1、12基因工程的基本操作程序1掌握目的基因獲取的常見方法。(難點)2學會基因表達載體構建的方法和要求。(重點)3理解目的基因導入受體細胞的方法。(重點)4掌握目的基因檢測與鑒定的具體操作。(重、難點)目 的 基 因 的 獲 取1目的基因 (1)主要是指編碼蛋白質的基因。(2)一些具有調控作用的因子。2獲取方法(1)從基因文庫中獲取基因組文庫：含有一種生物所有的基因。部分基因文庫：含有一種生物的一部分基因，如cDNA文庫。 (2)利用PCR技術擴增目的基因含義：是一項在生物體外復制特定DNA片段的核酸合成技術。原理：DNA雙鏈復制。條件：引物、DNA模板、Taq酶、四種脫氧核苷酸。過程。 a目的基

2、因DNA受熱變性后解鏈為單鏈(9095 )。b引物與單鏈相應互補序列結合(5560 )。c在DNA聚合酶作用下進行延伸(7075 )。d重復循環多次。 結果：每次循環后目的基因的量增加一倍，即成指數形式擴增(約為2n)。(3)人工合成法 條件：基因比較小，核苷酸序列已知。方法：通過DNA合成儀用化學方法直接人工合成。探討：基因組文庫和部分基因文庫有什么區別？提示：基因組文庫包含一種生物的全部基因，部分基因文庫只包含一種生物的一部分基因。探討：PCR過程中需要解旋酶嗎？所需要的DNA聚合酶應具有什么特點？提示：PCR過程中，DNA雙鏈解開是在高溫下完成的，不需要解旋酶；由于PCR過程溫度較高，所

3、以需要能耐高溫的DNA聚合酶。探討：什么樣的基因適合用DNA合成儀直接人工合成？提示：基因比較小，且核苷酸序列已知。1目的基因獲取方法的選擇(1)如果不知道目的基因的核苷酸序列，可以通過構建基因文庫的方法，即通過用受體菌儲存并擴增目的基因后，從基因文庫中去獲取目的基因。(2)如果知道目的基因的核苷酸序列，而且基因比較小，可以通過DNA合成儀利用化學方法人工合成。(3)如果只知道擴增目的基因的兩端的核苷酸序列，而且基因又比較大，則可以通過PCR技術擴增目的基因。2目的基因獲取過程的比較(1)基因組文庫：供體生物全部DNADNA片段受體菌群目的基因(2)cDNA文庫：供體生物mRNAcDNA受體菌

4、群目的基因(3)PCR技術：目的基因大量目的基因(4)人工合成：3PCR技術與DNA復制的比較比較項目DNA復制PCR技術區別解旋方式解旋酶催化DNA在高溫下變性解旋場所細胞內(主要在細胞核內)細胞外(主要在PCR擴增儀中)酶解旋酶、DNA聚合酶耐熱的DNA聚合酶溫度細胞內溫和條件控制溫度，需55 95 高溫結果合成DNA分子合成DNA片段或基因聯系(1)模板：均需要脫氧核苷酸雙鏈作為模板(2)原料：均為四種脫氧核苷酸(3)酶：均需DNA聚合酶(4)引物：都需要引物，使DNA聚合酶從引物的3端開始連接脫氧核苷酸1下列獲取目的基因的方法中需要模板的是()從基因文庫中獲取目的基因利用PCR技術擴增

5、目的基因反轉錄法通過DNA合成儀利用化學方法人工合成DNAABCD【解析】PCR技術利用的是DNA雙鏈復制原理，即將DNA雙鏈之間的氫鍵打開，變成單鏈DNA，作為聚合反應的模板。反轉錄法是以目的基因轉錄成的信使RNA為模板，在反轉錄酶的作用下，先反轉錄形成互補的單鏈DNA，再合成雙鏈DNA。則均不需要模板。【答案】D2下列關于cDNA文庫和基因組文庫的說法中，不正確的是 ()【導學號：72240004】AcDNA文庫中的DNA來源于mRNA的反轉錄過程B如果某種生物的cDNA文庫中的某個基因與該生物的基因組文庫中的某個基因控制的性狀相同，則這兩個基因的結構也完全相同CcDNA文庫中的基因都沒有

6、啟動子D一種生物的cDNA文庫可以有許多個，但基因組文庫只有一個【解析】由于基因轉錄時只有編碼區段才能轉錄，所以以mRNA反轉錄成的DNA就只有外顯子區段，而缺少內含子和啟動子等非編碼區段，和原來的基因結構不相同?！敬鸢浮緽基 因 表 達 載 體 的 構 建 與 轉 化(一)基因表達載體的構建核心 1基因表達載體的組成2基因表達載體的功能(1)使目的基因在受體細胞中穩定存在，并且可以遺傳給下一代。(2)使目的基因表達和發揮作用。(二)將目的基因導入受體細胞1轉化含義：目的基因進入受體細胞內，并且在受體細胞內維持穩定和表達的過程。2轉化方法(1)導入植物細胞最常用方法農桿菌轉化法：雙子葉植物或裸

7、子植物。其他方法a基因槍法：單子葉植物。b花粉管通道法。 (2)導入動物細胞常用方法：顯微注射技術。常用受體細胞：受精卵。(3)導入微生物細胞方法a用Ca2處理細胞，使細胞處于一種能吸收周圍環境中DNA分子的生理狀態(這種細胞稱為感受態細胞)。b感受態細胞吸收重組表達載體DNA分子。受體細胞：原核細胞(使用最廣泛的是大腸桿菌)。原核生物的特點：繁殖快、多為單細胞、遺傳物質相對較少等。探討：用于構建基因表達載體的質粒為什么必須具有啟動子和終止子？啟動子和終止子與起始密碼和終止密碼是一回事嗎？提示：導入到受體細胞的目的基因的表達需要調控序列，因此在插入目的基因的部位之前需有啟動子，之后需有終止子。

8、不是一回事，啟動子和終止子都在DNA上，在遺傳信息轉錄時起作用。啟動子是啟動轉錄的開始，終止子是DNA分子上決定轉錄停止的一段DNA序列，其組成單位都是脫氧核苷酸。而起始密碼子和終止密碼子都是mRNA上三個相鄰堿基。起始密碼子決定翻譯的開始，終止密碼子決定翻譯的停止。探討：農桿菌轉化法利用了農桿菌的什么特性？提示：農桿菌中的Ti質粒上的TDNA(可轉移的DNA)可轉移至受體細胞，并且整合到受體細胞的染色體DNA上。探討：植物基因工程常用的受體細胞為什么可以是體細胞，而動物基因工程一般只用受精卵？提示：植物體細胞的全能性較高，可經植物組織培養過程形成完整植物體，因此受體細胞可以是體細胞；動物體細

9、胞的全能性受到嚴格限制，因此動物基因工程中的受體細胞一般只用受精卵。1基因表達載體的構建過程將切下的目的基因片段插入質粒的切口處，再加入適量DNA連接酶，形成一個重組DNA分子(重組質粒)。構建過程如下圖所示：2將目的基因導入受體細胞的方法比較生物類型植物動物微生物受體細胞體細胞受精卵原核細胞常用方法農桿菌轉化法、基因槍法、花粉管通道法顯微注射技術感受態細胞法轉化過程以農桿菌轉化法為例：將目的基因插入Ti質粒的TDNA上轉入農桿菌中導入植物細胞整合到受體細胞的DNA上提取含目的基因的表達載體顯微注射受精卵發育具有新性狀的個體Ca2處理細胞感受態細胞基因表達載體與感受態細胞混合感受態細胞吸收DN

10、A分子1下列關于基因表達載體構建的相關敘述，不正確的是()A需要限制酶和DNA連接酶B必須在細胞內進行C抗生素抗性基因可作為標記基因D啟動子位于目的基因的首端【解析】基因表達載體的構建是指目的基因與載體結合，在此過程中需用同一種限制酶切割目的基因與載體，用DNA連接酶將相同的末端連接起來；基因表達載體的構建是在細胞外進行的；基因表達載體包括啟動子(位于基因首端使轉錄開始)、終止子、目的基因和標記基因(鑒別受體細胞中是否含有目的基因，如抗生素抗性基因)?！敬鸢浮緽2采用基因工程的方法培育抗蟲棉，下列導入目的基因的做法正確的是 () 【導學號：72240005】將毒素蛋白注射到棉受精卵中將編碼毒素

11、蛋白的DNA序列，注射到棉受精卵中將編碼毒素蛋白的DNA序列，與質粒重組，導入細菌，用該細菌感染棉的體細胞，再進行組織培養將編碼毒素蛋白的DNA序列，與細菌質粒重組，注射到棉的子房并進入受精卵ABCD【解析】本題以抗蟲棉培育為材料背景，主要考查基因操作中的第三步將目的基因導入受體細胞。導入目的基因必須選擇恰當的載體，以保證導入目的基因不被受體細胞降解，并成功地實現復制、轉錄和翻譯?！敬鸢浮緾目 的 基 因 的 檢 測 與 鑒 定1分子水平檢測(1)檢測轉基因生物DNA上是否插入了目的基因。方法：DNA分子雜交技術。(2)檢測目的基因是否轉錄出mRNA。方法：分子雜交技術。(3)檢測目的基因是否

12、翻譯成蛋白質。方法：抗原抗體雜交技術。2個體水平鑒定包括抗蟲、抗病的接種實驗，以確定是否有抗性及抗性程度。基因工程產品需要與天然產品活性進行比較等。探討：目的基因能否在真核生物中穩定遺傳的關鍵是什么？如何檢測？提示：目的基因是否插入受體細胞的染色體DNA上，這是其能否在真核生物中穩定遺傳的關鍵。檢測方法是采用DNA分子雜交技術。探討：什么是基因探針？如何檢測目的基因是否開始發揮功能？提示：基因探針是用放射性同位素標記的目的基因的單鏈DNA片段。從轉基因生物中提取mRNA，用標記的目的基因作探針，與mRNA雜交，如果顯示出雜交帶，則表明目的基因轉錄出了mRNA，意味著目的基因開始發揮功能。探討：

13、檢測棉花中導入的抗蟲基因是否表達的最簡便的方法是什么？提示：用葉片飼養棉鈴蟲，觀察棉鈴蟲是否死亡。目的基因的檢測與鑒定在不同方面的比較類型步驟檢測內容方法結果顯示分子檢測導入檢測目的基因是否導入受體細胞DNA分子雜交技術(DNA和DNA之間)是否成功顯示出雜交帶表達檢測目的基因是否轉錄出mRNA核酸分子雜交技術(DNA和mRNA之間)是否成功顯示出雜交帶目的基因是否翻譯出蛋白質蛋白質分子雜交(抗原和抗體之間)是否成功顯示出雜交帶個體生物學水平的鑒定確定是否具有抗性及抗性程度基因工程產品與天然產品的活性是否相同抗蟲或抗病的接種實驗基因工程產品與天然產品活性的比較是否賦予了預期抗性或蛋白質活性1

14、DNA探針是利用放射性同位素等標記的特定DNA片段。當DNA探針與待測的非標記單鏈DNA(或RNA)按堿基順序互補結合時，形成標記DNADNA(或標記DNARNA)的雙鏈雜交分子，可檢測雜交反應結果。用某人的胰島素基因制成DNA探針，能與之形成雜交分子的是() 【導學號：72240006】該人胰島A細胞中的DNA該人胰島B細胞中的mRNA該人胰島A細胞中的mRNA該人肝細胞中的DNAABCD【解析】DNA單鏈能與其互補鏈及其轉錄產生的mRNA分子互補配對而形成雜交分子；人體細胞中都有胰島素基因，但此基因只有在胰島B細胞中才能得到表達?！敬鸢浮緾2轉基因抗蟲棉培育過程中要對Bt基因導入受體細胞后

15、是否可以穩定維持和表達進行檢測與鑒定，其中利用到堿基互補配對原則的有()檢測棉花的DNA上是否插入了Bt基因檢測Bt基因是否在棉花細胞轉錄出mRNA檢測Bt基因是否在棉花細胞翻譯成蛋白質檢測Bt基因是否賦予了棉花抗蟲特性ABCD【解析】檢測棉花的DNA上是否插入了Bt基因和檢測Bt基因是否在棉花細胞轉錄出mRNA都是用標記的目的基因作探針進行分子雜交，因此都要進行堿基互補配對；檢測Bt基因是否在棉花細胞中翻譯成蛋白質需進行抗原抗體雜交，檢測Bt基因是否賦予了棉花抗蟲特性需要做抗蟲接種實驗，這兩項技術都沒有涉及堿基互補配對原則?！敬鸢浮緼1基因工程的基本操作程序有：使目的基因與運載體相結合；將目

16、的基因導入受體細胞；檢測目的基因的表達是否符合特定性狀要求；提取目的基因。正確的操作順序是() 【導學號：72240007】ABCD【解析】基因工程的主要操作步驟順序是：目的基因的獲取基因表達載體的構建將目的基因導入受體細胞目的基因的檢測與鑒定?！敬鸢浮緾2下列不屬于獲取目的基因的方法是()A利用DNA連接酶復制目的基因B反轉錄法C從基因文庫中獲取目的基因D利用PCR技術擴增目的基因【解析】本題考查目的基因的獲取方法及DNA聚合酶和DNA連接酶的區別。對目的基因(DNA片段)進行復制需利用DNA聚合酶而不是DNA連接酶?！敬鸢浮緼3下列關于基因表達載體的構建描述錯誤的是()A基因表達載體的構建

17、是基因工程的核心B基因表達載體的構建包括目的基因、啟動子、終止子、標記基因等部分C目的基因主要是指編碼蛋白質的結構基因D構建的基因表達載體都是相同的【解析】基因表達載體的構建是基因工程的第二步，也是基因工程的核心；一個基因表達載體的組成除目的基因外還必須具有啟動子、終止子、標記基因等部分；目的基因主要是指編碼蛋白質的結構基因；由于受體細胞不同，基因表達載體的構建也會有差別，不可能都是相同的。【答案】D41957年，生物學家了解到，病毒感染的細胞能產生一種因子，這種因子能作用于其他細胞，干擾病毒的復制，故將其命名為干擾素；從1987年開始，用基因工程方法生產的干擾素進入了工業化生產，并且大量投放

18、市場。(1)若已知干擾素的氨基酸序列，則獲取目的基因的較簡單方法是_；目的基因還可以從_文庫獲取，而從cDNA文庫中不一定能得到，原因是_。(2)用限制酶處理質粒和目的基因后，用_酶處理，可形成基因表達載體，該載體的化學本質是_。(3)轉基因技術是否成功，需要對受體細胞進行分子水平的檢測，首先是檢測受體細胞_上是否插入了目的基因，這是目的基因能否在真核生物中穩定遺傳的關鍵。檢測方法是采用_。最后還要檢測目的基因是否翻譯成了相應的蛋白質，利用的技術是_?！窘馕觥?1)若已知干擾素的氨基酸序列，則可以通過反轉錄法獲得目的基因；cDNA文庫是部分基因文庫，因為cDNA是由生物發育的某個時期的mRNA反轉錄產生的，所以cDNA中不一定有目的基因，最好從基因組文庫中獲取。(2)用限制酶處理載體和目的基因后，將目的基因與載體連接，需要使用DNA連接酶處理，基因與載體的化學本質是相同的，都是DNA。(3)檢測目的基因使用DNA分子雜交技術；檢測蛋白質采用的是抗原抗體雜交技術?！敬鸢浮?1)人工合成法基因組cDNA是由生物發育的某個時期的mRNA反轉錄產生的(其他合理答案也可)(2)DNA連接DNA(3)染色體