1、丙酮酸發酵實驗1.實驗目的學習掌握利用發酵法生產丙酮酸的原理，掌握丙酮酸、殘糖和菌體濃度的測定方法和工藝操作。2.實驗原理丙酮酸是機體代謝的中間產物，既處于糖酵解（EMP）途徑的末端，又是連接EMP途徑和TCA循環的關鍵產物，它可經多條途徑生成乙醇、乳酸、草酰乙酸、丙氨酸、纈氨酸和異亮氨酸等。因此其所處的位置極為特殊。根據代謝控制育種和發酵原理，要想在生物體內大量積累丙酮酸，就必須進一步切斷或更確切地說是減弱丙酮酸的進一步代謝支路，加速丙酮酸的合成速度，去除代謝產物的反饋阻遏或反饋抑制（圖1）。葡萄糖甘油NA異亮氨酸，纈氨酸磷酸烯醇式丙酮酸B1B1ADHNAPDC乙醇NA乙醛乳酸丙酮酸NALD

2、HAIDHPDC乙酸NAB1PdxACS乙酰輔酶A丙氨酸草酰乙酸Pdx谷氨酰胺-酮戊二酸谷氨酸加速代謝流切斷或減弱圈內為輔酶或輔基（NA表示煙酸，B1為硫胺素，Bio為生物素，Pdx為吡哆醇。圖1 丙酮酸的代謝途徑及發酵機制3 實驗儀器與材料5L自動控制發酵罐 TGL-16G臺式高速離心機 752型紫外可見分光光度計500mL三角瓶 HZQ-Q恒溫振蕩器 手提式壓力蒸汽滅菌器 LRH-250A型生化培養箱 SBA-40C型生物分析傳感儀實驗菌種：煙酸、硫氨酸、生物素和吡哆醇缺陷型的光滑球擬酵母（Torulopsis glabrata）種子培養基(g/L)：葡萄糖30，蛋白胨10，KH2PO4

3、1，MgSO47H2O 0.5，pH 5.6，自來水1L。發酵培養基(g/L)：葡萄糖 80g/L，蛋白胨 3g/L，硫酸銨5.9g/L，KH2PO4 1g/L，MgSO47H2O 0.5g/L，煙酸8mg/L，鹽酸硫胺素20g/L，生物素10g/L，鹽酸吡哆醇 0.5mg/L，金屬離子母液5mL/L，pH 5.6。金屬離子母液：CaCL22 H2O，2g，FeSO47H2O，2g；ZnCL2，5g，MnCL4H2O，0.2g，CuSO45H2O，0.5g，2mol/L HCL溶解后定溶至1L。4 實驗步驟與方法（1） 種子培養取新鮮斜面菌種1環，接入50 mL種子培養基（500mL錐形瓶）中

4、，30，200r/min振蕩培養20小時。（2） 5L罐分批發酵實驗空消：空罐滅菌。實消：將發酵培養基2.7L從進樣口倒入5L發酵罐中，蓋上蓋子。檢查發酵罐安裝完好后，蓋上滅菌罩，105滅菌15分鐘。校正：校正pH電極、溶氧電極（校正方法參考5L罐使用說明書）接種與發酵：在接種圈的火焰保護下，將種子培養液300mL倒入發酵罐中，控制發酵溫度30，pH為6.0, 溶氧:0-12h通風60L/h，發酵罐攪拌 100r/min，12-72h停止通風和攪拌。自動流加8mol/L NaOH溶液控制發酵液pH為5.00.05，發酵過程產生的泡沫較多時，手動加入已滅菌的泡敵2-3滴即可迅速消泡，當殘糖濃度低

5、于5g/L時發酵結束。測量：每隔4h取樣，測菌體濃度、葡萄糖和丙酮酸濃度。在火焰下，按10%(v/v)接種量將種子接入發酵罐中，裝液量3L，通風量1 L/(Lmin)，發酵溫度30，通過調節攪拌轉速控制溶氧(DO)：1-12h控制溶氧值為80100%，12 控制溶氧值為70-80%。自動流加8mol/L NaOH溶液控制發酵液pH為5.00.05，發酵過程產生的泡沫較多時，手動加入已滅菌的泡敵2-3滴即可迅速消泡，當殘糖濃度低于5g/L時發酵結束。（3）分析方法菌體干重的測定將含有4mL發酵液的塑料離心管置于臺式離心機中，于10000 r/min下離心5min,放于電熱鼓風干燥箱80 烘干至衡

6、重，計算出細胞干重。上清液用于測定殘糖濃度、丙酮酸濃度。 葡萄糖的測定用SBA-40C型生物傳感儀檢測。將離心后的上清夜稀釋適當的倍數(100倍)，用進樣器吸取25L進樣。 丙酮酸的測定取10mL丙酮酸發酵液，離心（4000r/min,10mL）除去菌體，取5mL離心后的上清液至于500mL容量瓶中，再加入5mL 0.01mol/L的硫酸溶液進行酸解，使有機酸游離出來，然后定容并取適量以0.45m孔徑的濾膜過濾即得到待測樣液。采用反相色譜柱ODS-2 HYPERSIL(250mm4.6mm，5m)，以0.05mol/L NH4H2PO4 （用H3PO4調pH2.6）作為流動相，在流速1mL/m

7、in，波長215nm下測定。5實驗數據處理發酵培養時，按照一定的時間間隔取樣測定并記錄，結果如下表。時間h葡萄糖濃度/(g/L)菌體干重/(g/L)丙酮酸濃度/(g/L)048121620242832364044486 結果與討論（1）按照上表給出的相應數據，以時間為橫坐標，表中數據為縱坐標繪圖，分析各量的變化規律。（2）糖酸轉化率(%)：生成丙酮酸的克數與消耗葡萄糖克數之比的百分數。7. 參考文獻 （1）高年發 張現青 溶氧對發酵丙酮酸的影響J天津. 天津科技大學學報vol9.No.3. 2004. （2）樓良旺 高年發 紫外分光光度法測定丙酮酸J北京：分析實驗室.vol24.No.4.2005. （3）高年發 吳迪 張健 反相高壓液相色譜法測定丙酮酸發酵液中丙酮酸J天津.天津科技大學學報。Vo21.No.1. 2006. （4）占桂榮 高年發不利用丙酮酸的丙酮酸生產菌的選育J生物加工過程.Vo4.No.4. 2006.8. 預習與思考 請預習