1、.第二章第二章 微生物多樣性微生物多樣性Chapter 2 Microbial Diversity曹曹 慧慧 教授教授.生物多樣性生物多樣性(biodiversity)這個(gè)單詞是一個(gè)新創(chuàng)造的組合這個(gè)單詞是一個(gè)新創(chuàng)造的組合詞，由生物詞，由生物(bio)和多樣性和多樣性(diversity)組合而成。組合而成。biological diversity由托馬斯由托馬斯拉夫卓伊拉夫卓伊(Thomas Lovejoy)于于1980年提出，年提出，而而biodiversity則由昆蟲學(xué)家威爾遜則由昆蟲學(xué)家威爾遜(E. O. Wilson)于于1986年年在國家研究委員會(huì)在國家研究委員會(huì)(National

2、Research Council, NRC)舉辦的舉辦的首次美國生物多樣性論壇報(bào)告中提出。首次美國生物多樣性論壇報(bào)告中提出。微生物多樣性（微生物多樣性（Microbial Diversity）是一定區(qū)域范圍）是一定區(qū)域范圍內(nèi)的所有微生物種類和它們的生態(tài)環(huán)境總和。內(nèi)的所有微生物種類和它們的生態(tài)環(huán)境總和。1.1 微生物多樣性概念微生物多樣性概念.微生物生態(tài)系統(tǒng)多樣性（微生物生態(tài)系統(tǒng)多樣性（Microbial ecosystem diversity）Species diversity is an index that incorporates the number of species in an

3、area and also their relative abundance. It is generally a much more useful value than species richness.Genetic diversity is a level of biodiversity that refers to the total number of genetic characteristics in the genetic makeup of a species. It is distinguished from genetic variability, which descr

4、ibes the tendency of genetic characteristics to vary.Ecosystem diversity refers to the diversity of a place at the level of ecosystems. It is contrasted with biodiversity, which refers to variation in species rather than ecosystems.From Wikipedia, the free encyclopedia1.2 微生物多樣性的三個(gè)層次微生物多樣性的三個(gè)層次.1.3

5、微生物多樣性表現(xiàn)形式微生物多樣性表現(xiàn)形式v形態(tài)多樣性（形態(tài)多樣性（Morphological diversity）v代謝多樣性（代謝多樣性（Metabolic diversity）v生態(tài)多樣性（生態(tài)多樣性（Ecological diversity）.-cell shapes: rods, cocci, spirals, filaments,amorphous, star-shaped, squares,-cell organization: multicellular from pairs and tetrads to filaments, sheets, rosettes, microbia

6、l mats,-cells size: average 1 to 5 microns range 0.1 to 660 microns (Thiomargarita namibiensis , giant sulfur bacteruim in Namibian sediments)Morphological diversity.Dimensions of some bacteriaSmall bacteria Bacteroides spp 0.1 0.15-0.13 m Bordetella pertussis 0.2-0.3 0.5-1.0 m Mycoplasma spp 0.1 -

7、0.25 m dia Medium bacteria Bacillus spp 0.7-0.8 2-3 m E. coli 0.4-0.7 1-3 m S. aureus 0.8-1.0 m dia Large Bacteria Anabaena spp 4-5 m Achromatium spp 5 100 m .Chemotrophs:energy is obtained from chemicals lithotrophs: inorganic chemicals (sulfur, iron, hydrogen) -autotrophs: carbon is obtained by fi

8、xing CO2 (sulfur-reducing Archaea, methanogens) -heterotrophs: carbon is obtained from organic compounds (sulfur-reducing Archaea) organotrophs and heterotrophs: carbon and energy are obtained from organic chemicals (heterotrophs, E.coli, pathogens)Metabolic diversityPhototrophs: energy is obtained

9、from light heterotrophs: carbon is obtained from organic compounds (halophilic Archaea and others) autotrophs: carbon is obtained by fixing CO2 (most cyanobacteria, photosynthetic bacteria).Ecological diversity-salinity: from fresh water to marine and hypersaline environments (Dead sea and the Great

10、 Salt Lake, halophiles)-temperature: from 12 to 113oC (Pyrolobus) and beyond (121oC)-pH: from 0 (Thiobacillus thiooxidans) to 13 (Plectonema nostocorum) pH 0 is 1M HCl-redox potential: from 450mV (methanogens)to + 850mV (iron bacteria)-hydrostatic pressure: from 1 to 1400 atm (barophiles).1.4 微生物多樣性

11、影響因素（微生物多樣性影響因素（Drive factors）v營養(yǎng)物質(zhì)營養(yǎng)物質(zhì)v環(huán)境因素環(huán)境因素v生物關(guān)系生物關(guān)系.Diversity arises from the balance between speciation and extinction rates. Diversity theories“one reason for the high genomic diversity observed in prokaryotic communities in soil and sediments is the large populations of organisms and the ca

12、pacity to accumulate large numbers of mutations.”How does “abundance” influence this balance?.1.5 微生物多樣性價(jià)值微生物多樣性價(jià)值v科研價(jià)值科研價(jià)值v經(jīng)濟(jì)價(jià)值經(jīng)濟(jì)價(jià)值v生態(tài)價(jià)值生態(tài)價(jià)值.Estimates of biodiversity are problematic.CultivatedCultivatedUncultivated (16S Uncultivated (16S rDNArDNA clone diversity)clone diversity).傳統(tǒng)平板培養(yǎng)方法（傳統(tǒng)平板培養(yǎng)方法（

13、traditional culture-dependent methods）群落水平生理學(xué)方法（群落水平生理學(xué)方法（community level physiological profile，CLPP）生物標(biāo)記法（生物標(biāo)記法（Biomakers）分子微生物學(xué)方法（分子微生物學(xué)方法（Molecular microbial diversity ）.傳統(tǒng)培養(yǎng)分離方法是將定量樣品接種于培養(yǎng)基中，在一定的傳統(tǒng)培養(yǎng)分離方法是將定量樣品接種于培養(yǎng)基中，在一定的溫度下培養(yǎng)一定的時(shí)間，然后對(duì)生長的菌落計(jì)數(shù)和計(jì)算含量，并溫度下培養(yǎng)一定的時(shí)間，然后對(duì)生長的菌落計(jì)數(shù)和計(jì)算含量，并通過在顯微鏡下觀察其形態(tài)構(gòu)造，結(jié)合培養(yǎng)

14、分離過程生理生化特通過在顯微鏡下觀察其形態(tài)構(gòu)造，結(jié)合培養(yǎng)分離過程生理生化特性的觀察鑒定種屬分類特性。培養(yǎng)分離方法采用配比簡單的營養(yǎng)性的觀察鑒定種屬分類特性。培養(yǎng)分離方法采用配比簡單的營養(yǎng)基質(zhì)和固定的培養(yǎng)溫度，還忽略了氣候變化和生物相互作用的影基質(zhì)和固定的培養(yǎng)溫度，還忽略了氣候變化和生物相互作用的影響，這種人工環(huán)境與原生境的偏差使得可培養(yǎng)的種類大大減少響，這種人工環(huán)境與原生境的偏差使得可培養(yǎng)的種類大大減少(僅僅占環(huán)境微生物總數(shù)的占環(huán)境微生物總數(shù)的0.1%10%)。而且，此方法繁瑣耗時(shí)，不能。而且，此方法繁瑣耗時(shí)，不能用于監(jiān)測(cè)種群結(jié)構(gòu)的動(dòng)態(tài)變化。用于監(jiān)測(cè)種群結(jié)構(gòu)的動(dòng)態(tài)變化。2.1 傳統(tǒng)平板培養(yǎng)方法

15、傳統(tǒng)平板培養(yǎng)方法.0714212835020406080100120土壤細(xì)菌Hha I酶切數(shù)量Number of soil bacteria digested by Hha ITypes of OTUsOTUs種類LBWSACSEA 不同培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)菌種系型豐度趨勢(shì)線不同培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)菌種系型豐度趨勢(shì)線 .07142128020406080100土壤細(xì)菌Hha I酶切數(shù)量Number of soil bacteria digested by Hha ITypes of OTUsOTUs種類048h4896h96192h 不同培養(yǎng)時(shí)間培養(yǎng)的細(xì)菌種系型豐度趨勢(shì)線不同培養(yǎng)時(shí)間培養(yǎng)的細(xì)菌種系型豐度趨

16、勢(shì)線 .該方法最初由美國的該方法最初由美國的BIOLOG公司于公司于1989年開發(fā)成功，最初應(yīng)用于純種微生年開發(fā)成功，最初應(yīng)用于純種微生物鑒定，至今已經(jīng)能夠鑒定包括細(xì)菌、酵母菌和霉菌在內(nèi)的物鑒定，至今已經(jīng)能夠鑒定包括細(xì)菌、酵母菌和霉菌在內(nèi)的2000多種病原微生物和多種病原微生物和環(huán)境微生物。環(huán)境微生物。這種方法是基于微生物群落對(duì)這種方法是基于微生物群落對(duì)95種不同碳源的利用度來描述群落中微生物的種不同碳源的利用度來描述群落中微生物的動(dòng)態(tài)變化。其具體做法是：利用由動(dòng)態(tài)變化。其具體做法是：利用由95孔不同單一孔不同單一C源和源和1個(gè)對(duì)照孔組成的個(gè)對(duì)照孔組成的Biolog微平微平板系統(tǒng)，將土壤溶液接

17、種到每一個(gè)微平板孔中，在一定的溫育時(shí)間內(nèi)，由于不同微板系統(tǒng)，將土壤溶液接種到每一個(gè)微平板孔中，在一定的溫育時(shí)間內(nèi)，由于不同微生物對(duì)不同單一生物對(duì)不同單一C源利用程度和強(qiáng)度不一樣而發(fā)生不同生化代謝反應(yīng)，最終使得每源利用程度和強(qiáng)度不一樣而發(fā)生不同生化代謝反應(yīng)，最終使得每一個(gè)孔的溶液呈現(xiàn)出不同程度的顏色，微平板中每一孔的顏色變化可以通過酶標(biāo)儀一個(gè)孔的溶液呈現(xiàn)出不同程度的顏色，微平板中每一孔的顏色變化可以通過酶標(biāo)儀測(cè)定和記錄下來，這樣便可得到土壤微生物特有的測(cè)定和記錄下來，這樣便可得到土壤微生物特有的“代謝指紋代謝指紋”(Metabolic Fingerprint)。根據(jù)土壤微生物的代謝指紋圖譜，結(jié)合

18、有關(guān)的計(jì)算機(jī)分析軟件和己。根據(jù)土壤微生物的代謝指紋圖譜，結(jié)合有關(guān)的計(jì)算機(jī)分析軟件和己有的菌種庫資料，可以得到某些微生物的分類鑒定，對(duì)一般細(xì)菌的鑒定可以精確到有的菌種庫資料，可以得到某些微生物的分類鑒定，對(duì)一般細(xì)菌的鑒定可以精確到種，有的甚至精確到種以下的分類單元種，有的甚至精確到種以下的分類單元 。2.2 BIOLOG 鑒定系統(tǒng)鑒定系統(tǒng).磷脂是構(gòu)成生物細(xì)胞膜的主要成分，約占細(xì)胞干重的磷脂是構(gòu)成生物細(xì)胞膜的主要成分，約占細(xì)胞干重的5%。在。在細(xì)胞死亡時(shí)，細(xì)胞膜很快被降解，磷脂脂肪酸被迅速的代謝掉，因細(xì)胞死亡時(shí)，細(xì)胞膜很快被降解，磷脂脂肪酸被迅速的代謝掉，因此它只在活細(xì)胞中存在，十分適合于微生物群

19、落的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)。另一此它只在活細(xì)胞中存在，十分適合于微生物群落的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)。另一個(gè)重要因素是脂肪酸具有屬的特異性，特殊的甲基脂肪酸已經(jīng)被作個(gè)重要因素是脂肪酸具有屬的特異性，特殊的甲基脂肪酸已經(jīng)被作為微生物分類的依據(jù)。磷脂脂肪酸譜圖分析法首先將磷脂脂肪酸部為微生物分類的依據(jù)。磷脂脂肪酸譜圖分析法首先將磷脂脂肪酸部分提取出來，然后用氣相色譜分析，得出分提取出來，然后用氣相色譜分析，得出PLFA譜圖。譜圖。2.3 脂肪酸譜圖法脂肪酸譜圖法(PLFAs、WCFA-FAMEs和其它方法和其它方法).熒光原位雜交是在熒光原位雜交是在20世紀(jì)世紀(jì)80年代末在放射性原位雜交技術(shù)的年代末在放射性原位雜交技術(shù)的基礎(chǔ)上

20、發(fā)展起來的一種非放射性分子細(xì)胞遺傳技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種非放射性分子細(xì)胞遺傳技術(shù),以熒光標(biāo)記取以熒光標(biāo)記取代同位素標(biāo)記而形成的一種新的原位雜交方法。它根據(jù)已知微生代同位素標(biāo)記而形成的一種新的原位雜交方法。它根據(jù)已知微生物不同分類級(jí)別上種群特異的物不同分類級(jí)別上種群特異的DNA序列，以利用熒光標(biāo)記的特異序列，以利用熒光標(biāo)記的特異寡聚核苷酸片段作為探針，與環(huán)境基因組中寡聚核苷酸片段作為探針，與環(huán)境基因組中DNA分子雜交，檢測(cè)分子雜交，檢測(cè)該特異微生物種群的存在與豐度。該方法的特點(diǎn)是可以進(jìn)行樣品該特異微生物種群的存在與豐度。該方法的特點(diǎn)是可以進(jìn)行樣品的原位雜交，應(yīng)用于環(huán)境中特定微生物種群鑒定、種群

21、數(shù)量分析的原位雜交，應(yīng)用于環(huán)境中特定微生物種群鑒定、種群數(shù)量分析及其特異微生物跟蹤檢測(cè)，是目前在分子微生物生態(tài)學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用及其特異微生物跟蹤檢測(cè)，是目前在分子微生物生態(tài)學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用比較廣泛的方法之一。比較廣泛的方法之一。2.4 熒光原位雜交技術(shù)熒光原位雜交技術(shù)（fluorescent in situ hybridization, FISH）. FISH樣本的制備樣本的制備探針的制備探針的制備探針標(biāo)記探針標(biāo)記雜交雜交（染色體顯帶）（染色體顯帶）熒光顯微鏡檢測(cè)熒光顯微鏡檢測(cè)結(jié)果分析結(jié)果分析.采用限制性內(nèi)切酶識(shí)別雙鏈采用限制性內(nèi)切酶識(shí)別雙鏈DNA分子中特異的短列，在特定分子中特異的短列，在特定的位點(diǎn)將的

22、位點(diǎn)將DNA切開，來自不同個(gè)體基因組的含同源序列的酶切片切開，來自不同個(gè)體基因組的含同源序列的酶切片段具有不同的長度。通過常規(guī)的電泳分離，不同長度的片段停留段具有不同的長度。通過常規(guī)的電泳分離，不同長度的片段停留在不同的位置，即形成了限制性片段長度多態(tài)性指紋圖譜，在不同的位置，即形成了限制性片段長度多態(tài)性指紋圖譜， ARDRA(擴(kuò)增擴(kuò)增rDNA限制性分析限制性分析)和和T-RFLP(末端末端RFLP)都是由都是由RFLP發(fā)展而來的方法。發(fā)展而來的方法。T-RFLP法在法在PCR擴(kuò)增進(jìn)程中使用熒光標(biāo)擴(kuò)增進(jìn)程中使用熒光標(biāo)記的引物，因而記的引物，因而PCR產(chǎn)物被末端標(biāo)記。產(chǎn)物被末端標(biāo)記。RFLP(A

23、RDRA，RFLP)方方法通常選擇法通常選擇rRNA(rDNA)的基因作為擴(kuò)增對(duì)象，廣泛用于研究土的基因作為擴(kuò)增對(duì)象，廣泛用于研究土壤、水體和海洋沉積物等區(qū)系微生物群落的結(jié)構(gòu)和多樣性。壤、水體和海洋沉積物等區(qū)系微生物群落的結(jié)構(gòu)和多樣性。2.5 限制性片段長度多態(tài)性方法限制性片段長度多態(tài)性方法（restriction fragment length polymorphism，RFLP) .環(huán)境微生物環(huán)境微生物16S rDNA的文庫構(gòu)建的文庫構(gòu)建提取微生物總提取微生物總DNA分離、純化分離、純化DNA用通用引物擴(kuò)增用通用引物擴(kuò)增16SrDNA酶連、轉(zhuǎn)化構(gòu)建質(zhì)粒文庫酶連、轉(zhuǎn)化構(gòu)建質(zhì)粒文庫再以再以M1

24、3引物擴(kuò)增引物擴(kuò)增插入質(zhì)粒中的插入質(zhì)粒中的rDNA片段片段環(huán)境微生物環(huán)境微生物群落結(jié)構(gòu)群落結(jié)構(gòu)限制性酶切分析限制性酶切分析歸納分類歸納分類.同樣大小的同樣大小的DNA序列由于含有的堿基不同，各片段的序列由于含有的堿基不同，各片段的Tm值值也就不同。甚至一個(gè)堿基對(duì)的不同，都會(huì)引起也就不同。甚至一個(gè)堿基對(duì)的不同，都會(huì)引起Tm很大的差異，很大的差異，DGGE或或TGGE就是應(yīng)用這種差異來區(qū)分不同的基因序列。這種就是應(yīng)用這種差異來區(qū)分不同的基因序列。這種電泳方法在聚丙烯酰胺中加入甲酰胺（電泳方法在聚丙烯酰胺中加入甲酰胺（DGGE），從正極到負(fù)極），從正極到負(fù)極梯度遞加，或是形成溫度梯度（梯度遞加，或是

25、形成溫度梯度（TGGE）。電泳中的）。電泳中的DNA到達(dá)它到達(dá)它的變性甲酰胺濃度或溫度時(shí)，雙鏈部分解開，造成泳動(dòng)速度發(fā)生的變性甲酰胺濃度或溫度時(shí)，雙鏈部分解開，造成泳動(dòng)速度發(fā)生變化，從而達(dá)到分離效果。變化，從而達(dá)到分離效果。 2.6 變性梯度凝膠電泳變性梯度凝膠電泳（DGGE）和溫度梯度凝膠電泳和溫度梯度凝膠電泳（TGGE）.2.7 高通量測(cè)序方法高通量測(cè)序方法2005年，在國際頂級(jí)的學(xué)術(shù)期刊年，在國際頂級(jí)的學(xué)術(shù)期刊Nature上，來美國上，來美國454生命科學(xué)生命科學(xué)公司的公司的Margulies等人發(fā)表文章介紹了一種快速簡單的測(cè)序方法：結(jié)合了等人發(fā)表文章介紹了一種快速簡單的測(cè)序方法：結(jié)合了

26、DNA擴(kuò)增的乳膠系統(tǒng)（擴(kuò)增的乳膠系統(tǒng)（emulsion system）和皮升大小焦磷酸）和皮升大小焦磷酸（pyrophosphate）為基礎(chǔ)的測(cè)序方法）為基礎(chǔ)的測(cè)序方法焦磷酸測(cè)序（焦磷酸測(cè)序（pyrosequencing）方法。發(fā)明者宣稱，這種測(cè)序方法比傳統(tǒng)的方法。發(fā)明者宣稱，這種測(cè)序方法比傳統(tǒng)的Sanger測(cè)序的方法快測(cè)序的方法快100倍，假倍，假如利用這種方法來進(jìn)行人類基因組的測(cè)序，那么在如利用這種方法來進(jìn)行人類基因組的測(cè)序，那么在100多天內(nèi)就可以完成。多天內(nèi)就可以完成。在在2005年年底，年年底，454公司的研究人員將這種嶄新的測(cè)序技術(shù)轉(zhuǎn)化成了商品化公司的研究人員將這種嶄新的測(cè)序技術(shù)轉(zhuǎn)

27、化成了商品化的儀器的儀器Genome Sequencer 20 系統(tǒng)，并由羅氏應(yīng)用科學(xué)部獨(dú)家負(fù)責(zé)在系統(tǒng)，并由羅氏應(yīng)用科學(xué)部獨(dú)家負(fù)責(zé)在全球的銷售和技術(shù)服務(wù)等工作。全球的銷售和技術(shù)服務(wù)等工作。Genome Sequencer 20 系統(tǒng)一經(jīng)推出，就系統(tǒng)一經(jīng)推出，就受到了國際上基因組學(xué)專家的廣泛關(guān)注，并在世界各大測(cè)序?qū)嶒?yàn)室相繼成受到了國際上基因組學(xué)專家的廣泛關(guān)注，并在世界各大測(cè)序?qū)嶒?yàn)室相繼成功落戶。可以說，隨著功落戶?？梢哉f，隨著Genome Sequencer 20 系統(tǒng)的不斷推廣應(yīng)用和升級(jí)，系統(tǒng)的不斷推廣應(yīng)用和升級(jí)，快速基因組測(cè)序的時(shí)代已經(jīng)來臨，并對(duì)整個(gè)基因組學(xué)的研究將產(chǎn)生巨大的快速基因組測(cè)序的

28、時(shí)代已經(jīng)來臨，并對(duì)整個(gè)基因組學(xué)的研究將產(chǎn)生巨大的推動(dòng)作用。推動(dòng)作用。.1）454測(cè)序技術(shù)（測(cè)序技術(shù)（GS FLX系統(tǒng)超高通量測(cè)序）系統(tǒng)超高通量測(cè)序）454技術(shù)以平均序列讀長技術(shù)以平均序列讀長240bp遙遙領(lǐng)先于同系列高通量測(cè)序儀，而遙遙領(lǐng)先于同系列高通量測(cè)序儀，而序列平均讀長在基因組測(cè)序拼接過程中至關(guān)重要。而且序列平均讀長在基因組測(cè)序拼接過程中至關(guān)重要。而且454 GS FLX 基因基因組測(cè)序儀是高性能并行計(jì)算機(jī)和服務(wù)器及配套軟件，建立信息處理平臺(tái)組測(cè)序儀是高性能并行計(jì)算機(jī)和服務(wù)器及配套軟件，建立信息處理平臺(tái)與數(shù)據(jù)庫，大大提高生物信息學(xué)分析能力；與數(shù)據(jù)庫，大大提高生物信息學(xué)分析能力； 擁有超強(qiáng)

29、的功能驗(yàn)證和解析擁有超強(qiáng)的功能驗(yàn)證和解析能力。能力。2）Solexa 高通量測(cè)序技術(shù)高通量測(cè)序技術(shù)Solexa 測(cè)序技術(shù)為新一代革新性技術(shù)分子生物學(xué)綜合技術(shù)平臺(tái)，具測(cè)序技術(shù)為新一代革新性技術(shù)分子生物學(xué)綜合技術(shù)平臺(tái)，具有高準(zhǔn)確性，高通量，高靈敏度，和低運(yùn)行成本等突出優(yōu)勢(shì)有高準(zhǔn)確性，高通量，高靈敏度，和低運(yùn)行成本等突出優(yōu)勢(shì), 該測(cè)序技術(shù)該測(cè)序技術(shù)可在每一張芯片獲取可在每一張芯片獲取 1G 的堿基數(shù)據(jù)，超過了傳統(tǒng)測(cè)序儀近百倍的工作的堿基數(shù)據(jù)，超過了傳統(tǒng)測(cè)序儀近百倍的工作量。量。Solexa 測(cè)序技術(shù)為廣大用戶提供了強(qiáng)大的下一代測(cè)序方法，可以同測(cè)序技術(shù)為廣大用戶提供了強(qiáng)大的下一代測(cè)序方法，可以同時(shí)完成

30、傳統(tǒng)基因組學(xué)研究（測(cè)序和注釋）以及功能基因組學(xué)（基因表達(dá)時(shí)完成傳統(tǒng)基因組學(xué)研究（測(cè)序和注釋）以及功能基因組學(xué)（基因表達(dá)及調(diào)控，基因功能，蛋白及調(diào)控，基因功能，蛋白/核酸相互作用）研究。核酸相互作用）研究。高通量測(cè)序方法介紹高通量測(cè)序方法介紹. 土壤微生物總土壤微生物總DNA的提取方法的提取方法直接提取法直接提取法能夠破壞土壤結(jié)構(gòu)，使團(tuán)聚體內(nèi)部的微生物釋放出來，能夠破壞土壤結(jié)構(gòu)，使團(tuán)聚體內(nèi)部的微生物釋放出來，是進(jìn)行隨機(jī)和非特異性裂解的有效方法是進(jìn)行隨機(jī)和非特異性裂解的有效方法l反復(fù)凍融；反復(fù)凍融；l冰凍煮沸；冰凍煮沸；l玻璃珠勻漿；玻璃珠勻漿；l液氮研磨；液氮研磨；l超聲波破碎等。超聲波破碎等。.B. 間接提取法間接提取法Coarse particlesPellet (microbial cell)Soil colloid Soil.C.直接提取法與間接提取法比較直接提取法與間接提取法比較直接提取法：直接提取法：優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：DNA產(chǎn)量高，偏嗜度低；產(chǎn)