的真空度下封瓶1212在所有安瓿都封蓋好后，撤去真空。1313關閉真空泵。1414關閉冷凝器。( (三) )凍干菌種的保藏與再生1 1保藏：冷凍干燥后的培養物在低于55下保藏。較低的保藏溫度(-20(-20-70)-70)對于培養物的長期穩定更好。2 2復蘇：(1)(1)在超凈工作臺中用7070酒精棉球擦洗安瓿，然后用砂輪在安瓿中銼一道溝。(2)(2)用無菌紗布或無菌毛巾包好安瓿，然后用手掰開安瓿(3)(3)在安瓿中加入0.50.51ml1ml營養液體培養基，慢慢旋轉安瓿，使凍干菌種復水。然后將此轉接到一含有再生培養基

12、的無菌試管中，或直接接種瓊脂斜面或涂布平板。(4)(4)在指管中凍干的菌種通常為絮粉狀，可以將此直接振落入盛有l l2ml2ml液體培養基的試管中，輕輕振蕩5 5l0minl0min，然后用此懸液接種適宜的再生培養基。2.3 2.3 其他保藏方法一、傳代保藏 二、礦物油中浸沒保藏 一、傳代保藏 將菌種定期在新鮮瓊脂培養基上傳代，然后在一定的生長溫度下生長和保存的傳代保藏方法。 可用于實驗室中若干菌種的保藏。 此法最為簡單和經濟，且不要求任何特殊的設備。 但此方法易發生培養基干枯、菌體自溶、基因突變。 因此要求在基本培養基上傳代為好，目的是能淘汰突變株；同時轉接菌量應保持較低水平。 斜面培養物應

13、在密閉容器中于55保藏，以防止培養基脫水并能降低代謝活性。 此方法一般不適宜作工業生產菌種的長期保藏方法。二、礦物油中浸沒保藏 將瓊脂斜面或液體培養物浸入礦物油中于室溫下保藏，此方法簡便有效。 可用于絲狀真菌、酵母、細菌和放線菌的保藏。特別對難于冷凍干燥的絲狀真菌和難以在固體培養基上形成孢子的擔子菌等的保藏更為有效。 浸沒保藏的操作要點是首先讓待保藏菌種在適宜的培養基上生長，然后注入經170下滅菌1-2h的礦物油，礦物油的用量以高出培養物1cm為宜。 以液體石蠟作為保藏方法時，應對需保藏的菌株預先作試驗。因為某些菌株在液體石蠟下生長還十分明顯，有些菌株如某些假絲酵母還會同化液體石蠟，也有的對液

14、體石蠟保藏敏感。所有這些菌株都不能用液體石蠟保藏。為了預防不測，一般保藏株23年也應做一次存活試驗。不同菌種保藏方法比較2.42.4 基因工程菌的保藏 由載體質粒等攜帶的外源DNA片段通常是遺傳不穩定的、且很易丟失其外源質粒復制子。質?；蛲ǔ樗拗骷毎L非必需。 一般情況下當細胞丟失這些質粒時，生長速度會加快。 當培養基中加入抗生素時，抗生素提供了一有利于攜帶質粒的細胞群體的極有用的生長選擇壓。而且在運用基因工程菌進行發酵時，抗生素的加入可幫助維持質粒復制與染色體復制的協調。 我們建議基因工程菌應保藏在含低濃度選擇劑的培養基中。2.5 2.5 微生物活力和穩定性測定 所有保藏菌種的方法都必

15、須是長期可靠地保持菌種的優良性狀不變。 在保藏時定期檢測菌種活力，以確定保藏培養物的保藏期限和保藏方法的可靠性，以及確定在實際保藏過程中出現的細胞死亡程度和遺傳穩定性。建 議！ 對工業微生物生產菌種來說，建議保藏菌種的形態學和生化特征( (如代謝產物的產生、酶活力、遺傳特征及生化指標) )應在保藏后加以檢測和確定。 加速保藏試驗可用于預測保藏過程中保藏培養物的穩定性。在一給定溫度下通過對高溫下短期活力喪失程度檢測，可以用來預測嗜酸乳桿菌的穩定性。 成功的菌種長期保藏方法之有價值的指標包括在保藏6個月、1年或更長時間后存活百分率(或存活單位)。細胞群體的形態學特征或一些特別的生化特征應在菌種保藏

16、前后保持同一性，以及實驗室中、中試車間中和生產發酵中產品滴度的穩定性，后者極為重要。冷凍保藏種類 1、普通冷凍保藏技術(-20)2、超低溫冷凍保藏技術(-60一-80)3 3、液氮冷凍保藏技術 2.22.2 凍干保藏 冷凍干燥的基本方法：是通過在減壓條件下使凍結的細胞懸液中的水分升華，使培養物干燥。此法是微生物菌種長期保藏的最為有效的方法之一。 冷凍干燥過程中必須使用冷凍保護劑，目前國內常用脫脂乳和蔗糖，國外尚有運用動物血清等的。 大部分微生物菌種可以在凍干狀態下保藏10年之久而不喪失活力。而且經凍干后的菌株無需進行冷凍保藏，便于運輸。10 10 在真空狀態下，讓安瓿保存在冷凍干燥機 中至少16h16h以獲得完全干燥。1111干燥后，在2.672.674.00Pa4.00Pa的真空度下封瓶1212在所有安瓿都封蓋好后，撤去真空。1313關閉真空泵。1414關閉冷凝器。 因此要求在基本培養基上傳代為好，目的是能淘汰突變株；同時轉接菌量應保持較低水平。 斜面培養