1、分子生物學常見試題.txt老子忽悠孩子叫教育，孩子忽悠老子叫欺騙，互相忽悠叫代溝。男人這花花世界，我要用什么顏色來吸引你。分子生物學常見試題一, 名詞解釋1, 基因:能夠表達和產(chǎn)生蛋白質和RNA的DNA序列,是決定遺傳性狀的功能單位.2, 基因組:細胞或生物體的一套完整單倍體的遺傳物質的總和.3, 端粒:以線性染色體形式存在的真核基因組DNA末端都有一種特殊的結構叫端粒.該結構<br>是一段DNA序列和蛋白質形成的一種復合體,僅在真核細胞染色體末端存在.4, 操縱子:是指數(shù)個功能上相關的結構基因串聯(lián)在一起,構成信息區(qū),連同其上游的調控區(qū)(包括啟動子和操縱基因)以及下游的轉錄終止信號

2、所構成的基因表達單位,所轉錄的RNA為多順反子.5, 順式作用元件:是指那些與結構基因表達調控相關,能夠被基因調控蛋白特異性識別和結合的特異DNA序列.包括啟動子,上游啟動子元件,增強子,加尾信號和一些反應元件等.6, 反式作用因子:是指真核細胞內含有的大量可以通過直接或間接結合順式作用元件而調節(jié)基因轉錄活性的蛋白質因子.7, 啟動子:是RNA聚合酶特異性識別和結合的DNA序列.8, 增強子:位于真核基因中遠離轉錄起始點,能明顯增強啟動子轉錄效率的特殊DNA序列.它可位于被增強的轉錄基因的上游或下游,也可相距靶基因較遠.9, 基因表達:是指生物基因組中結構基因所攜帶的遺傳信息經(jīng)過轉錄,翻譯等一

3、系列過程,合成特定的蛋白質,進而發(fā)揮其特定的生物學功能和生物學效應的全過程.10, 信息分子:調節(jié)細胞生命活動的化學物質.其中由細胞分泌的調節(jié)靶細胞生命活動的化學物質稱為細胞間信息分子;而在細胞內傳遞信息調控信號的化學物質稱為細胞內信息分子.11, 受體:是存在于靶細胞膜上或細胞內能特異識別生物活性分子并與之結合,進而發(fā)生生物學效應的的特殊蛋白質.12, 分子克隆:在體外對DNA分子按照即定目的和方案進行人工重組,將重組分子導入合適宿主,使其在宿主中擴增和繁殖,以獲得該DNA分子的大量拷貝.13, 蛋白激酶:是指能夠將磷酸集團從磷酸供體分子轉移到底物蛋白的氨基酸受體上的一大類酶.14, 蛋白磷

4、酸酶:是具有催化已經(jīng)磷酸化的蛋白質分子發(fā)生去磷酸化反應的一類酶分子,與蛋白激酶相對應存在,共同構成了磷酸化和去磷酸化這一重要的蛋白質活性的開關系統(tǒng).15, 基因工程:有目的的通過分子克隆技術,人為的操作改造基因,改變生物遺傳性狀的系列過程.16, 載體:能在連接酶的作用下和外源DN*段連接并運送DNA分子進入受體細胞的DNA分子.17, 轉化:指質粒DNA或以它為載體構建的重組DNA導入細菌的過程.18, 感染:以噬菌體,粘性質粒和真核細胞病毒為載體的重組DNA分子,在體外經(jīng)過包裝成具有感染能力的病毒或噬菌體顆粒,才能感染適當?shù)募毎?并在細胞內擴增.19, 轉導:指以噬菌體為載體,在細菌之間轉

5、移DNA的過程,有時也指在真核細胞之間通過逆轉錄病毒轉移和獲得細胞DNA的過程.20, 轉染:指病毒或以它為載體構建的重組子導入真核細胞的過程.21, DNA變性:在物理或化學因素的作用下,導致兩條DNA鏈之間的氫鍵斷裂,而核酸分子中的所有共價鍵則不受影響.22, DNA復性:當促使變性的因素解除后,兩條DNA鏈又可以通過堿基互補配對結合形成DNA雙螺旋結構.23, 退火:指將溫度降至引物的TM值左右或以下,引物與DNA摸板互補區(qū)域結合形成雜交鏈.24, 筑巢PCR:先用一對外側引物擴增含目的基因的大片段,再用內側引物以大片段為摸板擴增獲取目的基因.可以提高PCR的效率和特異性.25, 原位P

6、CR:以組織固定處理細胞內的DNA或RNA作為靶序列,進行PCR反應的過程.26, 定量PCR:基因表達涉及的轉錄水平的研究常需要對mRNA進行定量測定,對此采用的PCR技術就叫定量PCR.27, 基因打靶:是指通過DNA定點同源重組,改變基因組中的某一特定基因,從而在生物活體內研究此基因的功能.28, DNA芯片NA芯片技術是指在固相支持物上原位合成寡核苷酸或者直接將大量的DNA探針以顯微打印的方式有序地固化于支持物表面,然后與標記的樣品雜交,通過對雜交信號的檢測析,即可獲得樣品的遺傳信息.由于常用計算機硅芯片作為固相支持物,所以稱為DNA芯片.29, 錯義突變:DNA分子中堿基對的取代,使

7、得mRNA的某一密碼子發(fā)生變化,由它所編碼的氨基酸就變成另一種的氨基酸,使得多肽鏈中的氨基酸順序也相應的發(fā)生改變的突變.30, 無義突變:由于堿基對的取代,使原來可以翻譯某種氨基酸的密碼子變成了終止密碼子的突變.31, 同義突變:堿基對的取代并不都是引起錯義突變和翻譯終止,有時雖然有堿基被取代,但在蛋白質水平上沒有引起變化,氨基酸沒有被取代,這是因為突變后的密碼子和原來的密碼子代表同一個氨基酸的突變.32, 移碼突變:在編碼序列中,單個堿基,數(shù)個堿基的缺失或插入以及片段的缺失或插入等均可以使突變位點之后的三聯(lián)體密碼閱讀框發(fā)生改變,不能編碼原來的蛋白質的突變.33, 癌基因:是細胞內控制細胞生長

8、的基因,具有潛在的誘導細胞惡性轉化的特性.當癌基因結構或表達發(fā)生異常時,其產(chǎn)物可使細胞無限制增殖,導致腫瘤的發(fā)生.包括病毒癌基因和細胞癌基因.34, 細胞癌基因:存在于正常的細胞基因組中,與病毒癌基因有同源序列,具有促進正常細胞生長,增殖,分化和發(fā)育等生理功能.在正常細胞內未激活的細胞癌基因叫原癌基因,當其受到某些條件激活時,結構和表達發(fā)生異常,能使細胞發(fā)生惡性轉化.35, 病毒癌基因:存在于病毒(大多是逆轉錄病毒)基因組中能使靶細胞發(fā)生惡性轉化的基因.它不編碼病毒結構成分,對病毒無復制作用,但是當受到外界的條件激活時可產(chǎn)生誘導腫瘤發(fā)生的作用.36, 基因診斷:以DNA或RNA為診斷材料,通過

9、檢查基因的存在,結構缺陷或表達異常,對人體的狀態(tài)和疾病作出診斷的方法和過程.37, RFLP:即限制性片段長度多態(tài)性,個體之間DNA的核苷酸序列存在差異,稱為DNA多態(tài)性.若因此而改變了限制性內切酶的酶切位點則可導致相應的限制性片段的長度和數(shù)量發(fā)生變化,稱為RFLP.38, 基因治療:一般是指將限定的遺傳物質轉入患者特定的靶細胞,以最終達到預防或改變特殊疾病狀態(tài)為目的治療方法.39, 反義RNA:堿基序列正好與有意義的mRNA互補的RNA稱為反義RNA.可以作為一種調控特定基因表達的手段.40, 核酶:是一種可以催化RNA切割和RNA剪接反應的由RNA組成的酶,可以作為基因表達和病毒復制的抑制

10、劑.41, 三鏈DNA:當某一DNA或RNA寡核苷酸與DNA高嘌呤區(qū)可結合形成三鏈,能特異地結合在DNA的大溝中,并與富含嘌呤鏈上的堿基形成氫鍵.42, SSCP:單鏈構象多態(tài)性檢測是一種基于DNA構象差別來檢測點突變的方法.相同長度的單鏈DNA,如果堿基序列不同,形成的構象就不同,這樣就形成了單鏈構象多態(tài)性.43, 管家基因:在生物體生命的全過程都是必須的,且在一個生物個體的幾乎所有細胞中持續(xù)表達的基因.44, 細胞全能性:指同一種生物的所有細胞都含有相同的DNA,即基因的數(shù)目和種類是一樣的,但在不同階段,同一個體的不同組織和器官中基因表達的種類和數(shù)目是不同的.45, SD序列:轉錄出的mR

11、NA要進入核糖體上進行翻譯,需要一段富含嘌呤的核苷酸序列與大腸桿菌16S rRNA3,末端富含嘧啶的序列互補,是核糖體的識別位點.46, 反義核酸技術:是通過合成一種短鏈且與DNA或RNA互補的,以DNA或RNA為目標抑制翻譯的反義分子,干擾目的基因的轉錄,剪接,轉運,翻譯等過程的技術.47, 核酸探針:探針是指能與某種大分子發(fā)生特異性相互作用,并在相互作用之后可以檢測出來的生物大分子.核酸探針是指能識別特異堿基順序的帶有標記的一段DNA或RNA分子.48, 周期蛋白:是一類呈細胞周期特異性或時相性表達,累積與分解的蛋白質,它與周期素依賴性激酶共同影響細胞周期的運行.49, CAP:是大腸桿菌

12、分解代謝物基因活化蛋白,這種蛋白可將葡萄糖饑餓信號傳遞個許多操縱子,使細菌在缺乏葡萄糖時可以利用其他碳源.50, 順反子51, 結構域二, 問答題(一),病毒,原核,真核基因組的特點答:1,病毒基因組的特點: 種類單一;單倍體基因組:每個基因組在病毒中只出現(xiàn)一次;形式多樣;大小不一;基因重疊;動物/細菌病毒與真核/原核基因相似:內含子;具有不規(guī)則的結構基因;基因編碼區(qū)無間隔:通過宿主及病毒本身酶切;無帽狀結構;結構基因沒有翻譯起始序列.2,原核基因組的特點:為一條環(huán)狀雙鏈DNA;只有一個復制起點;具有操縱子結構;絕大部分為單拷貝;可表達基因約50%,大于真核生物小于病毒;基因一般是連續(xù)的,無內

13、含子;重復序列很少.3,真核基因組的特點:真核生物基因組遠大于原核生物基因組,結構復雜,基因數(shù)龐大,具有多個復制起點;基因組DNA與蛋白質結合成染色體,儲存于細胞核內;真核基因為單順反子,而細菌和病毒的結構基因多為多順反子;基因組中非編碼區(qū)多于編碼區(qū);真核基因多為不連續(xù)的斷裂基因,由外顯子和內含子鑲嵌而成;存在大量的重復序列;功能相關的基因構成各種基因家族;存在可移動的遺傳因素;體細胞為雙倍體,而精子和卵子為單倍體.(二),乳糖操縱子的作用機制答:1,乳糖操縱子的組成:大腸桿菌乳糖操縱子含Z,Y,A三個結構基因,分別編碼半乳糖苷酶,透酶和半乳糖苷乙酰轉移酶,此外還有一個操縱序列O,一個啟動子P

14、和一個調節(jié)基因I.2,阻遏蛋白的負性調節(jié):沒有乳糖存在時,I基因編碼的阻遏蛋白結合于操縱序列O處,乳糖操縱子處于阻遏狀態(tài),不能合成分解乳糖的三種酶;有乳糖存在時,乳糖作為誘導物誘導阻遏蛋白變構,不能結合于操縱序列,乳糖操縱子被誘導開放合成分解乳糖的三種酶.所以,乳糖操縱子的這種調控機制為可誘導的負調控.3,CAP的正性調節(jié):在啟動子上游有CAP結合位點,當大腸桿菌從以葡萄糖為碳源的環(huán)境轉變?yōu)橐匀樘菫樘荚吹沫h(huán)境時,cAMP濃度升高,與CAP結合,使CAP發(fā)生變構,CAP結合于乳糖操縱子啟動序列附近的CAP結合位點,激活RNA聚合酶活性,促進結構基因轉錄,調節(jié)蛋白結合于操縱子后促進結構基因的轉錄,

15、對乳糖操縱子實行正調控,加速合成分解乳糖的三種酶.4,協(xié)調調節(jié):乳糖操縱子中的I基因編碼的阻遏蛋白的負調控與CAP的正調控兩種機制,互相協(xié)調,互相制約.(三),真核生物轉錄水平的調控機制答:真核生物在轉錄水平的調控主要是通過反式作用因子,順式作用元件和RNA聚合酶的相互作用來完成的,主要是反式作用因子結合順式作用元件后影響轉錄起始復合物的形成過程.1, 轉錄起始復合物的形成:真核生物RNA聚合酶識別的是由通用轉錄因子與DNA形成的蛋白質-DNA復合物,只有當一個或多個轉錄因子結合到DNA上,形成有功能的啟動子,才能被RNA聚合酶所識別并結合.轉錄起始復合物的形成過程為:TFD結合TATA盒;R

16、NA聚合酶識別并結合TFD-DNA復合物形成一個閉合的復合物;其他轉錄因子與RNA聚合酶結合形成一個開放復合物.在這個過程中,反式作用因子的作用是:促進或抑制TFD與TATA盒結合;促進或抑制RNA聚合酶與TFD-DNA復合物的結合;促進或抑制轉錄起始復合物的形成.2, 反式作用因子:一般具有三個功能域(DNA識別結合域,轉錄活性域和結合其他蛋白結合域);能識別并結合上游調控區(qū)中的順式作用元件;對基因的表達有正性或負性調控作用.3, 轉錄起始的調控:反式作用因子的活性調節(jié):表達式調節(jié)反式作用因子合成出來就具有活性;共價修飾磷酸化和去磷酸化,糖基化;配體結合許多激素受體是反式作用因子;蛋白質與蛋

17、白質相互作用蛋白質與蛋白質復合物的解離與形成.反式作用因子與順式作用元件的結合:反式作用因子被激活后,即可識別并結合上游啟動子元件和增強子中的保守性序列,對基因轉錄起調節(jié)作用.反式作用因子的作用方式成環(huán),扭曲,滑動,Oozing.反式作用因子的組合式調控作用:每一種反式作用因子結合順式作用元件后雖然可以發(fā)揮促進或抑制作用,但反式作用因子對基因調控不是由單一因子完成的而是幾種因子組合發(fā)揮特定的作用.(四),真核生物轉錄后水平的調控機制答1),5,端加帽和3,端多聚腺苷酸化的調控意義:5,端加帽和3,端多聚腺苷酸化是保持mRNA穩(wěn)定的一個重要因素,它至少保證mRNA在轉錄過程中不被降解.(2),m

18、RNA選擇性剪接對基因表達調控的作用(3),mRNA運輸?shù)目刂?五),受體的特點答:1,高度專一性;2,高度親和性;3,可逆性;4,可飽和性;5,特定的作用模式(六),表皮生長因子介導的信號傳導途徑答:表皮生長因子受體是一個典型的蛋白酪氨酸激酶受體,這個信號轉導途徑的主要步驟是:1, 受體二聚化的形成及其磷酸化:表皮生長因子與受體的結合使受體發(fā)生二聚化,從而改變受體構象,使蛋白酪氨酸激酶活性增強,受體自身的幾個蛋白酪氨酸殘基在激酶的作用下發(fā)生磷酸化.2, 募集接頭蛋白Grb2:表皮生長因子受體自身被磷酸化后,不僅其激酶活性增強,而且其構象發(fā)生變化,從而適合與含SH2結構域的蛋白分子相結合.Gr

19、b2是作為接頭蛋白結合到受體上.3, 調控分子SOS的活化:SOS含有可與SH3結構域相結合的富含脯氨酸基序,當Grb2結合到磷酸化的表皮生長因子受體后,它的兩個SH3結構域即可結合SOS,使之活化.4, 低分子量G蛋白Ras的活化:SOS可促進Ras釋放GDP,結合GTP的反應,使Ras激活.活化的Ras作用其下游分子Raf,使之活化.Raf是MAPK級聯(lián)反應的第一個分子,由此啟動了MAPK的三級激活過程.5, MAPK的級聯(lián)激活:Raf是一種MAPKKK,它作用于MEK,使之磷酸化而激活,活化的MEK在作用于MAPK家族的ERK1,使之磷酸化激活由此完成了三級激活.6, 轉錄因子的磷酸化及

20、轉錄調控作用:活化的ERK可以轉至細胞核內,使某些轉錄調控因子發(fā)生磷酸化,從而影響基因的轉錄.(七),cAMP信號轉導途徑答:1,組成:胞外信息分子(主要是胰高血糖素,腎上腺素和促腎上腺皮質激素),受體,G蛋白,AC,cAMP , PKA.2,途徑:信號分子與受體結合,引起受體構象變化受體活化G蛋白活化后的G蛋白激活腺苷酸環(huán)化酶(AC)AC 催化ATP生成cAMPcAMP 活化PKA,PKA使目標蛋白磷酸化,調節(jié)代謝酶的活性或調節(jié)基因的表達(八),IP3-Ca2+信號途徑:信號分子與受體結合,引起受體構象變化受體活化G蛋白活化后的G蛋白激活PLCPLC 水解PIP2生成IP3 和DGIP3 使

21、鈣通道打開,細胞內Ca2+升高Ca2+ 與CaM結合,激活Ca2+-CaM依賴的蛋白激酶Ca2+ -CaM依賴的蛋白激酶使目標蛋白磷酸化.(九),分子克隆中常用的工具酶及良好載體的條件答:(1),常用的工具酶1, 限制性核酸內切酶:是細菌產(chǎn)生的一類能識別和切割雙鏈DNA分子內特定的堿基順序的核酸水解酶.2, DNA連接酶:將兩段DNA分子拼接起來的酶.3, DNA聚合酶:催化單核苷酸鏈延伸.4, 逆轉錄酶:依賴于RNA的DNA聚合酶,這是一種有效的轉錄RNA成為DNA的酶,產(chǎn)物DNA又稱互補DNA.5, 末端脫氧核糖核酸轉移酶:將脫氧核糖核酸加到DNA的3末端.6, 堿性磷酸酶:催化去除DNA

22、,RNA等的5磷酸基團.7, 依賴DNA的RNA聚合酶:識別特異性啟動子,RNA轉錄.(2),良好載體的條件1,必須有自身的復制子;2,載體分子上必須有限制性核酸內切酶的酶切位點,即多克隆位點,以供外源DNA插入;3,載體應具有可供選擇的遺傳標志,以區(qū)別陽性重組子和陰性重組子;4,載體分子必須有足夠的容量;5,可通過特定的方法導入細胞;6,對于表達載體還應具備與宿主細胞相適應的啟動子,前導順序,增強子,加尾信號等DNA調控元件.(十),藍-白篩選的原理答:某些質粒帶有大腸桿菌的半乳糖苷酶基因片段,在半乳糖苷酶基因的基因區(qū)外又另外引入了一段含多種單一限制酶位點的DNA序列.這些位點上如果沒有克隆

23、外源性DN*段,在質粒被導入lac-的大腸桿菌后,質粒攜帶的半乳糖苷酶基因將正常表達,與大腸桿菌的半乳糖苷酶基因互補,產(chǎn)生有活性的半乳糖苷酶,加入人工底物X-gal和誘導劑IPTG后,出現(xiàn)藍色的菌落.如果在多克隆位點上插入外源DN*段,將使lac Z基因滅活,不能生成半乳糖苷酶,結果菌落出現(xiàn)白色.由于這種顏色標志,重組克隆和非重組克隆的區(qū)分一目了然.(十一)SANGER雙脫氧鏈終止法的原理答:DNA鏈中核苷酸以3',5'-磷酸二酯鍵連接,合成DNA所用的底物是 2'-脫氧核苷三磷酸.2',3'ddNTP與普通dNTP不同,它們在脫氧核糖的3'位置

24、缺少一個羥基.在DNA聚合酶作用下通過三磷酸基團摻入到延伸的DNA鏈中,但由于沒有3'羥基,不能同后續(xù)的dNTP形成磷酸二酯鍵,因此,正在延伸的DNA鏈不能繼續(xù)延伸.在DNA合成反應混合物的4種普通dNTP中加入少量的一種ddNTP,鏈延伸將與偶然發(fā)生但卻十分特異的鏈終止競爭,產(chǎn)物是一系列的核苷酸鏈,其長度取決于引物末端到出現(xiàn)過早鏈終止位置間的距離.在4組獨立酶反應中分別采用4種不同的ddNTP,結果將產(chǎn)生4組寡核苷酸,它們將分別終止于模板鏈的A,C,G或T位置.(十二),核酸分子雜交的原理答:具有互補序列的兩條單鏈核酸分子在一定的條件下(適宜的溫度及離子強度等)堿基互補配對結合,重新

25、形成雙鏈;在這一過程中,核酸分子經(jīng)歷了變性和復性的變化,以及在復性過程中個分子間鍵的形成和斷裂.雜交的雙方是待測核酸和已知序列.(十三),影響雜交的因素答:1,核酸分子的濃度和長度:核酸濃度越大,復性速度越快.探針長度應控制在50-300個堿基對為好.2,溫度:溫度過高不利于復性,而溫度過低,少數(shù)堿基配對形成的局部雙鏈不易解離,適宜的溫度是較TM值低25度.3,離子強度:在低離子強度下,核酸雜交非常緩慢,隨著離子強度的增加,雜交反應率增加.高濃度的鹽使堿基錯配的雜交體更穩(wěn)定,所以進行序列不完全同源的核酸分子雜交時必須維持雜交反應液中的鹽濃度和洗膜液中的鹽濃度.4,雜交液中的甲酰胺:甲酰胺能降低

26、核酸雜交的TM值.它有以下優(yōu)點:在低溫下探針更穩(wěn)定;能更好地保留非共價結合的核酸.5,核酸分子的復雜性:是指存在于反應體系中的不同順序的總長度.兩個不同基因組DNA變性后的相對雜交速率取決于樣品濃度絕對一致時的相對復雜性(即DNA中的堿基數(shù)).6,非特異性雜交反應:在雜交前應對非特異性雜交反應位點進行封閉,以減少其對探針的非特異性吸附作用.(十四),探針的種類和優(yōu)缺點答:1,cDNA探針:通過逆轉錄獲得cDNA后,將其克隆于適當?shù)目寺≥d體,通過擴增重組質粒而使cDNA得到大量的擴增.提取質粒后分離純化作為探針使用.它是目前應用最為廣泛的一種探針.2,基因組探針:從基因組文庫里篩選得到一個特定的

27、基因或基因片段的克隆后,大量擴增,純化,切取插入片段,分離純化為探針.3,寡核苷酸探針:根據(jù)已知的核酸順序,采用DNA合成儀合成一定長度的寡核苷酸片段作為探針.4,RNA探針:采用基因克隆和體外轉錄的方法可以得到RNA或反義RNA作為探針.(十五),探針的標記法答:1,缺口平移法:此法是利用適當濃度的DNase 在DNA雙鏈上隨機切割單鏈,造成單鏈切口.切口處產(chǎn)生一個5末端和3末端,3末端就可以作為引物,在大腸桿菌DNA聚合酶的催化下,以互補的DNA單鏈為摸板,依次將dNTP連接到切口的3末端的羥基上,合成新的DNA單鏈;同時DNA聚合酶的53的核酸外切酶活性在切口處將舊鏈從5末端逐步切除,新

28、合成鏈不斷延伸,從而使原DNA分子上的部分核苷酸殘基被標記的核苷酸所取代.2,隨機引物法:隨機引物是人工合成的長度為6個寡核苷酸殘基的寡聚核苷酸片段的混合物.對于任何一個用作探針的DN*段,隨機引物混合物中都會有一些六核苷酸片段可以與之結合,起到DNA合成引物的作用.將這些引物與變性的DNA單鏈結合后,以4種dNTP(其中一種是標記物標記的dNTP)為底物,合成與探針DNA互補的切帶有標記物的DNA探針.3,PCR標記法:在PCR反應底物中,將一種dNTP換成標記物標記的dNTP, 這樣標記的dNTP就在PCR反應的同時摻入到新合成的DNA鏈上.4,末端標記法:只是將DN*段的一端進行標記.(

29、十六),PCR的基本原理答CR是在試管中進行的DNA復制反應,基本原理是依據(jù)細胞內DNA半保留復制的機理,以及體外DNA分子于不同溫度下雙鏈和單鏈可以互相轉變的性質,人為地控制體外合成系統(tǒng)的溫度,以促使雙鏈DNA變成單鏈,單鏈DNA與人工合成的引物退火,然后耐熱DNA聚合酶以dNTP為原料使引物沿著單鏈模板延伸為雙鏈DNA.PCR全過程每一步的轉換是通過溫度的改變來控制的.需要重復進行DNA模板解鏈,引物與模板DNA結合,DNA聚合酶催化新生DNA的合成,即高溫變性,低溫退火,中溫延伸3個步驟構成PCR反應的一個循環(huán),此循環(huán)的反復進行,就可使目的DNA得以迅速擴增.DNA模板變性:模板雙鏈DN

30、A 單鏈DNA,94.退火:引物+單鏈DNA 雜交鏈,引物的Tm值.引物的延伸:溫度至70 左右, Taq DNA聚合酶以4種dNTP為原料,以目的DNA為模板,催化以引物3'末端為起點的5'3'DNA鏈延伸反應,形成新生DNA鏈.新合成的引物延伸鏈經(jīng)過變性后又可作為下一輪循環(huán)反應的模板PCR,就是如此反復循環(huán),使目的DNA得到高效快速擴增.(十七),PCR引物設計的基本要求答:1,引物長度一般為1530個核苷酸.過短影響PCR的特異性,過長會提高相應退火溫度,使延伸溫度超過TaqDNA聚合酶最適溫度74,影響產(chǎn)物的生成.2,引物的堿基盡可能隨機,避免出現(xiàn)嘌呤,嘧啶堿基

31、堆積現(xiàn)象.3'端不應有連續(xù)3個G和C.否則會使引物和模板錯誤配對.G+C含量一般占45% -55%.3'端和5'端引物具有相似的Tm值,Tm值計算公式:Tm=4(G+C)+ 2(A+T)3,引物自身不應存在互補序列以避免折疊成發(fā)夾結構.引物的連續(xù)互補序列,一般不超過3bp.4,兩個引物之間不應存在互補序列,尤其應避免3'端的互補重疊.5,引物與非特異擴增區(qū)的序列的同源性不超過70%,引物3'末端連續(xù)8個堿基在待擴增區(qū)以外不能有完全互補序列,否則易導致非特異性擴增.6,引物3'端堿基是引發(fā)延伸的起點,因此一定要與模板DNA配對.引物3'端最

32、佳堿基選擇是G和C,形成的堿基配對比較穩(wěn)定.7,引物與模板結合時,引物的5'端最多可以游離十幾個堿基而不影響PCR反應的進行.8,引物的5'端可以修飾,如附加限制酶位點,引入突變位點,用生物素,熒光物質,地高辛標記,加入其它短序列包括起始密碼子,終止密碼子等.(十八),PCR的反應條件答:1,PCR反應的緩沖液:Tris -HCl緩沖液KCl 促進引物的退火,濃度太高時會抑制Taq DNA聚合酶活性.加入BSA或明膠有利于保護TaqDNA聚合酶活性.必要時加入適量二甲基亞砜(DMSO)或甲酰胺利于破壞模板二級結構,提高PCR反應特異性.2,鎂離子濃度 一般用量1.5-2.0 m

33、mol/L,Taq DNA聚合酶活性需要Mg 2+.Mg 2+濃度過低,會顯著降低酶活性.Mg 2+濃度過高又使酶催化非特異性擴增增強.Mg 2+濃度還會影響引物的退火,模板與PCR產(chǎn)物的解鏈溫度,從而影響擴增片段的產(chǎn)率.3,底物濃度 工作濃度20-200umol/L, dNTPs濃度過高可加快反應速度,也增加堿基的錯配率和實驗成本.降低濃度會導致反應速度下降,可提高反應的特異性.在PCR反應中,4種dNTP必須以等摩爾濃度配制,以減少PCR反應的錯配誤差并提高使用效率.4,Taq DNA聚合酶 75-80時具有最高的聚合酶活性,150個核苷酸/秒;具有良好的熱穩(wěn)定性,95仍有活性,應用濃度一

34、般為1-2.5u/100ul反應體積.5,引物 0.1-0.5umol/L.引物濃度偏高會引起錯配或非特異性擴增,生成引物二聚體,使目的DNA片段產(chǎn)率下降.退火溫度與引物Tm值有關,引物Tm值在55-80 范圍較為理想.6,反應溫度和循環(huán)次數(shù)(十九),影響大腸桿菌系統(tǒng)外源基因表達的因素答:1,啟動子的強弱;2,基因的劑量;3,影響RNA轉錄和翻譯效率的因素:SD序列,mRNA;4,外源基因密碼子的選擇;5,表達產(chǎn)物的大小;6,表達產(chǎn)物的穩(wěn)定性.(二十),大腸桿菌系統(tǒng)表達外源基因必須具備的條件答:1,要求外源基因的編碼區(qū)不能含有內含子;2,表達的外源片段要位于大腸桿菌啟動子的下游,并形成正確的閱讀框架;3,轉錄出的mRNA必須有與大腸桿菌16S rRNA3,末端相匹配的SD序列,才能被有效的翻譯成蛋白質.4,蛋白產(chǎn)物必須穩(wěn)定,不易被細胞內蛋白酶快速降解,且對宿主無害.(二十一),真核細胞表達外源基因的條件答:1,首先必須具備哺乳動物細胞表達的功能元件.要求哺乳動物細胞表達載體帶有能在真核細胞中表達外源基因的真核轉錄調控元件;2,注意選擇轉染的受體細胞,不同類型的細胞具有不同的特性;3,注意選擇適當?shù)倪x擇標記.(二十二),轉基因動物的概念,原理及應用答:1,概念:是指用人工方法將外源基因導入或整合到基因組內,并能穩(wěn)定傳代的一類動物.它的特點是"分