1、分類號(hào)：學(xué)校代碼：11460學(xué) 號(hào)：10220906南京曉莊學(xué)院本科生畢業(yè)論文海水脅迫對馬齒莧抗氧化及其光合生理特性的影響 Seawater Stress on Antioxidant purslane and Photosynthetic Physiological Characteristics所在系(院）：教師教育學(xué)院學(xué) 生 ：馬青云指導(dǎo)教師 ：張邊江 研究起止日期：二一三年九月至二一四年五月二一三年五月學(xué)位論文獨(dú)創(chuàng)性聲明本人鄭重聲明：1. 堅(jiān)持以“求實(shí)、創(chuàng)新”的科學(xué)精神從事研究工作。2. 本論文是我個(gè)人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行的研究工作和取得的研究成果。3. 本論文中除引文外，所有實(shí)驗(yàn)、數(shù)據(jù)和

2、有關(guān)材料均是真實(shí)的。4. 本論文中除引文和致謝的內(nèi)容外，不包含其他人或其它機(jī)構(gòu)已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果。5. 其他同志對本研究所做的貢獻(xiàn)均已在論文中作了聲明并表示了謝意。作者簽名：日 期：海水脅迫對馬齒莧抗氧化及其光合生理特性的影響作者：馬青云指導(dǎo)老師：張邊江 摘 要：本實(shí)驗(yàn)以馬齒莧為對象，通過模擬不同程度的海水脅迫試驗(yàn)，測定馬齒莧在不同海水濃度下的凈光合速率、蒸騰速率、氣孔導(dǎo)度、細(xì)胞間co2濃度以及熒光數(shù)據(jù)。旨在探究馬齒莧對海水脅迫的光合生理特性以及抗氧化酶活性的變化。本實(shí)驗(yàn)為鹽堿灘涂植物資源開發(fā)與利用提供參考。關(guān)鍵詞：馬齒莧；海水脅迫；抗氧化酶；光合生理特性目錄引言41 材料與方法51.

3、1 實(shí)驗(yàn)材料51.1.1 植物材料51.1.2 實(shí)驗(yàn)器材及工具51.1.3 實(shí)驗(yàn)試劑51.2 處理方法51.2.1 植物材料的處理51.3 生理生化指標(biāo)的測定51.3.1 抗氧化酶的測定51.3.2 可溶性蛋白含量的測定61.3.3 游離脯氨酸含量的測定61.3.4 可溶性糖含量的測定61.4 光合速率（Pn）、蒸騰速率（Tr）、氣孔導(dǎo)度（Gs）及胞間CO2濃度（Ci）測定61.5 數(shù)據(jù)分析72 結(jié)果與分析72.1馬齒莧的抗氧化酶活性72.2馬齒莧的可溶性蛋白含量92.3馬齒莧的游離脯氨酸含量92.4馬齒莧的可溶性糖含量102.5光合速率(Pn)、蒸騰速率（Tr）氣孔導(dǎo)度(Gs)及胞間CO2濃

4、度(Ci)的分析102.5.1 光合速率（Pn）的分析102.5.2 蒸騰速率（Tr）的分析112.5.3 氣孔導(dǎo)度（Gs）的分析112.5.4 胞間CO2濃度（Pn）的分析123討論參考文獻(xiàn) 馬齒莧為馬齒莧科一年生草本植物。肥厚多汁，無毛，高1030cm， 生于田野路邊及庭園廢墟等向陽處。國內(nèi)各地均有分布。該種為藥食兩用植物。全草供藥用，有清熱利濕、解毒消腫、消炎、止渴、利尿作用；種子明目?，F(xiàn)代研究，馬齒莧還含有豐富的SL3脂肪酸及維生素A樣物質(zhì)。SL3脂肪酸是形成細(xì)胞膜，尤其是腦細(xì)胞膜與眼細(xì)胞膜所必需的物質(zhì)；維生素A樣物質(zhì)能維持上皮組織如皮膚、角膜及結(jié)合膜的正常機(jī)能，參與視紫質(zhì)的合成，增強(qiáng)

5、視網(wǎng)膜感光性能，也參與體內(nèi)許多氧化過程。此外，馬齒莧還可作獸藥和農(nóng)藥；嫩莖葉可作蔬菜等。鹽脅迫是影響植物生長發(fā)育和農(nóng)作物產(chǎn)量和產(chǎn)值的主要環(huán)境脅迫因子之一，土壤鹽漬化和作物鹽害是世界性的問題1。鹽堿地在地球上廣泛分布，面積約占陸地的25%。我國的鹽堿地面積約有5億余畝即約2700 萬hm2，主要分布于長江以北的遼闊內(nèi)陸地區(qū)，以及遼東半島、渤海灣和蘇北濱海狹長的地帶，其中已開墾的約1億畝；但因灌溉不當(dāng)還造成了相當(dāng)一部分的次生鹽漬化土壤，約占耕地總面積的10%2。土壤鹽漬化嚴(yán)重影響著農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。要解決這一問題,除了土壤改良技術(shù)措施外,選育抗鹽的植物品種是一項(xiàng)具有長遠(yuǎn)經(jīng)濟(jì)效益的任務(wù)。因此深入研究植物的耐

6、鹽性,對減輕該地區(qū)土壤鹽漬化對作物栽培的影響,擴(kuò)大種植范圍,提高生產(chǎn)力,具有積極意義3。植物在逆境條件下，細(xì)胞代謝受阻而產(chǎn)生大量的超氧物陰離子自由基、羥基自由基、過氧化氫、脂質(zhì)過氧化物和單線態(tài)氧，即通常所說的活性氧4，這些活性氧會(huì)對細(xì)胞質(zhì)膜進(jìn)行過氧化，導(dǎo)致膜系統(tǒng)損傷和細(xì)胞傷害。在受到活性氧傷害后，植物會(huì)主動(dòng)或被動(dòng)地調(diào)動(dòng)抗氧化酶類及其它抗氧化物質(zhì)來清除這些活性氧和自由基，來減緩和抵御活性氧對細(xì)胞傷害。1 材料與方法1.1 實(shí)驗(yàn)材料 植物材料馬齒莧的葉片 實(shí)驗(yàn)器材及工具分光光度計(jì)、離心機(jī)、分析天平、托盤天平、研缽、恒溫水浴鍋。1.1.3 實(shí)驗(yàn)試劑考馬斯亮藍(lán)G-250、50 mmol·L-

7、1 pH7.18 磷酸緩沖液、95%乙醇、85% (m·v-1)磷酸、3%磺基水楊酸溶液、冰乙酸、2.5%酸性茚三酮溶液、甲苯、蒽酮乙酸乙酯、濃硫酸。濃度分別為0、5%、10%、20%、30%、50%、100%的海水溶液。1.2 處理方法植物材料的處理供試驗(yàn)馬齒莧為江蘇野生品種收集。種子用0.1%的HgCl2消毒10min并充分沖洗，然后用蒸餾水浸泡24h后播種于盛有蛭石的周轉(zhuǎn)箱中，每天澆水保持蛭石濕潤，自然光照。待種子萌發(fā)后選取2對葉完全展開的幼苗移栽到裝有石英砂下部有孔的塑料盆缽中。用50%Hoagland營養(yǎng)液澆灌，正常養(yǎng)護(hù)至4對葉完全展開后，選取長勢一致的幼苗開始用不同濃度的

8、海水處理，每盆定苗5株。重復(fù)7次，為期一周。1.3 生理生化指標(biāo)的測定1.3.1抗氧化酶的測定SOD、POD、CAT 活性和MDA含量測定，剪取處理后葉片，立即投入液氮中貯存。0.15 g 葉片加少許PVP冰浴研磨，提取緩沖液為50 mmol·L-1 pH7.18磷酸緩沖液，于4 下10000 r·min-1離心15 min，取上清液進(jìn)行指標(biāo)的測定。SOD活性測定按Giannopolitis等 5 的方法，以抑制氮藍(lán)四唑(NBT)光化還原的50 %為1個(gè)酶活性單位(U)，酶活性以每克鮮樣所含的酶活性單位 (U·g-1) 計(jì)。取試管先后分別加入1.5ml磷酸緩沖液（

9、0.05mol·L-1，pH7.8），0.3ml·L-Met（1.9399g Met用PBS定容至100ml），0.3ml NBT（0.06133g用PBS定容至100ml (避光保存)），0.3ml EDTA-Na2（0.03721g用PBS定容至1000ml），0.3ml核黃素(0.0753g用蒸餾水定容至1000ml (避光保存) )，0.05ml酶液，0.25ml蒸餾水。以加緩沖液、不照光為空白對照，照光后至顯藍(lán)色要立即避光放置、迅速測定A560值。POD 活性測定按Kochba等 6的方法。取兩只比色杯，一只中依次加入2ml 0.1mol·L-1的磷酸緩

10、沖液、1ml 0.25%愈創(chuàng)木酚溶液、1ml 酶液、0.1ml 0.75% H2O2溶液，迅速巔到混勻，另一只不加酶液為空白，把A470調(diào)零并開始計(jì)時(shí)，每30s 1次，連續(xù)讀取3min。CAT 活性測定按張憲政等 7的方法，先后加入50ul酶液，3ml 50mmol·L-1的PBS(pH7.0），0.2ml 0.3% H2O2迅速顛倒混勻，開始計(jì)時(shí)，以不加H2O2的50mmol·L-1的PBS（pH7.0）為空白，把A240調(diào)零，1min后在240nm下比色，每分鐘1次，連續(xù)讀取5min。MDA 含量測定按Heath等8的方法測定。先后加入1ml 酶液，3ml 0.5%TB

11、A和5%TCA，混合后在100度水浴煮沸15min，迅速冷卻，10000r·min-1離心10min，用蒸餾水調(diào)零分別測定上清液在532nm、450nm處的吸收值。計(jì)所有測定重復(fù)3次，用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。1.3.2 可溶性蛋白含量的測定取1ml酶液加入5ml蛋白試劑 (100mg 考馬斯亮藍(lán)G-250溶入50 ml 95%乙醇中，再加100ml 85% (m·v-1) 磷酸，混合后稀釋到1·L-1，過濾后備用 (呈棕色)。以1ml PH7.8磷酸緩沖液加入5ml蛋白試劑為對照，在595處比色。1.3.3游離脯氨酸含量的測定取新鮮葉片0.

12、1g，剪碎后放入試管中，加入5ml 3%磺基水楊酸溶液 (3g磺基水楊酸定溶至100ml)，于沸水浴中提取10min，冷卻至室溫，取提取液2ml于試管中，再加入2ml的水，2ml的冰乙酸和4ml 2.5%酸性茚三酮溶液 (以3：2的冰乙酸和6mol·L-1磷酸為溶劑進(jìn)行現(xiàn)配制) 置于沸水中顯色60min，冷卻后，加入4ml甲苯震蕩，靜置后，吸取甲苯層于520nm處比色。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線所得的回歸方程計(jì)算脯氨酸含量?？扇苄蕴呛康臏y定取新鮮馬齒莧葉片，擦凈表面污物，剪碎混勻，稱取0.100.30g，試管中，加入5-10mL 蒸餾水，塑料薄膜封口，于沸水中提取30min（提取2次），提取液過

13、濾入25mL容量瓶中，反復(fù)沖洗試管及殘?jiān)ㄈ葜量潭?。吸取樣品提取?.5mL于20mL試管中（重復(fù)2次），加蒸餾水1.5mL然后按順序向試管中加入0.5mL蒽酮乙酸乙酯試劑和5mL濃硫酸，充分振蕩，立即將試管放入沸水浴中，逐管準(zhǔn)確保溫1min取出后自然冷卻至室溫，在630nm處比色。1.4光合速率(Pn)、蒸騰速率（Tr）氣孔導(dǎo)度(Gs)及胞間CO2濃度(Ci)的測定光合氣體交換分析采用英國PPSyestm公司的Ciras-2型光合測定系統(tǒng)測定海蓬子的凈光合速率(Pn)、蒸騰速率（Tr）氣孔導(dǎo)度(Gs)和細(xì)胞間隙CO2濃度(Ci)。測定的條件為：大氣CO2濃度360±5mol

14、83;mol-1，濕度6070%，測定光強(qiáng)為1000mol·(m2s)-1。海蓬子的光合速率以molCO2 ·g-1·Fw·h-1表示，測定時(shí)將葉室的面積設(shè)定為1，取光適應(yīng)的海蓬子幼嫩枝條，迅速放入葉室內(nèi)，等光合值達(dá)到最大并穩(wěn)定時(shí)記錄結(jié)果，然后取出葉片稱量鮮重。Pn實(shí)際值(molCO2 g-1·Fw·h-1)=測量值/104/葉片鮮重(g)×3600；Gs實(shí)際值(mmol·H2O·(g·h)-1)= 測量值/104/葉片鮮重(g)×3600。采用掃描儀掃描測定葉面積，用Leat Dat

15、a軟件計(jì)算得出數(shù)據(jù)，每組處理6次重復(fù)。1.5數(shù)據(jù)分析 全部數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析在 Excel2003軟件上進(jìn)行。2 結(jié)果與分析2.1馬齒莧的抗氧化酶活性超氧化物歧化酶（SOD）是生物防御活性氧毒害的保護(hù)酶之一。SOD以氧自由基為底物，在活性氧代謝中處于重要地位，可淬滅超氧負(fù)離子O2-的毒性，終止由O2-啟動(dòng)的一系列自由基連鎖反應(yīng)造成的生物毒損傷，為生物體內(nèi)最重要的清除活性氧自由基的酶類。 植物在逆境下遭受傷害(或衰老)與活性氧積累誘發(fā)的膜脂過氧化作用密切相關(guān)。丙二醛（MDA）是膜脂過氧化物最重要的產(chǎn)物之一，作為細(xì)胞膜損傷程度大小的生理指標(biāo)，它的含量的多少可代表膜損傷的嚴(yán)重程度。伴隨O2-含量的增加，生

16、物膜脂質(zhì)過氧化加劇，膜脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA含量增加。MDA能強(qiáng)烈地與細(xì)胞內(nèi)的各種物質(zhì)發(fā)反應(yīng)，MDA的積累能引起細(xì)胞膜的嚴(yán)重?fù)p傷。因此可通過測定MDA了解膜脂過氧化的程度，以間接測定膜系統(tǒng)受損程度以及植物的抗逆性。由圖2可以看出，馬齒莧的MDA含量都隨著海水濃度的升高而增加，說明隨著海水濃度的升高，細(xì)胞膜脂過氧化程度增高，細(xì)胞膜受到的傷害更嚴(yán)重。圖1 不同海水濃度下馬齒莧的SOD的活性圖 2 不同海水濃度下馬齒莧的MDA含量過氧化氫酶（CAT）屬于血紅蛋白酶，含有鐵，能催化過氧化氫分解成氧和水，在此過程中起傳遞電子的作用，可根據(jù)H2O2的消耗量或O2的生成量測定該酶活力的大小。逆境脅迫下，細(xì)胞內(nèi)

17、易產(chǎn)生H2O2破壞膜系統(tǒng)的穩(wěn)定，而CAT能把光呼吸、線粒體電子傳遞以及脂肪酸的氧化等過程中產(chǎn)生的H2O2分解為H2O和O2，從而清除H2O2維護(hù)膜的穩(wěn)定性，從而使細(xì)胞免于遭受過氧化氫的傷害?？鼓嫘詮?qiáng)的品種有較高的過氧化氫酶活性，與抗逆性呈顯著性相關(guān)。圖 3 不同海水濃度下馬齒莧的CAT活性過氧化物酶（POD）是呼吸系統(tǒng)中的一種酶，廣泛存在于植物的器官中（葉中尤為豐富）。它與呼吸作用，光合作用及生長素的氧化等都有關(guān)系。在植物生長發(fā)育過程中它的活性不斷發(fā)生變化。一般老化組織中活性較高，幼嫩組織中活性較弱。這是因?yàn)檫^氧化物酶能使組織中所含的某些碳水化合物轉(zhuǎn)化成木質(zhì)素，增加木質(zhì)化程度。POD屬非特異性

18、酶，擔(dān)任著O2-、H2O2的產(chǎn)生和 H2O2 的清除雙重角色。由圖4顯示，馬齒莧的POD含量都隨著海水濃度的升高而增加，說明隨著海水濃度的升高，POD酶的抗氧化能力隨之提高。 圖 4 不同海水濃度下馬齒莧的POD活性2.2馬齒莧的可溶性蛋白含量可溶性蛋白與調(diào)節(jié)植物細(xì)胞的滲透勢有關(guān)，高含量的可溶性蛋白可幫助維持植物細(xì)胞較低的滲透勢，抵抗逆境帶來的脅迫。圖 5 不同海水濃度下馬齒莧的可溶性蛋白含量2.3馬齒莧的游離脯氨含量脯氨酸（Pro）是植物蛋白質(zhì)的組分之一，并可以游離狀態(tài)廣泛存在于植物體中，通常可以作為一種滲透調(diào)節(jié)劑或細(xì)胞質(zhì)酶的保護(hù)性物質(zhì)，保持細(xì)胞中生物聚合物的結(jié)構(gòu)及膜的完整性。在干旱、鹽漬等

19、脅迫條件下，許多植物體內(nèi)脯氨酸大量積累。積累的脯氨酸除了作為植物細(xì)胞質(zhì)內(nèi)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)外，還在穩(wěn)定生物大分子結(jié)構(gòu)、降低細(xì)胞酸性、解除氨毒以及作為能量庫調(diào)節(jié)細(xì)胞氧化還原勢等方面起重要作用。在逆境條件下（旱、鹽堿、熱、冷、凍），植物體內(nèi)脯氨酸的含量顯著增加。植物體內(nèi)脯氨酸含量在一定程度上反映了植物的抗逆性，抗旱性強(qiáng)的品種往往積累較多的脯氨酸。圖 6 不同海水濃度下馬齒莧的游離脯氨含量2.4馬齒莧的可溶性糖含量可溶性糖是干旱脅迫誘導(dǎo)的小分子溶質(zhì)之一，其種類主要包括葡萄糖、海藻糖、蔗糖等。這些可溶性糖類參與滲透調(diào)節(jié)，并可能在維持植物蛋白質(zhì)穩(wěn)定方面起到重要作用。葉片中較高的可溶性糖含量既可以作為營養(yǎng)物質(zhì)，

20、也可以增強(qiáng)植物對脅迫的適應(yīng)。圖 7 不同海水濃度下馬齒莧的可溶性糖含量2.5光合速率(Pn)、蒸騰速率（Tr）氣孔導(dǎo)度(Gs)及胞間CO2濃度(Ci)的分析2.5.1光合速率（Pn）的分析 隨著海水濃度的升高，馬齒莧的凈光合速率逐漸降低，當(dāng)濃度達(dá)到100%時(shí)，馬齒莧的凈光合速率為0，說明海水濃度對于馬齒莧的光合作用有著抑制作用，并且抑制作用隨著濃度的升高而增加。圖 8 不同海水濃度下馬齒莧的凈光合速率2.5.2蒸騰速率（Tr）的分析 隨著海水濃度的升高，馬齒莧的蒸騰速率逐漸降低，說明海水濃度對于馬齒莧的蒸騰作用有著抑制作用，并且抑制作用隨著濃度的升高而增加。圖 9 不同海水濃度下馬齒莧的蒸騰速

21、率2.5.3氣孔導(dǎo)度（Gs）的分析 氣孔是植物葉片與外界進(jìn)行氣體交換的主要通道。通過氣孔擴(kuò)散的氣體有O2、CO2和水蒸汽。植物在光下進(jìn)行光合作用，經(jīng)由氣孔吸收CO2，所以氣孔必須張開，但氣孔開張又不可避免地發(fā)生蒸騰作用，氣孔可以根據(jù)環(huán)境條件的變化來調(diào)節(jié)自己開度的大小而使植物在損失水分較少的條件下獲取最多的CO2。氣孔開度對蒸騰有著直接的影響。從圖10中可以看出，在0-30%階段，隨著海水濃度的增長，氣孔導(dǎo)度呈現(xiàn)下降狀態(tài)，不利于光合作用中二氧化碳的吸收。而當(dāng)海水濃度達(dá)到50%以后，氣孔導(dǎo)度基本不再下降。圖 10 不同海水濃度下馬齒莧的氣孔導(dǎo)度2.5.4胞間CO2濃度（Gs）的分析 從圖11中可以看出，隨著海水濃度的增長，細(xì)胞間的CO2濃度也呈現(xiàn)出增長的趨勢與圖8的凈光合速率剛好呈相反的狀態(tài)，光合速率增加對CO2利用升高，胞間CO2濃度就會(huì)減少，相反光合速率對CO2利用減少，胞間CO2濃度就會(huì)增加。因此可以推斷，胞間CO2濃度從側(cè)面反映了光合作用，一定程度上顯示了凈光合速率的大小?？傊S著海水濃度的變化，胞間CO2濃度與凈光合速率呈相反的變化趨勢，凈光合