1、護骨膠囊對去卵巢大鼠血清骨代謝指標的影響鐘佳賢1，林澤苗1，賈歡歡2,吳玉娥2，陳珺3，曹祺1，李青南2,3,* (1.廣東安諾藥業股份有限公司，揭陽515300； 2. 廣東省實驗動物重點實驗室，廣東省實驗動物監測所，廣州 510663；3.廣東藥科大學,生命科學與生物制藥學院，廣州 510006）摘要目的:觀察去卵巢大鼠血清骨代謝指標的改變及護骨膠囊（HG）的調節作用。材料方法:采用去卵巢（OVX）模型,分假手術（Sham）,去卵巢（OVX），仙靈骨葆(Pos)和護骨膠囊低、中、高劑量組(HG-L、HG-M和HG-H)。術后2天連續灌胃給藥3個月，取血清檢測骨代謝指標。結果:與Sham組比

2、較，OVX組骨形成指標ALP、BALP、UcOC、PINP和骨吸收指標CTX均顯著升高,但TRAP5a,TRAPb水平降低；OPG和OPG/RANKL比值顯著降低。與OVX組比較，HG-L、H組進一步升高ALP, HG-H組也升高BALP, HG-L、HG-M組降低BALP；Pos組降低ALP和BALP水平。HG和陽性藥物給藥組降低了UcOC和PINP水平，同時也降低CTX水平。HG-L組的TRAP5a升高；HG-L、HG-M和Pos組使TRAP5b升高。OPG在HG-H和Pos組增加；OPG/RANKL比值HG和陽性藥物給藥組均升高。結論:OVX使部分骨形成和骨吸收指標增加，表現為骨高轉換，

3、HG和仙靈骨葆都能降低這些指標。由于HG能在OVX基礎上進一步升高ALP，HG-H也升高BALP，而仙靈骨葆沒有進一步提高ALP和BALP水平，提示護骨膠囊刺激成骨的作用較強。關鍵詞 中醫中藥；護骨膠囊；骨質疏松；骨代謝指標收稿日期：作者簡介：鐘佳賢（1992-），女，本科生，主要從事藥物研究與推廣，E-mail：；* 通訊作者：李青南（1956-），女，教授，碩士生導師，主要從事骨質疏松模型及相關藥效學研究，E-mail：。Effects of Hugu capsules on bone metabolic indicators in ovariectomized ratsZHONG Jia

4、-xian1,LIN Ze-miao1,JIA Huan-huan2,WU Yu-e2,CHEN Jun3,CAOQi1,CAO Ke-guang1,LI Qing-nan2,3,*(1.Guangdong Annol Pharmaceutical Co.,Ltd，Jieyang 515300，China；2.Guangdong Key Laboratory of Laboratory Animals, Guangdong Laboratory Animals Monitoring Institute，Guangzhou 510663，China；3.School of Biosciences

5、 and Biopharmaceutics,Guangdong Pharcemeutical University,Guangzhou 510006,China)Abstract Objective:To study the effect of the Hugu capsules on bone metabolic indicators in ovariectomized rats. Method: Ovariectomized(OVX) rats were divided into six groups，including Sham group, OVX group, Xianlinggub

6、ao group (positive control) and HG low, medium and high dose group (Sham,OVX,Pos,HG-L,HG-M, HG-H), each group with 10 rats. The rats were ig administrated medicine continuously for three months two days after OVX. The Xianlinggubao in Pos control group and normal saline in Sham and OVX control group

7、, respectively. After treatment, the bone metabolic indicators in serum were detected. Result:ALP,BALP,UcOC,PINPand CTX were increased in OVX group, and the levels of OPG and TRAP5a, b and the OPG/RANKLratio were decreased significantly compared with Sham group. HG-L、H groups significantlyincreased

8、ALPand BALP was increased in HG-H and decreased in HG-L and HG-M compared with OVX, Pos decreased ALP and BALP levels. Levels of UcOC, PINP and CTX in HG and Pos were lower than those in OVX. The level of TRAP5a in HG-L was higher than that in OVX group while HG-H and Pos were significantly lower. T

9、RAP5b of HG-L and HG - M were increased than that in OVX group. TheOPG levels of HG-H and Pos and the OPG/RANKL ratios all the medicine groups were significantly increased when compared with OVX group.Conclusion:OVX can increase part ofbone metabolic markers and showed to a highbone turnover，HG and

10、Xianlinggubao can partly inhibit high bone turnover。HG-L、H groups further increased ALP and BALP while Xianlinggubao did not increase ALP and BALP levels, and for this reason, indicates that stimulation effect of bone formation in HG is stronger.Key words Traditional chinese medicine；Hugu capsules；O

11、steoporosis；Bone metabolic indicators前言去卵巢大鼠能模擬人的原發性骨質疏松，其表現為骨高轉換，而骨轉換過程可以通過骨代謝指標反映出來,間接顯示成骨細胞與破骨細胞的活性1。隨著骨質疏松癥的流行病學、病理生理研究的不斷深入,骨代謝指標檢測也廣泛的應用于臨床骨質疏松的跟蹤治療及代謝性骨病的鑒別診斷中。中藥復方護骨膠囊已上市11年，上市前做了動物去卵巢實驗和I、期臨床試驗，均顯示有較好的防治骨質疏松的作用。并于2004年獲得批文，開始臨床應用。目前對其處方的配伍、數理藥效的分析，血清藥理學對成骨細胞的影響都做了一定的研究25-27，臨床研究顯示28，護骨膠囊治療后

12、能明顯改善原發性骨質疏松癥中醫辨證屬于腎精虧虛、筋骨失養患者的腰脊部疼痛、脛膝酸軟、步履艱難等主要臨床癥狀及提高患者的骨密度，且治療過程中未發現其對心、肝、腎功能及血液系統有明顯的損害，臨床應用安全。但由于當年做動物實驗的條件有限，動物實驗做得相對簡單，對于此藥作用機理的研究不夠深入，廣東安諾藥業股份有限公司為完善動物實驗，全面的了解藥物的藥效機制，借助現代先進的儀器設備和方法，按照美國FDA骨質疏松新藥臨床前研究的標準設計動物實驗。采用雙側去卵巢大鼠模型,在整體動物水平研究中藥護骨膠囊對去卵巢大鼠血清骨代謝指標的影響，完善護骨膠囊防治骨質疏松的作用機理，為臨床更好的應用提供實驗依據。1.材料

13、與方法1.1 動物模型與實驗分組3月齡SPF級雌性SD大鼠60只，體重（2103）g，隨機分為6組:假手術組、去卵巢組、仙靈骨葆組（陽性對照組）和護骨膠囊低、中、高劑量組(Sham、OVX、Pos、HG-L、HG-M、HG-H)，每組10只。大鼠適應性喂養2w后，進行如下干預：1.去卵巢造模：假手術組在手術中不切除卵巢，僅摘除少量脂肪，其余各組均切除雙側卵巢。2.藥物干預（每日）：去卵巢手術2天后，Sham組與OVX組灌服生理鹽水10mL/(kgd)，Pos組灌服等劑量的仙靈骨葆0.270g/(kg10mLd)，HG-L、M和H組分別灌服等劑量的HG0.243、0.486、0.972 g/(k

14、g10mLd)，HG-M為臨床成人的等效劑量。各組大鼠自由進食和飲水，每周稱量并記錄體重一次，按體重調整給藥劑量，共計給藥3個月。藥物干預結束時，心臟抽血處死大鼠，收集各只大鼠血液，所獲血標本置于室溫環境下放置4h，3000 r/min，離心15min，吸取血清后靜置放于冰盒中，每組混合成一管,采用0.22m濾器除菌后分裝, 用1.5mLEP管分裝并置于-80C冰箱保存。1.2實驗藥物中藥護骨膠囊組由淫羊藿、巴戟天、制何首烏、杜仲、骨碎補、熟地黃、龜甲等組成，由廣東安諾藥業股份有限公司(原東莞萬成制藥有限公司)生產，批號：20150101，規格：0.45g；仙靈骨葆陽性藥物組（由淫羊藿、續斷、

15、補骨脂、知母、丹參等組成，由貴州同濟堂制藥有限公司生產,批號：20140701規格：0.50g）1.3血清骨代謝指標的檢測取每組血清標本2ml送至上海邦奕生物科技有限公司采用Elisa試劑盒檢測血骨代謝指標12項：骨形成指標：堿性磷酸酶（ALP）和骨堿性磷酸酶（BALP）、骨鈣素（OC）和羧化不全骨鈣素(UcOC)、型前膠原羧基末端前肽(PICP)和型前膠原氨基末端前肽(PINP)；骨吸收指標：抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP5a和TRAP5b）、型膠原N末端肽(NTX)和型膠原C末端肽(CTX)；另外還檢測了骨保護素(OPG)與核因子NF-kB配體的受體激活劑(RANKL)。1.4統計分析應用S

16、PSS 16.0統計軟件進行分析處理，所有數據以均數標準差 (x-s) 表示，組間行方差齊性檢驗、單因素方差分析(one-way ANOVA) ，P0.05為差異有統計學意義。2.結果2.1 護骨膠囊對去卵巢大鼠血清骨形成指標的影響(見表1、圖1)表1、圖1可見:與Sham組比較,OVX組的ALP、BALP、UcOC和PINP水平均顯著升高（P0.05）；HG組與OVX組相比，ALP水平在HG-L和HG-H組顯著升高（P0.05）； BALP水平在HG-L、HG-M組顯著降低（P0.01），而HG-H組升高（P0.01）；Pos組與OVX組比,ALP和BALP水平均降低（前者P0.05,后者P

17、0.01）；而UcOC和PINP水平，HG組和Pos組與OVX組比均顯著降低（P0.05）。表1 實驗后各組大鼠血清骨形成指標的變化(x-s)Table1 The effect after the experiment on serum bone formation indexs in groups of rats (x-s)組別Group數量n堿性磷酸酶ALP（U/L）骨堿性磷酸酶BALP（U/L）骨鈣素OC（ng/L）羧化不全骨鈣素UcOC（pg/mL）I型前膠原羧基端前肽PICP（ng/L）I型前膠原氨基端前肽PINP （g/L）假手術組Sham1010.200.427.080.2196

18、1.2921.58746.1418.51208.846.5815.410.73去卵巢組OVX1012.310.4454*7.910.11*949.6333.221088.6020.17*199.477.9617.210.44*陽性藥物組Pos1011.530.24*#7.050.09#881.485.63*#925.8627.90*#267.7115.05*#15.650.42#護骨低劑量組HG-L1013.620.44*#6.800.23#909.7229.77*769.2832.06#245.259.16*#14.180.45*#護骨中劑量組HG-M1012.300.21*6.080.13

19、*#941.0320.29854.1216.25*#224.769.28#14.400.45*#護骨高劑量組HG-H1013.210.14*#7.930.19*#847.1022.20*#932.8014.14*#210.808.9016.570.43*注： *,*P0.05,0.01 VS Sham；#,#P0.05 VS OVX；,P0.05,0.01 VS Pos；,P0.05,0.01VS HG-L；,P0.05,0.01 VS HG-M.圖1實驗后各組大鼠相對OVX組有意義的血清骨形成指標變化柱形圖Fig.1 The charts on changes of serum bone f

20、ormation indexes in groups that have statistical significance of differences to OVX group after experiment. *,*P0.05,0.01 VS Sham；#,#P0.05 VS OVX；,P0.05,0.01 VS Pos；,P0.05,0.01VS HG-L；,P0.05）。與OVX組CTX水平比，HG和Pos組均顯著降低（P0.01）；HG-L、HG-M組和HG-H組（54.13nmol/L、56.30nmol/L，后者61.84nmol/L），HG-H與Pos組結果相似。與Sham組

21、比較，OVX組TRAP5a和TRAP5b水平降低（P0.01）。與OVX組相比，HG-L組的TRAP5a水平升高（P0.01），而HG-H組的TRAP5a水平明顯降低（P0.05），與Pos組相似。TRAP5b水平,HG-L和HG-M組高于OVX組，有顯著性差異（P0.01），Pos和HG-H組都下降至接近OVX組（前者P0.05）。2.3護骨膠囊對去卵巢大鼠血清骨代謝指標OPG和OPG/RANKL比值的影響(見表2、圖2)表2、圖2可見：與Sham組相比較，OVX組的RANKL水平有所下降，但無統計學差異(P0.05)；與OVX組比，RANKL水平在HG低、中劑量組有統計學差異的下降（P0.

22、01），但HG-H組則增加（P0.05)。OPG為RANKL的拮抗劑，OVX組與Sham組比下降（P0.01），與OVX組比，只有HG-H組和Pos組有統計學意義的增加（P0.01）。OPG/RANKL比值，OVX組顯著降低（P0.01），HG和Pos組都增加（P0.05）。表2實驗后各組大鼠血清骨吸收指標和OPG水平、OPG/RANKL比值的變化(x-s)Table 2The effect after the experiment on serum bone absorptionindexs，OPG levels and OPG/RANKL ratios in groups of rats(

23、x-s)組別Group數量n抗酒石酸酸性磷酸酶5a TRAP5a（U/L）抗酒石酸酸性磷酸酶5b TRAP5b（U/L）型膠原N末端肽 NTX（nmol/L）型膠原C端肽 CTX(nmol/L)骨保護素 OPG（ng/L）核因子kb受體活化因子配體 RANKL（pg/mL）骨保護素/核因子kb受體活化因子配體 OPG/RANKL假手術組Sham1010.160.305.970.2317.550.5363.922.661343.2833.3036.681.3836.672.07去卵巢組OVX109.230.24*4.430.12*16.770.4169.463.06*1129.2444.71*3

24、4.671.2532.570.17*陽性藥物組Pos109.000.36*5.350.07*#18.060.48#61.341.00#1339.4530.65#36.430.6736.770.28#護骨低劑量組HG-L1011.110.19*#6.080.19#16.600.8854.132.00*#1143.0528.13*29.821.10*#38.371.91#護骨中劑量組HG-M109.600.20*5.750.30#19.750.53*#56.301.58*#1126.9411.59*32.111.58*#35.161.96護骨高劑量組HG-H108.700.15*#4.660.12

25、*19.600.92*#61.841.31#1350.9618.61#37.100.78#36.441.20#注： *,*P0.05,0.01 VS Sham；#,#P0.05 VS OVX；,P0.05,0.01 VS Pos；,P0.05,0.01VS HG-L；,P0.05,0.01 VS HG-M.圖2實驗后各組大鼠相對OVX組有意義的血清骨吸收指標變化柱形圖Fig.2 The charts on changes of serum bone resorption indexes in groups that have statistical significance of differ

26、ences to OVX group after experiment.*,*P0.05,0.01 VS Sham；#,#P0.05 VS OVX；,P0.05,0.01 VS Pos；,P0.05,0.01VS HG-L；,P0.05,0.01 VS HG-M.3. 討論3.1 切除雙側卵巢建立絕經后骨質疏松癥大鼠模型已成為公認的標準化的絕經后骨質疏松經典模型3。此模型的病理變化與婦女絕經后骨質疏松有許多相似之處,其中包括具備骨吸收與骨形成均異常增加的“高轉換型”骨質疏松的特征17。本實驗中，大鼠卵巢摘除3個月后，部分反映骨形成的指標如ALP、BALP、UcOC和PINP及反映骨吸收的指標如

27、CTX的含量均顯著升高（P0.01)，表明去卵巢后骨形成與骨吸收部分指標增加，但TRAP5a和TRAP5b水平較假手術組降低，這與方玲娜、戴如春等11采用70只7月齡SD雌性大鼠OVX3w、15w后TRAP5b水平降低的結果文獻相似。3.2骨形成指標分析ALP和BALP是最常用的評價骨形成和骨轉換的指標18，故成為反映成骨細胞活性的特異及敏感指標,成骨細胞活性增強,則ALP和BALP分泌增加1。OC和UcOC也是評價骨形成和骨轉換率的特異性指標16。PICP、PINP是骨形成的特異和敏感指標1，2,8,18。本實驗中，ALP水平，HG組在去卵巢升高的基礎上，更進一步的升高，而仙靈骨葆組降低。H

28、G的結果與中藥骨疏靈對OVX大鼠骨代謝的影響的結果一致15，以及與中藥增骨丸對OVX所致骨質疏松大鼠血、尿生化的結果相似19,也在OVX升高ALP的基礎上更進一步增加。而高劑量的HG的BALP水平在OVX基礎上顯著升高。究其原因,可能為這幾個中藥復方中都含有淫羊藿、骨碎補等成分，具有成骨刺激作用所致。現代醫學發現淫羊藿、骨碎補等補腎中藥具有植物異黃酮抗骨質疏松活性，具有骨細胞雙向調節作用及雌激素樣作用4,12，且已有大量研究表明黃酮類化合物對成骨有明顯促進作用7；BALP水平在低、中劑量的HG組降低,仙靈骨葆組也降低，上述結果顯示HG能降低OVX所致的BALP水平的升高，但HG對BALP有劑量

29、依賴。HG能降低OVX所致的UcOC和PINP水平的增加，與仙靈骨葆一致，本文結果與盧建華等20、劉菊等21、張瑤和劉菊等22的補腎方降低骨形成指標如PINP水平的結果一致。3.2骨吸收指標分析NTX和 CTX是目前國際公認的代表骨吸收的生化指標16。本實驗中，大鼠去卵巢后CTX水平顯著升高,HG和仙靈骨葆給藥組均能顯著降低CTX水平，提示護骨膠囊和仙靈骨葆均能降低OVX所致的CTX的增加，可能具有降低骨吸收的作用。本實驗的結果與倪天慶14關于仙珠膠囊對OVX大鼠血生化指標的影響的研究結果一致。TRACP是骨吸收的重要指標3，主要由破骨細胞釋放,因而血清中的TRACP水平反映破骨細胞活性和骨吸

30、收的狀態，TRACP分成5a和5b兩個亞型6，23。本實驗中,OVX組TRAP5a和TRAP5b水平較假手術組明顯降低，此結果與崔省珍等10和李寶芬等5將大鼠OVX14w后，TRAP5a和TRAP5b水平均升高的結果不一致。但與方玲娜、戴如春等11采用70只7月齡SD雌性大鼠OVX3w、15w后TRAP5b水平降低的結果相似。他們在文獻中分析到,OVX大鼠的血清TRAP5b水平變化并不能真正代表破骨細胞骨吸收活性的變化，而在更大程度上代表破骨細胞數量的變化21,22，血清CTX可能更直接的反映破骨細胞骨吸收活性的變化11。與OVX組比，TRAP5a水平只有HG低劑量組增加，而TRAP5b水平在

31、HG低、中劑量和仙靈骨葆組都增加。這些結果提示HG和仙靈骨葆能增加OVX后的TRAP5b水平，而TRAP5b水平在更大程度上代表破骨細胞數量的變化，提示它們能促進破骨細胞的增殖，促進骨轉化，這可能有利于促進骨骼的更新，具體的原因有待深入的研究。3.3 RANKL/RANK/OPG系統分析OPG/ RANKL/ RANK是近些年來發現的在破骨細胞分化過程中的一個重要信號傳導通路13, OPG是破骨細胞生成抑制因子,RANKL是誘使破骨細胞分化的關鍵因子,RANK是RANKL的唯一靶受體17，24。OPG與RANKL競爭性結合,阻止RANK與RANKL結合,抑制骨吸收、促進骨形成6。OPG水平和O

32、PG/RANKL比值升高時,說明骨形成增加而骨破壞減少9。去卵巢后OPG水平和OPG/RANKL比值降低；HG高劑量組和仙靈骨葆組與OVX組比較，OPG水平有統計學意義的升高，而HG和仙靈骨葆給藥組使OPG/RANKL比值升高。此結果與滋腎丸浸膏對OVX大鼠骨質疏松模型OPG/RANK/RANKL系統的影響結果一致13。提示兩種藥物均可能通過對OPG/ RANKL/ RANK系統的調節，促進骨形成，抑制骨吸收。綜上所述,OVX使部分骨形成和骨吸收指標增加，表現為骨高轉換。HG和仙靈骨葆用藥后降低了BALP、UcOC、PINP和CTX水平，降低骨高轉換；同時，也提高了OPG/RANKL比值。且H

33、G在OVX增加的基礎上進一步升高ALP，高劑量HG也升高BALP水平，提示HG降低骨高轉換的同時還刺激成骨，而仙靈骨葆只是降低了OVX所致的高ALP和BALP水平，這些指標的變化提示護骨膠囊刺激成骨的作用較強。HG和仙靈骨葆能增加OVX后的TRAP5b水平，這可能有利于促進骨骼的更新，具體的原因有待深入的研究。參考文獻：1.孟迅吾.骨轉換生化標志物及其臨床應用J.中國實用內科雜志,2011,31(7):504-506.MENG Xunwu.Biochemical markers of bone turnover and its clinical use J.Chinese Journal of

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