1、.第二章第二章 微生物多樣性微生物多樣性Chapter 2 Microbial Diversity曹曹 慧慧 教授教授.生物多樣性生物多樣性(biodiversity)這個單詞是一個新創造的組合這個單詞是一個新創造的組合詞，由生物詞，由生物(bio)和多樣性和多樣性(diversity)組合而成。組合而成。biological diversity由托馬斯由托馬斯拉夫卓伊拉夫卓伊(Thomas Lovejoy)于于1980年提出，年提出，而而biodiversity則由昆蟲學家威爾遜則由昆蟲學家威爾遜(E. O. Wilson)于于1986年年在國家研究委員會在國家研究委員會(National

2、Research Council, NRC)舉辦的舉辦的首次美國生物多樣性論壇報告中提出。首次美國生物多樣性論壇報告中提出。微生物多樣性（微生物多樣性（Microbial Diversity）是一定區域范圍）是一定區域范圍內的所有微生物種類和它們的生態環境總和。內的所有微生物種類和它們的生態環境總和。1.1 微生物多樣性概念微生物多樣性概念.微生物生態系統多樣性（微生物生態系統多樣性（Microbial ecosystem diversity）Species diversity is an index that incorporates the number of species in an

3、area and also their relative abundance. It is generally a much more useful value than species richness.Genetic diversity is a level of biodiversity that refers to the total number of genetic characteristics in the genetic makeup of a species. It is distinguished from genetic variability, which descr

4、ibes the tendency of genetic characteristics to vary.Ecosystem diversity refers to the diversity of a place at the level of ecosystems. It is contrasted with biodiversity, which refers to variation in species rather than ecosystems.From Wikipedia, the free encyclopedia1.2 微生物多樣性的三個層次微生物多樣性的三個層次.1.3

5、微生物多樣性表現形式微生物多樣性表現形式v形態多樣性（形態多樣性（Morphological diversity）v代謝多樣性（代謝多樣性（Metabolic diversity）v生態多樣性（生態多樣性（Ecological diversity）.-cell shapes: rods, cocci, spirals, filaments,amorphous, star-shaped, squares,-cell organization: multicellular from pairs and tetrads to filaments, sheets, rosettes, microbia

6、l mats,-cells size: average 1 to 5 microns range 0.1 to 660 microns (Thiomargarita namibiensis , giant sulfur bacteruim in Namibian sediments)Morphological diversity.Dimensions of some bacteriaSmall bacteria Bacteroides spp 0.1 0.15-0.13 m Bordetella pertussis 0.2-0.3 0.5-1.0 m Mycoplasma spp 0.1 -

7、0.25 m dia Medium bacteria Bacillus spp 0.7-0.8 2-3 m E. coli 0.4-0.7 1-3 m S. aureus 0.8-1.0 m dia Large Bacteria Anabaena spp 4-5 m Achromatium spp 5 100 m .Chemotrophs:energy is obtained from chemicals lithotrophs: inorganic chemicals (sulfur, iron, hydrogen) -autotrophs: carbon is obtained by fi

8、xing CO2 (sulfur-reducing Archaea, methanogens) -heterotrophs: carbon is obtained from organic compounds (sulfur-reducing Archaea) organotrophs and heterotrophs: carbon and energy are obtained from organic chemicals (heterotrophs, E.coli, pathogens)Metabolic diversityPhototrophs: energy is obtained

9、from light heterotrophs: carbon is obtained from organic compounds (halophilic Archaea and others) autotrophs: carbon is obtained by fixing CO2 (most cyanobacteria, photosynthetic bacteria).Ecological diversity-salinity: from fresh water to marine and hypersaline environments (Dead sea and the Great

10、 Salt Lake, halophiles)-temperature: from 12 to 113oC (Pyrolobus) and beyond (121oC)-pH: from 0 (Thiobacillus thiooxidans) to 13 (Plectonema nostocorum) pH 0 is 1M HCl-redox potential: from 450mV (methanogens)to + 850mV (iron bacteria)-hydrostatic pressure: from 1 to 1400 atm (barophiles).1.4 微生物多樣性

11、影響因素（微生物多樣性影響因素（Drive factors）v營養物質營養物質v環境因素環境因素v生物關系生物關系.Diversity arises from the balance between speciation and extinction rates. Diversity theories“one reason for the high genomic diversity observed in prokaryotic communities in soil and sediments is the large populations of organisms and the ca

12、pacity to accumulate large numbers of mutations.”How does “abundance” influence this balance?.1.5 微生物多樣性價值微生物多樣性價值v科研價值科研價值v經濟價值經濟價值v生態價值生態價值.Estimates of biodiversity are problematic.CultivatedCultivatedUncultivated (16S Uncultivated (16S rDNArDNA clone diversity)clone diversity).傳統平板培養方法（傳統平板培養方法（

13、traditional culture-dependent methods）群落水平生理學方法（群落水平生理學方法（community level physiological profile，CLPP）生物標記法（生物標記法（Biomakers）分子微生物學方法（分子微生物學方法（Molecular microbial diversity ）.傳統培養分離方法是將定量樣品接種于培養基中，在一定的傳統培養分離方法是將定量樣品接種于培養基中，在一定的溫度下培養一定的時間，然后對生長的菌落計數和計算含量，并溫度下培養一定的時間，然后對生長的菌落計數和計算含量，并通過在顯微鏡下觀察其形態構造，結合培養

14、分離過程生理生化特通過在顯微鏡下觀察其形態構造，結合培養分離過程生理生化特性的觀察鑒定種屬分類特性。培養分離方法采用配比簡單的營養性的觀察鑒定種屬分類特性。培養分離方法采用配比簡單的營養基質和固定的培養溫度，還忽略了氣候變化和生物相互作用的影基質和固定的培養溫度，還忽略了氣候變化和生物相互作用的影響，這種人工環境與原生境的偏差使得可培養的種類大大減少響，這種人工環境與原生境的偏差使得可培養的種類大大減少(僅僅占環境微生物總數的占環境微生物總數的0.1%10%)。而且，此方法繁瑣耗時，不能。而且，此方法繁瑣耗時，不能用于監測種群結構的動態變化。用于監測種群結構的動態變化。2.1 傳統平板培養方法

15、傳統平板培養方法.0714212835020406080100120土壤細菌Hha I酶切數量Number of soil bacteria digested by Hha ITypes of OTUsOTUs種類LBWSACSEA 不同培養基培養的細菌種系型豐度趨勢線不同培養基培養的細菌種系型豐度趨勢線 .07142128020406080100土壤細菌Hha I酶切數量Number of soil bacteria digested by Hha ITypes of OTUsOTUs種類048h4896h96192h 不同培養時間培養的細菌種系型豐度趨勢線不同培養時間培養的細菌種系型豐度趨

16、勢線 .該方法最初由美國的該方法最初由美國的BIOLOG公司于公司于1989年開發成功，最初應用于純種微生年開發成功，最初應用于純種微生物鑒定，至今已經能夠鑒定包括細菌、酵母菌和霉菌在內的物鑒定，至今已經能夠鑒定包括細菌、酵母菌和霉菌在內的2000多種病原微生物和多種病原微生物和環境微生物。環境微生物。這種方法是基于微生物群落對這種方法是基于微生物群落對95種不同碳源的利用度來描述群落中微生物的種不同碳源的利用度來描述群落中微生物的動態變化。其具體做法是：利用由動態變化。其具體做法是：利用由95孔不同單一孔不同單一C源和源和1個對照孔組成的個對照孔組成的Biolog微平微平板系統，將土壤溶液接

17、種到每一個微平板孔中，在一定的溫育時間內，由于不同微板系統，將土壤溶液接種到每一個微平板孔中，在一定的溫育時間內，由于不同微生物對不同單一生物對不同單一C源利用程度和強度不一樣而發生不同生化代謝反應，最終使得每源利用程度和強度不一樣而發生不同生化代謝反應，最終使得每一個孔的溶液呈現出不同程度的顏色，微平板中每一孔的顏色變化可以通過酶標儀一個孔的溶液呈現出不同程度的顏色，微平板中每一孔的顏色變化可以通過酶標儀測定和記錄下來，這樣便可得到土壤微生物特有的測定和記錄下來，這樣便可得到土壤微生物特有的“代謝指紋代謝指紋”(Metabolic Fingerprint)。根據土壤微生物的代謝指紋圖譜，結合

18、有關的計算機分析軟件和己。根據土壤微生物的代謝指紋圖譜，結合有關的計算機分析軟件和己有的菌種庫資料，可以得到某些微生物的分類鑒定，對一般細菌的鑒定可以精確到有的菌種庫資料，可以得到某些微生物的分類鑒定，對一般細菌的鑒定可以精確到種，有的甚至精確到種以下的分類單元種，有的甚至精確到種以下的分類單元 。2.2 BIOLOG 鑒定系統鑒定系統.磷脂是構成生物細胞膜的主要成分，約占細胞干重的磷脂是構成生物細胞膜的主要成分，約占細胞干重的5%。在。在細胞死亡時，細胞膜很快被降解，磷脂脂肪酸被迅速的代謝掉，因細胞死亡時，細胞膜很快被降解，磷脂脂肪酸被迅速的代謝掉，因此它只在活細胞中存在，十分適合于微生物群

19、落的動態監測。另一此它只在活細胞中存在，十分適合于微生物群落的動態監測。另一個重要因素是脂肪酸具有屬的特異性，特殊的甲基脂肪酸已經被作個重要因素是脂肪酸具有屬的特異性，特殊的甲基脂肪酸已經被作為微生物分類的依據。磷脂脂肪酸譜圖分析法首先將磷脂脂肪酸部為微生物分類的依據。磷脂脂肪酸譜圖分析法首先將磷脂脂肪酸部分提取出來，然后用氣相色譜分析，得出分提取出來，然后用氣相色譜分析，得出PLFA譜圖。譜圖。2.3 脂肪酸譜圖法脂肪酸譜圖法(PLFAs、WCFA-FAMEs和其它方法和其它方法).熒光原位雜交是在熒光原位雜交是在20世紀世紀80年代末在放射性原位雜交技術的年代末在放射性原位雜交技術的基礎上

20、發展起來的一種非放射性分子細胞遺傳技術基礎上發展起來的一種非放射性分子細胞遺傳技術,以熒光標記取以熒光標記取代同位素標記而形成的一種新的原位雜交方法。它根據已知微生代同位素標記而形成的一種新的原位雜交方法。它根據已知微生物不同分類級別上種群特異的物不同分類級別上種群特異的DNA序列，以利用熒光標記的特異序列，以利用熒光標記的特異寡聚核苷酸片段作為探針，與環境基因組中寡聚核苷酸片段作為探針，與環境基因組中DNA分子雜交，檢測分子雜交，檢測該特異微生物種群的存在與豐度。該方法的特點是可以進行樣品該特異微生物種群的存在與豐度。該方法的特點是可以進行樣品的原位雜交，應用于環境中特定微生物種群鑒定、種群

21、數量分析的原位雜交，應用于環境中特定微生物種群鑒定、種群數量分析及其特異微生物跟蹤檢測，是目前在分子微生物生態學領域應用及其特異微生物跟蹤檢測，是目前在分子微生物生態學領域應用比較廣泛的方法之一。比較廣泛的方法之一。2.4 熒光原位雜交技術熒光原位雜交技術（fluorescent in situ hybridization, FISH）. FISH樣本的制備樣本的制備探針的制備探針的制備探針標記探針標記雜交雜交（染色體顯帶）（染色體顯帶）熒光顯微鏡檢測熒光顯微鏡檢測結果分析結果分析.采用限制性內切酶識別雙鏈采用限制性內切酶識別雙鏈DNA分子中特異的短列，在特定分子中特異的短列，在特定的位點將的

22、位點將DNA切開，來自不同個體基因組的含同源序列的酶切片切開，來自不同個體基因組的含同源序列的酶切片段具有不同的長度。通過常規的電泳分離，不同長度的片段停留段具有不同的長度。通過常規的電泳分離，不同長度的片段停留在不同的位置，即形成了限制性片段長度多態性指紋圖譜，在不同的位置，即形成了限制性片段長度多態性指紋圖譜， ARDRA(擴增擴增rDNA限制性分析限制性分析)和和T-RFLP(末端末端RFLP)都是由都是由RFLP發展而來的方法。發展而來的方法。T-RFLP法在法在PCR擴增進程中使用熒光標擴增進程中使用熒光標記的引物，因而記的引物，因而PCR產物被末端標記。產物被末端標記。RFLP(A

23、RDRA，RFLP)方方法通常選擇法通常選擇rRNA(rDNA)的基因作為擴增對象，廣泛用于研究土的基因作為擴增對象，廣泛用于研究土壤、水體和海洋沉積物等區系微生物群落的結構和多樣性。壤、水體和海洋沉積物等區系微生物群落的結構和多樣性。2.5 限制性片段長度多態性方法限制性片段長度多態性方法（restriction fragment length polymorphism，RFLP) .環境微生物環境微生物16S rDNA的文庫構建的文庫構建提取微生物總提取微生物總DNA分離、純化分離、純化DNA用通用引物擴增用通用引物擴增16SrDNA酶連、轉化構建質粒文庫酶連、轉化構建質粒文庫再以再以M1

24、3引物擴增引物擴增插入質粒中的插入質粒中的rDNA片段片段環境微生物環境微生物群落結構群落結構限制性酶切分析限制性酶切分析歸納分類歸納分類.同樣大小的同樣大小的DNA序列由于含有的堿基不同，各片段的序列由于含有的堿基不同，各片段的Tm值值也就不同。甚至一個堿基對的不同，都會引起也就不同。甚至一個堿基對的不同，都會引起Tm很大的差異，很大的差異，DGGE或或TGGE就是應用這種差異來區分不同的基因序列。這種就是應用這種差異來區分不同的基因序列。這種電泳方法在聚丙烯酰胺中加入甲酰胺（電泳方法在聚丙烯酰胺中加入甲酰胺（DGGE），從正極到負極），從正極到負極梯度遞加，或是形成溫度梯度（梯度遞加，或是

25、形成溫度梯度（TGGE）。電泳中的）。電泳中的DNA到達它到達它的變性甲酰胺濃度或溫度時，雙鏈部分解開，造成泳動速度發生的變性甲酰胺濃度或溫度時，雙鏈部分解開，造成泳動速度發生變化，從而達到分離效果。變化，從而達到分離效果。 2.6 變性梯度凝膠電泳變性梯度凝膠電泳（DGGE）和溫度梯度凝膠電泳和溫度梯度凝膠電泳（TGGE）.2.7 高通量測序方法高通量測序方法2005年，在國際頂級的學術期刊年，在國際頂級的學術期刊Nature上，來美國上，來美國454生命科學生命科學公司的公司的Margulies等人發表文章介紹了一種快速簡單的測序方法：結合了等人發表文章介紹了一種快速簡單的測序方法：結合了

26、DNA擴增的乳膠系統（擴增的乳膠系統（emulsion system）和皮升大小焦磷酸）和皮升大小焦磷酸（pyrophosphate）為基礎的測序方法）為基礎的測序方法焦磷酸測序（焦磷酸測序（pyrosequencing）方法。發明者宣稱，這種測序方法比傳統的方法。發明者宣稱，這種測序方法比傳統的Sanger測序的方法快測序的方法快100倍，假倍，假如利用這種方法來進行人類基因組的測序，那么在如利用這種方法來進行人類基因組的測序，那么在100多天內就可以完成。多天內就可以完成。在在2005年年底，年年底，454公司的研究人員將這種嶄新的測序技術轉化成了商品化公司的研究人員將這種嶄新的測序技術轉

27、化成了商品化的儀器的儀器Genome Sequencer 20 系統，并由羅氏應用科學部獨家負責在系統，并由羅氏應用科學部獨家負責在全球的銷售和技術服務等工作。全球的銷售和技術服務等工作。Genome Sequencer 20 系統一經推出，就系統一經推出，就受到了國際上基因組學專家的廣泛關注，并在世界各大測序實驗室相繼成受到了國際上基因組學專家的廣泛關注，并在世界各大測序實驗室相繼成功落戶。可以說，隨著功落戶。可以說，隨著Genome Sequencer 20 系統的不斷推廣應用和升級，系統的不斷推廣應用和升級，快速基因組測序的時代已經來臨，并對整個基因組學的研究將產生巨大的快速基因組測序的

28、時代已經來臨，并對整個基因組學的研究將產生巨大的推動作用。推動作用。.1）454測序技術（測序技術（GS FLX系統超高通量測序）系統超高通量測序）454技術以平均序列讀長技術以平均序列讀長240bp遙遙領先于同系列高通量測序儀，而遙遙領先于同系列高通量測序儀，而序列平均讀長在基因組測序拼接過程中至關重要。而且序列平均讀長在基因組測序拼接過程中至關重要。而且454 GS FLX 基因基因組測序儀是高性能并行計算機和服務器及配套軟件，建立信息處理平臺組測序儀是高性能并行計算機和服務器及配套軟件，建立信息處理平臺與數據庫，大大提高生物信息學分析能力；與數據庫，大大提高生物信息學分析能力； 擁有超強

29、的功能驗證和解析擁有超強的功能驗證和解析能力。能力。2）Solexa 高通量測序技術高通量測序技術Solexa 測序技術為新一代革新性技術分子生物學綜合技術平臺，具測序技術為新一代革新性技術分子生物學綜合技術平臺，具有高準確性，高通量，高靈敏度，和低運行成本等突出優勢有高準確性，高通量，高靈敏度，和低運行成本等突出優勢, 該測序技術該測序技術可在每一張芯片獲取可在每一張芯片獲取 1G 的堿基數據，超過了傳統測序儀近百倍的工作的堿基數據，超過了傳統測序儀近百倍的工作量。量。Solexa 測序技術為廣大用戶提供了強大的下一代測序方法，可以同測序技術為廣大用戶提供了強大的下一代測序方法，可以同時完成

30、傳統基因組學研究（測序和注釋）以及功能基因組學（基因表達時完成傳統基因組學研究（測序和注釋）以及功能基因組學（基因表達及調控，基因功能，蛋白及調控，基因功能，蛋白/核酸相互作用）研究。核酸相互作用）研究。高通量測序方法介紹高通量測序方法介紹. 土壤微生物總土壤微生物總DNA的提取方法的提取方法直接提取法直接提取法能夠破壞土壤結構，使團聚體內部的微生物釋放出來，能夠破壞土壤結構，使團聚體內部的微生物釋放出來，是進行隨機和非特異性裂解的有效方法是進行隨機和非特異性裂解的有效方法l反復凍融；反復凍融；l冰凍煮沸；冰凍煮沸；l玻璃珠勻漿；玻璃珠勻漿；l液氮研磨；液氮研磨；l超聲波破碎等。超聲波破碎等。.B. 間接提取法間接提取法Coarse particlesPellet (microbial cell)Soil colloid Soil.C.直接提取法與間接提取法比較直接提取法與間接提取法比較直接提取法：直接提取法：優點：優點：DNA產量高，偏嗜度低；產