1、ctDNA檢測技術循環腫瘤DNA(circulating tumor DNA,ctDNA)來源于腫瘤細胞的凋亡、壞死或分泌產生的DNA片段，是循環游離DNA(circulating cell-free DNA,cfDNA)的一部分1。ctDNA含有與其來源腫瘤DNA同樣的基因缺陷，如點突變，重排，擴增等2；其在血液中的半衰期短，可實時反映腫瘤的動態變化3;作為液體活檢的一種，可克服組織活檢中由于腫瘤異質性帶來的缺陷，檢測更全面4,因此ctDNA的檢測可用于癌癥早期診斷與癌癥分期、腫瘤的療效評估、復發監測和預后判斷等5。由ctDNA的質量和數量變化大, 因此需要高特異性和高靈敏度的檢測方法。目前

2、常用的方法有數字PCR (digital PCR, dPCR)、BEAMing (bead, emulsion,amplification and magnetic)、高通量測序(next generation sequencing, NGS)、ARMS等6。1.數字PCR1999年Vogelstein等提出了數字PCR(digtal PCR,dPCR)的概念7。數字PCR包括兩部分，即PCR 擴增和熒光信號分析。先將是樣品稀釋后分配到大量微小的反應單元中，每個單元包含或不包含一個或多個拷貝的目標分子,然后分別對目標分子進行擴增，擴增結束后對每個反應單元的熒光信號進行采集。數字PCR采用直接計

3、數的方法進行定量分析, 有熒光信號的反應單元中至少包含一個拷貝的目標分子，記為1，無熒光信號的則即為0，理論上，在樣品中極限稀釋的情況下，有熒光信號的反應單元數目等于目標DNA 分子的拷貝數。但是有的反應單元中可能包含兩個或兩個以上的目標分子，這時需要用泊松概率分布公式進行計算8。不同于傳統的qPCR技術,數字PCR 不受擴增曲線的循環閾值(CT) 和擴增效率的影響，無需參照，準確性和重復性好，可實現絕對定量分析9。根據反應單元類型不同，數字PCR分為三類: 微反應室/ 孔板數字PCR、微流控芯片和微滴數字PCR系統。微反應室/孔板數字PCR借助高通量自動上樣設備和增加的反應單元數,實現快速精

4、確取樣，提高檢測靈敏度。微流控芯片技術是一種基于含有數千個超高密度親疏水微孔芯片的dPCR平臺，可實現高通量、低成本分析。微滴數字PC( droplet digital PC,ddPCR)是將含有目標分子的樣品分成成千上萬個納升級的油包水微滴，再對每個微滴進行擴增，和熒光信號的采集2 / 12，更容易實現小體積和高通量10。數字PCR可絕對定量，是目前靈敏度最高的檢測技術，但其也存在一定缺點，如生成的微滴必須服從泊松分布，所以不適合高濃度DNA樣本檢測，；只能檢測已知的突變且一次只能檢測一種突變11,12。2.BEAMing技術BEAMing技術在檢測ctDNA內體腫瘤突變具有非常高的靈敏度，

5、它是結合了數字PCR以及流式技術的一種檢測方法，最早是由Bert Vogelstein提出。其方法是每一類DNA分子都會專一的與磁性珠相連接，然后DNA分子之間的差異可以通過流式細胞儀檢測熒光標記來做出評估。這種方法是基于小珠(Bead)、乳濁液(Emulsion)、擴增(Amplification)、磁性(Magnetic)，這四個主要組分來構建的，所以被稱作為BEAMing13。 BEAMing 技術的過程包括：首先是分離和純化血漿中的DNA；接著是預擴增步驟，通過使用常規PCR 擴增目的基因片段，使用引物與已知的標記序列混合；然后，這些DNA 模板再通過乳液PCR 擴增，應用引物探測這些

6、序列，通過鏈酶親和素磁珠相互作用與有磁性的微膠珠結合。通過這種方式設計的系統，在反應結束之前，每個乳液液滴中生成的PCR 產物將保持對微膠珠的附著性，使其可以很容易地通過磁性進行分離和純化14。并且，BEAMing技術是利用磁珠來吸附游離DNA，它可以從1萬個健康細胞DNA中檢測出那一個ctDNA分子，具有較高的敏感性，同時在很多研究中其在腫瘤組織中發現的突變都和ctDNA部分突變是一致的15,16。BEAMing技術相比其他檢測技術具有很多優勢：（一）在常規實驗室條件下，數以萬計的DNA分子可以通過該種方法來進行評估。（二）特異的突變可以通過流式細胞儀進行分離篩選以備進一步分析和研究。（三）

7、BEAMing技術可以用來對特定組織或者人群中罕見的突變，以及研究一般基因序列或轉錄的產物的變異都可以提供相應的鑒別和定量分析。由于外周血流中ctDNA 拷貝的數量是很低的，特別是相較于野生型DNA 來說。出于這個原因，使用PCR 進行DNA 擴增是BEAMing 過程中的一個重要部分，是確保可靠檢測的保證5。然而，BEAMing 這項檢測技術只能檢測已知突變，且成本較高17 同時，它的操作也較復雜，通量低，且單分子擴增在非均一的微滴中實現，需要RCR預擴增，會增加試驗誤差12。3.基于NGS技術的檢測方法ctDNA檢測技術，除了基于PCR檢測方法之外，還有一種以高通量測序技術，又稱“下一代”

8、測序技術（NGS）為基礎的檢測方法。這種方法主要是選定十幾到幾十個腫瘤相關基因進行測序，測序通量和效率高。根據富集策略的不同，基于NGS的技術目前又可分為靶向擴增子測序(TAS)及目標序列捕獲測序(TCS)。靶向擴增子測序(TAS)技術是針對目的基因設計幾十對甚至上百對PCR引物，利用多重PCR擴增富集。代表性方法有標記擴增深度測序(TAM-Seq)。Forshew等18 通過TAM-Seq測序技術，檢測患者癌細胞中ctDNA片段，從而找到腫瘤樣品中的遺傳突變。這種方法無需外科手術或者活檢，就可以找到癌癥突變。目標序列捕獲測序(TCS)技術是針對目的基因設計探針，通過捕獲雜交的方法富集，代表性

9、方法有深度測序腫瘤個體化建檔法（CAPP-Seq）。Newman等19從腫瘤基因突變數據庫找復發突變相關的外顯子，再從腫瘤基因圖譜庫的407位非小細胞肺癌患者全基因組測序結果篩選。然后應用迭代算法使每個非小細胞肺癌患者樣本的錯義突變最大化來簡化篩選器(selector)的大小，最后的selector能識別139個復發突變基因中的521個外顯子和12個內含子，長度約為125kb，平均能夠識別4個單核苷酸突變（SNV），在96%的肺腺癌或鱗癌患者身上有效。基于NGS技術的檢測方法靈敏度高，能同時檢測多個基因的多種變異。但是其技術復雜，數據處理困難，實驗室水平差異較大，儀器與試劑的成本相對較高。想要

10、臨床應用，首先要將其標準化12。4.ARMS技術ARMS，全稱為突變擴增系統（Amplification refractory mutation system），是由Newton等人首先建立并用于檢測基因已知突變的方法20。利用PCR引物3端堿基必須與其模板DNA互補才能進行有效擴增的基本原理，根據已知突變位點設計引物，使3末端堿基分別與突變和野生型模板堿基進行互補，實現擴增，達到將“突變”模板與“野生”模板區分的目的12。ARMS法的主要特點有高特異性，高靈敏度以及耗時短，成本低，操作簡單等特點。其檢測結果的高特異性關鍵在于引物設計。ARMS法所用的引物是通過篩選能夠識別單個位點等位基因的引

11、物，進而保證了結果的高特異性。而ARMS法檢測點突變的檢出率還取決于PCR反應條件的優化和防止引物與靶DNA錯配可能發生的錯配延伸。PCR反應條件的優化可以通過改變引物濃度、靶DNA濃度、Taq酶濃度以及反應體系溫度進行調整21。此外，在反應體系中加入甲酰胺可以減少非特異性擴增，在引物3末端引入第二個錯配堿基也可以提高引物的特異性21。通過在體系中加入多對引物可以實現多重擴增，實現基因的多位點突變檢測22。ARMS法檢測靈敏度明顯高于直接測序法等其他方法，可檢測出樣品中含量低至0.1%1.0%的突變基因；且該方法結合PCR技術，操作簡單，耗時短，成本低，結果直觀23。目前，ARMS法已成為國際

12、上腫瘤個體化分子檢測最重要、最先進的技術之一，其在臨床應用中的優勢已被業內專家廣泛認可。但該方法只能用于檢測已知突變，在一定程度上限制其應用。ARMS法檢測可以分為實時熒光定量PCR和巢式ARMS法電泳檢測。實時熒光定量PCR是指ARMS技術結合探針對擴增產物進行檢測，在實時定量PCR平臺上實現對樣品DNA中稀有突變的檢測24。而巢式ARMS法電泳檢測是利用凝膠電泳技術檢測擴增帶，從而實現結果分析25。隨著ARMS技術的發展，商品化的ARMS試劑盒相繼問世，包括人表皮生長因子受體（EGFR）基因突變檢測試劑盒，人KARS基因突變檢測試劑盒，四項耳聾基因檢測試劑盒等13。總結 作為重要的腫瘤分子

13、標志物，ctDNA在腫瘤的診斷、治療監測、預后等方面發揮著重要的作用，而DNA測序技術的發展使得通過檢測ctDNA來指導腫瘤的臨床進展變得更加切實可行。數字PCR技術、BEAMing技術、NGS技術、ARMS技術在ctDNA的檢測中各具其獨特的優勢和不足之處，實際應用時應結合具體條件決定采用何種檢測方法。相信隨著技術的進步，ctDNA 將會逐漸從科研領域向臨床轉化發展。參考文獻1 Yong E. Cancer biomarkers: Written in blood. Nature, 2014, 511(7511):524.2 Crowley E, Nicolantonio F D, Loup

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