1、活菌培養(yǎng)計數(shù)技術適用范圍測定細菌懸液、菌片、采樣液等樣本中含有活菌的數(shù)量。2.1.1.3.1 試驗器材（1）刻度吸管（1.0ml、5.0ml）。（2）稀釋液：見附錄A。（3）營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基：見附錄A。（4）電動混合器操作程序本規(guī)范要求在殺菌試驗中的活菌培養(yǎng)計數(shù)統(tǒng)一使用傾注法。其操作程序如下。（1）對菌懸液可直接進行培養(yǎng)計數(shù)。對菌片、采樣棉拭與小型固體樣本等，應將其上的細菌洗下成為菌懸液后進行培養(yǎng)計數(shù)。洗菌時，一般以稀釋液為洗液。具體方法如下:取含5.0ml稀釋液無菌試管，對菌片或小型固體樣本直接投入即可，對棉拭則將其采樣端剪入管內(nèi)，每管一份樣本。而后，用電動混合器混合20s（或在手掌上用力振敲

2、80次），將菌洗下形成菌懸液。以上操作應嚴格按無菌要求進行。（2）將試管按需要數(shù)量分組排列于試管架上，每管加入4.5ml稀釋液。各組由左向右，逐管標上10-1、10-2、10-3等。（3）將菌懸液樣本在用電動混合器混合20（s或在手掌上用力振敲80次），隨即吸取0.5ml加至10-1管內(nèi)。(4) 將10-1管依前法用電動混合器混合20s(或在手掌上用力振敲80次)，混勻，再吸取出0.5ml加入10-2管內(nèi)。如此類推，直至最后一管。必要時，還可作某稀釋度的1:1或1:4稀釋。(5) 選擇適宜稀釋度試管(以預計生長菌落數(shù)每平板為15cfu300cfu者為宜)，吸取其中混合均勻的懸液1.0ml加于無

3、菌平皿內(nèi)。每一稀釋度接種3個平皿。一般需接種2個3個不同稀釋度。平皿加樣前，應先按組編號，以免弄混。(6) 將冷至40C45C的熔化營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，傾注于已加入樣液的平皿中，每平皿15ml20ml。(7) 將平皿蓋好，即刻輕輕搖動混勻，平放于臺上。待瓊脂凝固后，翻轉(zhuǎn)平皿，使底向上，置37C溫箱內(nèi)培養(yǎng)。(8) 每日觀察細菌生長情況。培養(yǎng)至規(guī)定時間(細菌繁殖體為48h，白色念珠菌與細菌芽孢為72h)，計數(shù)最終結果的菌落數(shù)。(9) 對菌片和采樣棉拭洗液的活菌培養(yǎng)計數(shù)，先按各試驗要求處理(如去除殘留消毒劑等)，而后取其最終樣液按上法進行培養(yǎng)計數(shù)。(10)計數(shù)菌落時，一般以肉眼觀察，必要時用放大鏡檢查。

4、以菌落數(shù)在15cfu300cfu的平板為準，每個稀釋度3個平板生長菌落數(shù)全合乎上述標準，則以該3個平板的菌落平均值作為結果；若有2個符合上述標準，則以該合格的兩個平板菌落的平均值為結果。但對黑曲霉菌活菌計數(shù)及殺滅試驗時，平板菌落數(shù)應在15cfu100cfu之間對估計菌量極少的樣本(如消毒處理后樣本)，在培養(yǎng)計數(shù)時可不作稀釋，即使平板菌落數(shù)未達15時，亦可用其計算最終結果。將求得的平均菌落值，再乘以稀釋倍數(shù)，即得每毫升原樣液中的菌量。菌量單位為cfu。2.1.1.3.2 活菌計數(shù)中技術操作誤差的測定試驗者在活菌計數(shù)中因技術操作而引起的菌落數(shù)誤差率（平板間、稀釋度間）不宜超過10%。對誤差率的自檢

5、，可按以下公式計算。（1）平板間誤差率計算公式：2）稀釋度間誤差率計算公式：2.1.1.3.3 注意事項（1）嚴格無菌操作，防止污染。（2）認真檢查試驗器材有無破損（要特別注意試管底的裂痕和破洞）以防丟失樣本和污染環(huán)境。（3）注意菌液的均勻分散。（4）稀釋或取液時要準確，盡量減少吸管使用中產(chǎn)生的誤差。（5）每吸取一個稀釋度樣液，必須更換一支吸管，以減少誤差。(6) 樣液接種于平皿后應盡快傾注營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，避免樣液干燥于平皿上，影響結果的準確性。(7) 傾注時瓊脂培養(yǎng)基溫度不得超過45C，以防損傷細菌或真菌。傾注和搖動時，動作應盡量平穩(wěn)，以利細菌分散均勻，便于計數(shù)菌落。勿使培養(yǎng)基外溢，以免影響結果的準確性和造成環(huán)境的污染。(8)為提高試驗成功率，最好先用濁度計對原菌液含菌