1、一、總則GeneralPrinciple1范圍本規范規定了化妝品微生物學檢驗總則。本規范適用于化妝品樣品的采集、保存、供檢樣品制備。2儀器和設備天平。高壓滅菌器。振蕩器。三角瓶。玻璃珠。玻璃棒。刻度吸管。研缽。均質器。恒溫水浴箱。采樣用具：不銹鋼勺，剪刀，開罐器等。3培養基和試劑生理鹽水成分：氯化鈉8.5g身壓火困0蒸儲水加至1000mL溶解后，分裝到加玻璃珠的三角瓶內，每瓶90mL(15lb)20minSCDLP液體培養基成分：酪蛋白月東17g大豆蛋白月東3g氯化鈉5g2.5g磷酸氫二鉀2.5g葡萄糖卵磷脂1g吐溫807g蒸儲水1000mL制法：先將卵磷脂在少量蒸儲水中加溫溶解后，再與其它成

2、分混合，加熱溶解，調pH為，分裝，(15lb)20min高壓滅菌。注意振蕩，使沉淀于底層的吐溫80充分混合，冷卻至25c左右使用。注：如無酪蛋白月東和大豆蛋白月東，也可用多月東代替。滅菌液體石蠟。3.4滅菌吐溫80。4樣品的采集及注意事項所采集的樣品，應具有代表性，一般視每批化妝品數量大小，隨機抽取相應數量的包裝單位。檢驗時，應分別從兩個包裝單位以上的樣品中共取10g或10mL包裝量小于20g的樣品，采樣量應適量增加，其總量應大于16g。供檢驗樣品，應嚴格保持原有的包裝狀態，進口產品應為市售包裝。容器不應有破裂，在檢驗前不得打開，防止樣品被污染。接到樣品后，應立即登記，編寫檢驗序號，并按檢驗要

3、求盡快檢驗。如不能及時檢驗，樣品應放在室溫陰涼干燥處，不要冷藏或冷凍。若只有一份樣品而同時需做多種分析，如微生物、毒理、化學等，應先做微生物檢驗，再將剩余樣品做其它分析。在檢驗過程中，從打開包裝到全部檢驗操作結束，均須防止微生物的再污染和擴散，所用采樣用具、器皿及材料均應事先滅菌，全部操作應在無菌室內進行，或在相應條件下，按無菌操作規定進行。5供檢樣品的制備液體樣品5.1.1 水溶性的液體樣品，量取10mL加到90mL滅菌生理鹽水中，混勻后，制成1:10檢液。5.1.2 油性液體樣品，取樣品10mL先加5mL滅菌液體石蠟混勻，再加10mL滅菌的吐溫80,在40c44c水浴中振蕩混合10min,

4、加入滅菌的生理鹽水75mL（在40C44c水浴中預溫），在40c44c水浴中乳化，制成1:10的懸液。膏、霜、乳劑半固體狀樣品5.2.1 親水性的樣品，稱取10g,加到裝有玻璃珠及90mL滅菌生理鹽水的三角瓶中，充分振蕩混勻，靜置15min。取其上清液作為1:10的檢液。5.2.2 疏水性樣品，稱取10g,放到滅菌的研缽中，加10mL滅菌液體石蠟，研磨成粘稠狀，再加入10mL滅菌吐溫80,研磨待溶解后，加70mL滅菌生理鹽水，在40c44c水浴中充分混合，制成1:10檢液。固體樣品，稱取10g,加到90mL滅菌生理鹽水中，充分振蕩混勻，使其分散混懸，靜置后，取上清液作為1:10的檢液。如有均質

5、器，上述水溶性膏、霜、粉劑等，可稱10g樣品加入90mL滅菌生理鹽水，土質1min2min;疏水性膏、霜及眉筆、口紅等，稱10g樣品，力口10mL滅菌液體石蠟，10mL滅菌吐溫80,70mL滅菌生理鹽水，均質3min5min。二、菌落總數AerobicBacterialCount1范圍本規范規定了化妝品中菌落總數的檢驗方法。本規范適用于化妝品菌落總數的測定。2定義本規范采用下列定義菌落總數(aerobicbacterialcount)是指化妝品檢樣經過處理，在一定條件下培養后(如培養基成分、培養溫度、培養時間、pH值、需氧性質等)，1g(1mL)檢樣中所含菌落的總數。所得結果只包括一群本方法規

6、定的條件下生長的嗜中溫的需氧性菌落總數。測定菌落總數便于判明樣品被細菌污染的程度，是對樣品進行衛生學總評價的綜合依據。3儀器和設備三角瓶。量筒。pH計或精密pH試紙。高壓滅茵器。試管。平皿：直徑9cm刻度吸管：10mL、2mL1mL酒精燈。恒溫培養箱。放大鏡。4培養基和試劑生理鹽水：見總則中。卵磷脂、吐溫80一營養瓊脂培養基3g4.2.1 成分：蛋白陳20g牛肉膏氯化鈉5g瓊脂15g卵磷脂1g吐溫807g蒸儲水1000mL4.2.2 制法：先將卵磷脂加到少量蒸儲水中，加熱溶解，加入吐溫80,將其他成分(除瓊脂外)加到其余的蒸儲水中，溶解。加入已溶解的卵磷脂、吐溫80,混勻，調pH值為，加入瓊脂

7、，(15lb)20min高壓滅菌，儲存于冷暗處備用。%氯化三苯四氮口坐(2,3,5-triphenylterazoliumchloride,TTC)成分：TTC0.5g蒸儲水100mL溶解后過濾，(15lb)20min高壓滅菌，裝于棕色試劑瓶，置4c冰箱備用。5操作步驟用滅菌吸管吸取1:10稀釋的檢液2mL分別注入到兩個滅菌平皿內，每皿1mL另取1mL注入到9mL滅菌生理鹽水試管中(注意勿使吸管接觸液面)，更換一支吸管，并充分混勻，制成1:100檢液。吸取2mL分別注入到兩個滅菌平皿內，每皿1mL如樣品含菌量高，還可再稀釋成1:1000,1:10000,等，每種稀釋度應換1支吸管。將融化并冷至

8、45c50c的卵磷脂吐溫80營養瓊脂培養基傾注到平皿內，每皿約15mL隨即轉動平皿，使樣品與培養基充分混合均勻，待瓊脂凝固后，翻轉平皿，置37c培養箱內培養48h。另取一個不加樣品的滅菌空平皿，加入約15mL卵磷脂吐溫80營養瓊脂培養基，待瓊脂凝固后，翻轉平皿，置37c培養箱內培養48h,為空白對照。為便于區別化妝品中的顆粒與菌落，可在每100mL卵磷脂吐溫80營養瓊脂中加入%的TTC溶液，如有細菌存在，培養后菌落呈紅色，而化妝品的顆粒顏色無變化。6菌落計數方法先用肉眼觀察，點數菌落數，然后再用放大510倍的放大鏡檢查，以防遺漏。記下各平皿的菌落數后，求出同一稀釋度各平皿生長的平均菌落數。若平

9、皿中有連成片狀的菌落或花點樣菌落蔓延生長時，該平皿不宜計數。若片狀菌落不到平皿中的一半，而其余一半中菌落數分布又很均勻，則可將此半個平皿菌落計數后乘以2,以代表全皿菌落數。7菌落計數及報告方法首先選取平均菌落數在30300個之間的平皿，作為菌落總數測定的范圍。當只有一個稀釋度的平均菌落數符合此范圍時，即以該平皿菌落數乘其稀釋倍數（見表1中例1）o若有兩個稀釋度，其平均菌落數均在30300個之間，則應求出兩菌落總數之比值來決定，若其比值小于或等于2,應報告其平均數，若大于2則報告其中稀釋度較低的平皿的菌落數（見表1中例2及例3）若所有稀釋度的平均菌落數均大于300個，則應按稀釋度最高的平均菌落數

10、乘以稀釋倍數報告之（見表1中例4）o若所有稀釋度的平均菌落數均小于30個，則應按稀釋度最低的平均菌落數乘以稀釋倍數報告之（見表1例5）。若所有稀釋度的平均菌落數均不在而相鄰的另一稀釋度小于30個時,報告之（見表1中例6）030300個之間，其中一個稀釋度大于300個,則以接近30或300的平均菌落數乘以稀釋倍數若所有的稀釋度均無菌生長，報告數為每g或每mL小于10CFU菌落計數的報告，菌落數在10以內時，按實有數值報告之，大于100時，采用二位有效數字，在二位有效數字后面的數值，應以四舍五入法計算。為了縮短數字后面零的個數，可用10的指數來表示（見表1報告方式欄）。在報告菌落數為“不可計”時，

11、應注明樣品的稀釋度。表1菌落計數結果及報告方式例不同稀釋度平均菌兩稀釋菌落總數報告方式次落數度CFU/mLCFU/mL或10-110-2菌數之或CFU/g10一3比CFU/g11365164201640016000或X10422760295463800038000或X10432890271602710027000或X1044不可計4650513513000510000或X105527115270270或X1026不可計305123050031000或X1047001X10V100火CFU菌落形成單位三、糞大腸菌群FecalColiforms1范圍本規范規定了化妝品中糞大腸菌群的檢驗方法。本規范

12、適用于化妝品中糞大腸菌群的檢驗。2定義本規范采用下列定義糞大腸菌群(Fecalcoliforms)系一群需氧及兼性厭氧革蘭氏陰性無芽胞桿菌,在44.5C培養24h48h能發酵乳糖產酸并產氣。該菌來自人和溫血動物糞便，是重要的衛生指示菌。3儀器恒溫水浴箱或隔水式恒溫箱：44C0.5溫度計。顯微鏡。載玻片接種環。電爐。三角瓶。試管。小倒管。pH計或pH試紙。高壓滅茵器。刻度吸管：10mL2mL1mL平皿。4培養基和試劑40g10g雙倍乳糖膽鹽培養基成分：蛋白月東豬膽鹽乳糖10g%漠甲酚紫水溶液5mL蒸儲水1000mL制法：將蛋白月東、膽鹽及乳糖溶解于蒸儲水中，調pH到，加入呢!甲酚紫水溶液5mLi

13、混勻，分裝試管（每支試管中加一個小倒管）。（10lb）20min滅菌。伊紅美蘭（EMB）瓊脂成分：蛋白月東10g乳糖10g磷酸氫二鉀2g瓊脂20g2%伊紅水溶液20mL%美藍水溶液13mL蒸儲水1000mL制法：先將瓊脂加到900mL蒸儲水中，加熱溶解，然后加入磷酸氫二鉀、蛋白月東，混勻，使之溶解。再以蒸儲水補足至1000mL校正pH值為，分裝于三角瓶內，（15lb）15min高壓滅菌備用。臨用時加入乳糖并加熱融化瓊脂。冷至60c左右無菌操作加入滅菌的伊紅美藍溶液，搖勻傾注平皿備用蛋白月東水（作靛基質試驗用）成分：蛋白月東（或胰蛋白月東）20g5g氯化鈉蒸儲水1000mL制法：將上述成分加熱融

14、化，調pH值為，分裝小試管，（15lb）15min高壓滅菌。靛基質試劑柯凡克試劑：將5g對二甲氨基苯甲醛溶解于75mL戊醇中，然后緩慢加入濃鹽酸25mL試驗方法：接種細菌于蛋白陳水中，于440.5培養24h0沿管壁加柯凡克試劑，輕搖試管。陽性者于試劑層顯深玫瑰紅色。注：蛋白月東應含有豐富的色氨酸，每批蛋白月東買來后，應先用已知菌種鑒定后方可使用。革蘭氏染色液:4.5.1 染液制備4.5.1.1 結晶紫染色液：結晶紫1g95%乙醇20mL1%草酸鏤水溶液80mL將結晶紫溶于乙醇中，然后與草酸鏤溶液混合。4.5.1.2 革蘭氏碘液：碘1g碘化鉀2g蒸儲水加至300mL將碘與碘化鉀先進行混合，加入蒸

15、儲水少許，充分振搖，待完全溶解后，再加蒸儲水至300mL4.5.1.3 脫色液：95充醇。4.5.1.4 復染液：a.沙黃復染液:沙黃0.25g95%乙醇10mL蒸儲水90mL將沙黃溶解于乙醇中，然后用蒸儲水稀釋。b.稀石碳酸復紅液：稱取堿性復紅10g,研細，加95%TJ1100mL放置過夜,濾紙過濾。取該液10mL加5%ff碳酸水溶液90mL混合，即為石碳酸復紅液。再取此液10mL加水90mL即為稀石碳酸復紅液。4.5.2 染色法4.5.2.1 將涂片在火焰上固定，滴加結晶紫染色液，染1min,水洗。4.5.2.2 滴加革蘭氏碘液，作用1min,水洗。4.5.2.3 滴加95充醇脫色，約30

16、s,或將乙醇滴滿整個涂片，立即傾去，再用乙醇滴滿整個涂片，脫色10s,水洗。4.5.2.4 滴加復染液，復染1min,水洗，待干，鏡檢。4.5.3 染色結果革蘭氏陽性菌呈紫色，革蘭氏陰性菌呈紅色注：如用1:10稀釋石碳酸復紅染色液作復染，復染時間僅需10s。5操作步驟取10mL1:10稀釋的檢液，加到10mL雙倍濃度的乳糖膽鹽培養基中，置44c土0.5C培養箱中培養24h48h,如不產酸也不產氣，則報告為糞大腸菌群陰性。如產酸產氣，劃線接種到伊紅美藍瓊脂平板上，置37c培養18h24h0同時取該培養液12滴接種到蛋白月東水中，置44c0.5C培養24h0經培養后，在上述平板上觀察有無典型菌落生

17、長。糞大腸菌群在伊紅美藍瓊脂培養基上的典型菌落呈深紫黑色，圓形，邊緣整齊，表面光滑濕潤，常具有金屬光澤。也有的呈紫黑色，不帶或略帶金屬光澤，或粉紫色，中心較深的菌落，亦常為糞大腸菌群，應注意挑選。挑取上述可疑菌落，涂片作革蘭氏染色鏡檢。在蛋白月東水培養液中，加入靛基質試劑約，觀察靛基質反應。陽性者液面呈玫瑰紅色；陰性反應液面呈試劑本色。6檢驗結果報告根據發酵乳糖產酸產氣，平板上有典型菌落，并經證實為革蘭氏陰性短桿菌，靛基質試驗陽性，則可報告被檢樣品中檢出糞大腸菌群。四、綠膿桿菌PseudomonasAeruginosa1范圍本規范規定了化妝品中綠膿桿菌的檢驗方法。本規范適用于化妝品中綠膿桿菌的

18、檢驗。2定義本規范采用下列定義。綠膿中f菌(Pseudomonasaeruginosa)屬于假單胞菌屬，為革蘭氏陰性桿菌，氧化酶陽性，能產生綠膿菌素。此外還能液化明膠，還原硝酸鹽為亞硝酸鹽，在42C條件下能生長。該菌對人有致病力，可使傷處化膿，引起敗血癥等。3儀器恒溫培養箱：37C、420三角瓶。試管平皿。刻度吸管：10mL2mL1mL顯微鏡。載玻片。接種針、接種環。電爐。高壓滅茵器。4培養基和試劑SCDLP液體培養基見總則中。十六烷基三甲基漠化鏤培養基成分：牛肉膏3g氯化鈉5g十六烷基三甲基漠化鏤0.3g瓊脂20g蒸儲水1000mL制法：除瓊脂外，將上述成分混合加熱溶解，調pH為，加入瓊脂，

19、(10lb)20min滅菌后，制成平板備用。乙酰胺培養基成分：乙酰胺10g氯化鈉5g無水磷酸氫二鉀1.39g無水磷酸二氫鉀0.73g硫酸鎂(MgSO7HO)0.5g酚紅0.012g(篩711mD20g瓊脂蒸儲水1000mL制法：除瓊脂和酚紅外，將其它成分加到蒸儲水中，加熱溶解，調pH為，加入瓊脂、酚紅，（15lb）20min高壓滅菌后，制成平板備用。綠膿菌素測定用培養基成分：蛋白月東20g氯化鎂1.4g硫酸鉀10g瓊脂18g甘油（化學純）10g蒸儲水1000mL制法：將蛋白月東、氯化鎂和硫酸鉀加到蒸儲水中，加溫使其溶解，調pH至，加入瓊脂和甘油，加熱溶解，分裝于試管內，（10lb）20min高

20、壓滅菌后，制成斜面備用。3g明膠培養基成分：牛肉膏5g蛋白陳明膠120g蒸儲水1000mL制法：取各成分加到蒸儲水中浸泡20min,隨時攪拌加溫使之溶解，調pH至,分裝于試管內，經（10lb）20min滅菌后，直立制成高層備用。硝酸鹽蛋白月東水培養基成分：蛋白月東10g酵母浸膏3g硝酸鉀2g亞硝酸鈉0.5g蒸儲水1000mL制法：將蛋白月東和酵母浸膏加到蒸儲水中，加熱使之溶解，調pH為，煮沸過濾后補足液量，力口入硝酸鉀和亞硝酸鈉，溶解混勻，分裝到加有小倒管的試管中，（10lb）20min滅菌后備用。普通瓊脂斜面培養基10g成分：蛋白月東牛肉膏3g氯化鈉5g瓊脂15g蒸儲水1000mL制法：除瓊

21、脂外，將其余成分溶解于蒸儲水中，調pH為，加入瓊脂，加熱溶解，分裝試管，(15lb)20min高壓滅菌后，制成斜面備用。5操作步驟增菌培養：取1:10樣品稀釋液10mL加到90mLSCDLP夜體培養基中，置37c培養18h24h。如有綠膿桿菌生長，培養液表面多有一層薄菌膜，培養液常呈黃綠色或藍綠色。分離培養：從培養液的薄膜處挑取培養物，劃線接種在十六烷基三甲基漠化鏤瓊脂平板上，置37c培養18h24h。凡綠膿桿菌在此培養基上，其菌落扁平無定型，向周邊擴散或略有蔓延，表面濕潤，菌落呈灰白色，菌落周圍培養基常擴散有水溶性色素，此培養基選擇性強，大腸艾希氏菌不能生長，革蘭氏陽性菌生長較差。在缺乏十六

22、烷基三甲基漠化鏤培養基時也可用乙酰胺培養基進行分離，將菌液劃線接種于平板上，放37c培養24h,綠膿桿菌在此培養基上生長良好，菌落扁平，邊緣不整，菌落周圍培養基略帶粉紅色，其它菌不生長。染色鏡檢：挑取可疑的菌落，涂片，革蘭氏染色，鏡檢為革蘭氏陰性者應進行氧化酶試驗。氧化酶試驗：取一小塊潔凈的白色濾紙片放在滅菌平皿內，用無菌玻璃棒挑取綠膿桿菌可疑菌落涂在濾紙片上，然后在其上滴加一滴新配制的1%C甲基對苯二胺試液，在15s30s之內，出現粉紅色或紫紅色時，為氧化酶試驗陽性；若培養物不變色，為氧化酶試驗陰性。綠膿菌素試驗：取可疑菌落23個，分別接種在綠膿菌素測定培養基上，置37c培養24h,加入氯仿

23、3m&5mL充分振蕩使培養物中的綠膿菌素溶解于氯仿液內，待氯仿提取液呈藍色時，用吸管將氯仿移到另一試管中并加入1mol/L的鹽酸1mL左右，振蕩后，靜置片刻。如上層鹽酸液內出現粉紅色到紫紅色時為陽性，表示被檢物中有綠膿菌素存在。硝酸鹽還原產氣試驗：挑取可疑的綠膿桿菌純培養物，接種在硝酸鹽蛋白月東水培養基中，置37c培養24h,觀察結果。凡在硝酸鹽蛋白月東水培養基內的小倒管中有氣體者，即為陽性，表明該菌能還原硝酸鹽，并將亞硝酸鹽分解產生氮氣。明膠液化試驗，取綠膿桿菌可疑菌落的純培養物，穿刺接種在明膠培養基內，置37c培養24h,取出放冰箱10min30min,如仍呈溶解狀時即為明膠液化試驗陽性；

24、如凝固不溶者為陰性。42C生長試驗：挑取可疑的綠膿桿菌純培養物，接種在普通瓊脂斜面培養基上，放在4142c培養箱中，培養24h48h,綠膿桿菌能生長，為陽性，而近似的熒光假單胞菌則不能生長。被檢樣品經增菌分離培養后，在分離平板上有典型或可疑菌落生長，經證實為革蘭氏陰性桿菌，氧化酶及綠膿菌素試驗皆為陽性者，即可報告被檢樣品中檢出綠膿桿菌；如綠膿菌素試驗陰性而液化明膠、硝酸鹽還原產氣和42c生長試驗三者皆為陽性時，仍可報告被檢樣品中檢出綠膿桿菌。五、金黃色葡萄球菌StaphylococcusAureus1范圍本規范規定了化妝品中金黃金色葡萄球菌的檢驗方法。本規范適用于化妝品中金黃色葡萄球菌的檢驗。

25、2定義本規范采用下列定義金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)為革蘭氏陽性球菌，呈葡萄狀排列,無芽胞，無莢膜，能分解甘露醇，血漿凝固酶陽性。該菌是葡萄球菌中對人類致病力最強的一種，能引起人體局部化膿性病灶，嚴重時可導致敗血癥。3儀器和設備顯微鏡。恒溫培養箱。離心機。刻度吸管：1mL、5mL10mL試管。載玻片。酒精燈。4培養基和試劑SCDLP液體培養基見總則中。4.2BairdParker氏培養基成分：胰蛋白月東10g牛肉膏5g酵母浸膏1g丙酮酸鈉10g氯化鋰(LiCl6HO)5g瓊脂20g蒸儲水950mLpH增菌劑的配制：30%黃鹽水50mL與除菌過濾的1燉硫酸鉀溶液10

26、mL混合，保存于冰箱內。制法：將各成分加到蒸儲水中，加熱煮沸完全溶解，校正pH。分裝每瓶95mL高壓滅菌15min。臨用時加熱溶化瓊脂培養基，每95mL加入預熱至50c的卵黃亞硫酸鉀增菌劑5mL搖勻后制成平板。培養基應是致密不透明的。使用前在冰箱貯存不得超過48h0血瓊脂培養基成分：營養瓊脂100mL脫纖維羊血（或兔血）10mL制法：將營養瓊脂加熱融化，待冷至50c左右無菌操作加入脫纖維羊血，搖勻，制成平板，置冰箱內備用。甘露醇發酵培養基成分：蛋白月東10g氯化鈉5g甘露醇10g牛肉膏5g%麝香草酚藍溶液12mL蒸儲水1000mL制法：將蛋白月東、氯化鈉、牛肉膏加到蒸儲水中，加熱溶解，調，加入

27、甘露醇和指示劑，混勻后分裝試管中，（10lb）20min滅菌備用。兔（人）血漿制備取%檸檬酸鈉溶液，（15lb）30min高壓滅菌，1份加兔（人）全血4份，混勻靜置；2000rpm3000rpm離心3min5min。血球下沉，取上面血漿。4.6無菌液體石蠟。5操作步驟增菌：取1:10稀釋的樣品10mL接種到90mLSCDLP夜體培養基中，置37c培養箱，培養24ho分離：自上述增菌培養液中，取12接種環，劃線接種在BairdParker平板，如無此培養基也可劃線接種到血瓊脂平板，置37c培養24h48h。在血瓊脂平板上菌落呈金黃色，大而突起，圓形，不透明，表面光滑，周圍有溶血圈。在BairdP

28、arker平板上為圓形，光滑，凸起，濕潤，直徑為2mnr3mm顏色呈灰色到黑色，邊緣為淡色，周圍為一混濁帶，在其外層有一透明帶。用接種針接觸菌落似有奶油樹膠的軟度。偶然會遇到非脂肪溶解的類似菌落，但無混濁帶及透明帶。挑取單個菌落分純在血瓊脂平板上，置37c培養24h0染色鏡檢：挑取分純菌落，涂片，進行革蘭氏染色，鏡檢。金黃色葡萄球菌為革蘭氏陽性菌，排列成葡萄狀，無芽胞，無夾膜，致病性葡萄球菌，菌體較小，直徑約為dm1dmt甘露醇發酵試驗：取上述分純菌落接種到甘露醇發酵培養基中，在培養基液面上加入2mnr3mm的滅菌液體石蠟，置37c培養24h,金黃色葡萄球菌應能發酵甘露醇產酸。血漿凝固酶試驗：吸取1:4新鮮血漿，放入滅菌小試管中，加入待檢菌24h肉湯培養物。混勻，放37c恒溫箱或恒溫水浴中，每半小時觀察一次，6h之內如呈現凝塊即為陽性。同時以已知血漿凝固酶陽性和陰性菌株肉湯培養物及肉湯培養基各，分別加入滅菌1:4血漿，混勻，作為對照