1、生化制品中葡萄糖、蔗糖、麥芽糖含量的測定 液相色譜示差折光檢驗法編 制 說 明成都大學中藥化學實驗室2011年6月目 錄一、研究背景1二、任務來源1三、標準編制原則和依據1四、標準主要內容確定依據及主要技術路線21. 標準主要內容確定依據22. 主要技術路線2五、分析條件的選擇和優化21. 樣品前處理條件的選擇22. 儀器分析條件的選擇33. 方法特性說明34. 方法再現性145. 穩定性試驗146 生化制品中葡萄糖、蔗糖、麥芽糖含量的檢測結果15六、其他情況說明161. 采用國際標準的程度及對比情況162. 與有關的現行法律、法規和強制性國家標準的關系163. 重大分歧意見的處理經過和依據1

2、64. 國家標準作為強制性國家標準或推薦性標準的建議165. 貫徹國家標準的要求和措施建議（包括組織措施、技術措施、過渡辦法等內容）176. 廢止現行有關標準的建議17一、研究背景目前，市場上含糖胃蛋白酶、靜脈注射用人免疫球蛋白、人狂犬病免疫球蛋白等生化制品已經廣泛應用、生產廠家眾多，但還沒有一個檢測其中葡萄糖、蔗糖、麥芽糖含量的國家標準。重要的是這些生化制品涉及人體健康安全，糖的含量高低對制品的功效有直接影響。所以，制定生化制品中葡萄糖、蔗糖、麥芽糖含量測定方法的國家標準是十分必要的。該標準涉及到人體健康安全，一定會受到用戶和消費者的歡迎，對增強企業產品在市場的競爭力，提高企業的整體水平，具

3、有積極的意義。二、任務來源本標準是采用液相色譜示差折光檢驗法測定生化制品中葡萄糖、蔗糖、麥芽糖含量方法的首次制定。本標準系2009年第二批國家標準制修訂計劃，編號為20091323-T-469，本標準由全國生化檢測標準化技術委員會（SAC/TC 387）歸口，由成都大學中藥化學實驗室和中國測試技術研究院承擔研究和起草工作。三、標準編制原則和依據標準編制遵循“統一性、協調性、適用性、一致性、規范性”的原則，盡可能與國際通行標準接軌，注重標準的可操作性，本標準嚴格按照GB/T 1.12009 標準化工作導則 第1部分：標準的結構和編寫規則、GB/T 20001.42001 標準編寫規則：化學分析方

4、法、GB/T 6379.22004/ISO 5725.21994 測量方法與結果的準確度(正確度與精密度) 第2部分 確定標準測量方法重復性與再現性的基本方法、JJF 1135 2005 化學分析測量不確定度評定的規定進行編寫和表述。四、標準主要內容確定依據及主要技術路線1. 標準主要內容確定依據標準編制組收集了大量國內外相關資料，先后查詢了國內外相關法律法規和標準方法，確定了液相色譜示差折光檢驗法檢測的技術路線，同時檢測了大量的不同類別的生物制品，獲得了第一手數據，通過數據分析整理，為本方法的確定打下了堅實的基礎。2. 主要技術路線（1）不含蛋白質的樣品取一定量的樣品用流動相溶解并定容0.4

5、5 µm 濾膜過濾示差折光液相色譜儀檢測（外標法定量）（2）含蛋白質的樣品取一定量的樣品用去離子水溶解沸水浴加熱冷卻離心流動相定容0.45 µm 濾膜過濾示差折光液相色譜儀檢測（外標法定量）五、分析條件的選擇和優化1. 樣品前處理條件的選擇1.1 不含蛋白質樣品的制備固體試樣：從研磨成粉末的混勻試樣中精確稱取試料0.5 g，準確至0.000 1 g，溶解后置于50 mL 容量瓶中；液體試樣：從試樣中準確移取試料1.00 mL，置于50 mL容量瓶中。上述溶液加體積分數40 % 乙腈水溶液定容至刻度，搖勻，用0.45 µm 濾膜過濾。1.2 含蛋白質樣品的制備固體試

6、樣：從研磨成粉末的混勻試樣中精確稱量試料0.5 g，準確至0.000 1 g，加水10 mL 溶解；液體試樣：從試樣中準確移取試料1.00 mL，加水 10 mL稀釋。將上述溶液轉移到試管中于沸水浴中加熱 10 min。冷卻后10 000 r/min離心10 min，上清液轉移至50 mL容量瓶中，加體積分數40 % 乙腈水溶液定容至刻度，搖勻，制成為試料溶液。2. 儀器分析條件的選擇本試驗采用高效液相色譜示差折光法（HPLC-RI）進行分析。參考色譜條件：色譜柱：Sugar D（5µm，4.6 ×250mm）；氨基柱（5µm，4.6 ×250mm）流動

7、相：乙睛+水(78:22)；流量：1.0 mL/min；柱溫：30 ；檢測池溫度：35 ；進樣量：20 µL。3. 方法特性說明3.1 線性范圍分別精確移取 50 mg/mL 的三種糖的標準溶液 0.5，1.0，2.5，5，7.5，10 mL于 50 mL 容量瓶中用體積分數40%乙腈水溶液定容。配成 0.5，1.0，2.5，5.0，7.5，10 mg/mL 的三種糖的混合溶液。分別精密進樣20µL，測定3個糖的峰面積，數據見表1。表1 葡萄糖、蔗糖、麥芽糖線性范圍考察數據濃度 (mg/mL)進樣量（ng）0.5101.0202.5505.01007.515010.0200

8、峰面積葡萄糖蔗糖麥芽糖107984316890844283526816971312757301171280067759761401690349020966657631030947613385908637099106176929217335533784885667611222080 以樣品濃度為橫坐標，糖峰面積為縱坐標作圖，見圖1。各糖回歸方程見表2。實驗結果表明，在實驗線性范圍內各物質呈線性響應。雖然各物質的相關系數均大于0.999，但作為化學分析方法具有許多不確定因素，基于分析方法標準化的考慮，規定各物質的線性擬合的相關系數不小于0.999。 圖1 葡萄糖、蔗糖、麥芽糖的標準曲線表2 葡萄糖

9、、蔗糖、麥芽糖線性關系項目標準曲線方程相關系數 r范圍mg/mLng葡萄糖y = 1694664.0 x + 33146.20.999 50.510.010200蔗糖y = 1337306.0x + 98402.10.999 70.510.010200麥芽糖y = 1136126.5 x + 20965.00.999 10.510.0102003.2 回收率參照GB/T 5009.1-2003附錄A中A.4.2進行回收率實驗。具體如下：選取同時含有葡萄糖、蔗糖的復方胃蛋白酶顆粒2#樣品和含有麥芽糖的靜脈注射用人免疫球蛋白1#樣品，按樣品:標樣質量比為1:1、0.8:1、1.2:1的比例加入葡萄

10、糖、蔗糖標準品，結果見表3、表4、表5。其中糖含量的測定值為X0，加入標準物質的量為m，加標后試樣中各組分的測定值為Xi。各物質回收率Pi按式（1）計算：表 3 復方胃蛋白酶顆粒2#葡萄糖回收率試驗結果進樣序號樣品含量 X0/mg加入量 m/mg測得量Xi/mg回收率 /%1（0.8:1）47.8035 .0081.8597.32（0.8 :1）35.0081.7096.83（0.8 :1）35.0081.7096.94（1:1）45.0094.46103.75（1:1）45.0091.8697.96（1:1）45.0090.7595.47（1.2:1）55.00101.2797.28（1.2

11、:1）55.00100.6096.09 (1.2:1 )55.0099.6994.3表 4 復方胃蛋白酶顆粒2#蔗糖回收率試驗結果進樣序號樣品含量 X0/mg加入量 m/mg測得量Xi/mg回收率 /%1（0.8:1）78.2660.00140.46103.72（0.8 :1）60.00140.90104.43（0.8 :1）60.00137.1298.14（1:1）75.00154.71101.95（1:1）75.00154.30101.46（1:1）75.00151.2497.37（1.2:1）90.00173.29105.68（1.2:1）90.00173.56105.99 (1.2:1

12、 )90.00171.07103.1表 5 靜脈注射用人免疫球蛋白1#麥芽糖回收率試驗結果進樣序號樣品含量 X0/mg加入量 m/mg測得量Xi/mg回收率 /%1（0.8:1）58.3246.00103.7198.72（0.8 :1）46.00104.56100.53（0.8 :1）46.00106.32104.44（1:1）58.00117.49102.05（1:1）58.00116.2299.86（1:1）58.00119.18104.97（1.2:1）70.00129.21101.38（1.2:1）70.00129.43101.69 (1.2:1 )70.00130.01102.43.

13、3 檢出限參照GB/T 5009.1-2003附錄A中A.2.1規定，把三倍空白值的標準偏差（測定次數n20）相對應的質量或濃度稱為檢出限。設：色譜儀最低響應值為S=3 N（N是儀器噪音水平）。則檢出限按式（2）進行計算：其中：b標準曲線回歸方程中的斜率，響應值/ug或響應值/ngS儀器噪音的3 倍，即儀器能辨認的最小的物質的信號。本法進流動相20 L，測得色譜噪聲值用峰高表示約0.05 uRIU （見圖2），標準方法對葡萄糖、蔗糖、麥芽糖的檢出限見表5，約為0.15 g/L。然而，考慮到本標準是用于產品分析，分析的樣品如有添加，其含量遠遠大于此檢出限，故本標準不予規定檢出限值。圖2 儀器噪聲

14、值表5 葡萄糖、蔗糖、麥芽糖檢測的方法檢出限項目Sb檢出限 g/L葡萄糖0.1516946630.09蔗糖13373060.11麥芽糖11361260.133.4 重復性根據GB/T 14666-2003的規定，按照標準方法8.7進行，結果見表6：表6 葡萄糖、蔗糖、麥芽糖檢測的重復性項目測量值 mg/mLRSD /%1234567平均值葡萄糖2.5352.5142.5232.5682.6052.5592.5512.5501.20蔗糖2.6552.6362.6882.6762.7332.6592.6752.6671.37麥芽糖2.7112.6862.7802.7282.8032.7312.74

15、02.7311.713.5 方法擴展不確定度評定根據JJF 1135-2005 化學分析測量不確定度評定和GB/Z 22553-2010/ISO/TS 21748:2004 利用重復性、再現性和正確度的估計值評估測量不確定度的指南對標準方法進行不確定度評定。具體如下：3.5.1 糖儲備液及標準溶液配制過程引入的不確定度u（fs）3.5.1.1 糖儲備液配制引入的相對標準不確定度分量u(fsl)（1） 使用天平稱量引入的相對標準不確定度 天平的最大允許誤差為±0.2 mg，按均勻分布考慮，標準不確定度為： 考慮到稱取物質時需要二次獨立稱量，即一次為毛重，另一次為空重。所以天平校準引入的

16、不確定度： 對于萬分之一的分析天平，其標準不確定度約為0.05 mg 。即u1=0.05 mg，稱量的不確定度分量：合成得到稱量糖引入的相對標準不確定度：（2）糖標準品純度引入的相對標準不確定度查得糖的純度P為99.0%±0.05%，按均勻分布，得出：（3）定容過程中使用玻璃儀器引入的相對標準不確定度 100 mL容量瓶體積校準引入的相對標準不確定度100 mL容量瓶的容量允許差為±0.10 mL，則 溶液溫度引入的相對標準不確定度設溶液溫度為（20±3），水的膨脹系數為2.1×10-4-1，按均勻分布考慮，則：定容過程中使用玻璃儀器引入的相對標準不確定

17、度為：所以，合成配制糖儲備液引入的相對標準不確定度為：3.5.1.2 糖標準溶液配制引入的不確定度分量u(fs2)將配制好的標準儲備液，用10 mL分度吸量管將儲備液移入50 mL容量瓶中，配成質量濃度分別為0.5, 1.0, 2.5, 5.0, 7.5, 10.0 mg.mL-1的系列標準使用液。分度吸量管及容量瓶引入的不確定度分別由體積校準和使用溫度差異進行合成。計算結果同3.5.1.1（3），計算如下：（1） 體積校準引入的相對標準不確定度 10.00 mL分度移液管： 50 mL容量瓶： （2） 溶液溫度引入的相對標準不確定度10.00 mL分度移液管： 50 mL 容量瓶： 配制糖標

18、準溶液使用玻璃儀器引入的相對標準不確定度為：綜上所述，糖儲備液及標準溶液配制引起的不確定度為：3.5.2 線性回歸方程擬合引入的標準不確定度u(x)線性回歸方程擬合引入的標準不確定度采用A類不確定度評定方法進行評定，回歸直線的實驗標準差sR：（3）式中：yi各濃度點測得的峰面積； Xi各質量濃度點的濃度值； n回歸直線濃度點數。標準曲線擬合的標準不確定度計算公式為：（4）式中：n標準系列的點數； P測量樣品次數； 標準系列質量的平均值； m第一次樣品測定的濃度值。按前述方法繪制各糖的標準曲線，見表7。表7 標準曲線測定值濃度 (mg/mL)0.51.02.55.07.510.0峰面積葡萄糖蔗糖

19、麥芽糖107984316890844283526816971312757301171280067759761401690349020966657631030947613385908637099106176929217335533784885667611222080三種糖的線性回歸方程見表8。表8 三種糖的線性回歸方程項目標準曲線方程相關系數 rab葡萄糖y = 1694664.0 x + 33146.20.999533146.21694664.0蔗糖y = 1337306.0x + 98402.10.999798402.11337306.0麥芽糖y = 1136126.5 x + 20965.

20、00.999120965.01136126.5根據貝塞爾公式計算三種糖的標準曲線的剩余標準差：葡萄糖：蔗糖：麥芽糖：標準曲線擬合的標準不確定度：葡萄糖：蔗糖：麥芽糖：式中：n標準系列的點數n=6； p測量樣品的次數p=1； 標準系列質量濃度的平均值，=4.416 7mg/mL； m第一次測試樣品濃度，m1=2.535 mg/mL , m2=2.655 mg/mL , m3=2.711 mg/mL（見表9中1#數據）。所以，標準曲線擬合引入的相對標準不確定度分別為：葡萄糖：蔗糖：麥芽糖：3.5.3 重復性測量引入的標準不確定度u(s) 樣品測量重復性引入的不確定度采用A類不確定度評定方法進行評定

21、，對樣品進行7次平行測定結果見表9。表9樣品重復測定結果項目測量值 mg/mLRSD /%1234567平均值葡萄糖2.5352.5142.5232.5682.6052.5592.5512.5501.20蔗糖2.6552.6362.6882.6762.7332.6592.6752.6671.37麥芽糖2.7112.6862.7802.7282.8032.7312.7402.7311.71三種糖測量的標準差由貝塞爾公式計算：葡萄糖：蔗糖：麥芽糖：對樣品測定一次（n=1），見上述測量數據列中的1#數據，測量結果葡萄糖、蔗糖、麥芽糖分別為2.535 ，2.655 ，2.711 mg/mL，得到測量重

22、復性的相對標準不確定度：葡萄糖：蔗糖：麥芽糖：則合成不確定度：葡萄糖：蔗糖：麥芽糖：取包含因子k=2，則擴展不確定度分別為：葡萄糖：蔗糖： 麥芽糖：4. 方法再現性將成都大學中藥化學實驗室配制的2.50 mg/mL 的葡萄糖、蔗糖、麥芽糖標準溶液先后送至成都大學生物醫藥實驗教學中心儀器分析室、北京寶泰寧堂醫藥科技有限公司成都分公司、四川省質檢院、中國測試技術研究院等單位按照本標準方法進行分析，包括本課題組分析結果在內的實驗數據列于表10：表10 標準方法實驗室驗證數據組分中藥化學實驗室成都大學實驗教學中心寶泰寧堂省質檢院中測院復現性（%）/mg.mL-1/mg.mL-1/mg.mL-1/mg.

23、mL-1/mg.mL-1葡萄糖2.540 2.586 2.594 2.565 2.550 0.90蔗糖2.614 2.587 2.590 2.556 2.600 0.83麥芽糖2.539 2.520 2.592 2.545 2.540 1.05 分析結果表明，5個實驗室在各自重復性條件下的復現性不大于1.10%。5. 穩定性試驗5.1 標準品穩定性按標準溶液的配制方法制備溶液，每0，2，4，6，8，24 h 進樣一次，記錄峰面積，計算RSD，考察樣品的穩定性，結果見表11。表11 標準品穩定性試驗結果時間 /h0246824RSD(%)葡萄糖峰面積40844684059706408550941

24、27759414019041228780.76%蔗糖峰面積3848010381847038391463838956387620538823780.63%麥芽糖峰面積3622983358155435805563624533361913936197870.58%試驗數據表明，標準品溶液在室內常規放置24小時，三個糖峰的峰面積變化不大于（RSD<3%），不影響其含量測定的結果。5.2 樣品穩定性按供試液方法制備樣品溶液，每0，2，4，6，8，24 h 進樣一次，記錄峰面積，計算RSD，考察樣品的穩定性，結果見表12：表12 樣品穩定性試驗結果時間/h0246824RSD(%)胃蛋白酶片6708208669174167114486653730668523465472780.92胃蛋白酶口服液3946934395244740058114016445398437839553350.75復方胃蛋白酶顆粒6737905679018467318856815186683241668544930.74試驗數據表明，