1、消毒劑驗證方案Disinfectants Validation Protocol編號Code: 版本Version: 編寫Prepared by:日期Date:審 核 人 日 期 Reviewed by Date批準(zhǔn)Approved by:日期Date:消毒劑驗證方案Disinfectants Validation Protocol變更記錄Change Log版本號Version變更描敘Description變更細(xì)節(jié)Section changed批準(zhǔn)日期Release Date目 錄Contents1.簡介42.實施日期43.驗證小組名單44.材料與試劑45.設(shè)備和儀器56.中和劑鑒定試驗57

2、.載體定量殺滅試驗78.現(xiàn)場考察試驗79.附件810.相關(guān)SOP811.修改事項812.再驗證813.文檔89 / 81. 簡介 消毒劑常用于設(shè)備設(shè)施表面消毒。本公司使用的消毒劑有75%酒精、0.1%新潔爾滅、2%來蘇爾和6%過氧化氫。其中0.1%新潔爾滅主要用于墻面、地面和門的表面消毒，75%酒精和6%過氧化氫主要用于設(shè)備、操作臺面、門把手消毒，2%來蘇爾主要用于地漏消毒。本方案結(jié)合特定菌挑戰(zhàn)試驗和現(xiàn)場考察試驗，對消毒劑的殺菌效力進行確認(rèn)。2. 實施日期項目中和劑鑒定試驗 載體定量殺滅試驗現(xiàn)場考察實施日期3. 驗證小組名單部 門姓 名職 責(zé)批準(zhǔn)方案、報告QA審核驗證方案、記錄和報告QC審核驗

3、證方案、記錄和報告生產(chǎn)部審核驗證方案、記錄和報告QA編寫和實施驗證方案QA現(xiàn)場微生物監(jiān)測取樣QC實施驗證方案4. 材料與試劑4.1 菌株 （1）細(xì)菌： 金黃色葡萄球菌CMCC(B) 26003大腸桿菌CMCC(B) 44102 （2）細(xì)菌芽孢：枯草桿菌芽孢CMCC(B) 63501（3）真菌：白色念珠菌CMCC(F) 980014.2 培養(yǎng)基營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基：營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基粉 20.0g純化水 1000ml將上述成分混合后，加熱至完全溶解，調(diào)pH至7.1±0.2，分裝，于121高壓蒸氣滅菌15min備用。營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基：營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基粉 31.0g純化水 1000ml將上述成分混合后，

4、加熱至完全溶解，調(diào)pH至7.1±0.2，分裝，于121高壓蒸氣滅菌15min備用。改良馬丁培養(yǎng)基： 改良馬丁培養(yǎng)基粉 28.0g 純化水 1000ml將上述成分混合后，加熱至完全溶解，調(diào)pH至6.4±0.2，分裝，于115高壓蒸氣滅菌20min備用。改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基： 改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基粉 42.0g 純化水 1000ml將上述成分混合后，加熱至完全溶解，調(diào)pH至6.4±0.2，分裝，于115高壓蒸氣滅菌20min備用。4.3 稀釋液：1%蛋白胨-PBS溶液4.4 中和劑：0.1%卵磷脂+1%吐溫80溶液1%硫代硫酸鈉溶液+0.3%卵磷脂+1%吐溫80溶液4.5

5、 無菌載片：1.5cm×1.5cm不銹鋼片4.6 無菌試管4.7 無菌平皿(90mm)4.8 含玻璃珠的無菌三角瓶4.9 消毒劑：75%酒精，0.1%新潔爾滅，2%來蘇爾，6%過氧化氫4.10 移液器及配套無菌吸頭:0-100ul，100-1000ul4.11 計時器5. 設(shè)備和儀器5.1 HS-1300-V型凈化工作臺5.2 電動混合器 5.3 SHP-150型細(xì)菌培養(yǎng)箱5.4 GNP-9270型生化培養(yǎng)箱5.5 人工菌落計數(shù)器6. 中和劑鑒定試驗 6.1 細(xì)菌和真菌菌液制備接種金黃色葡萄球菌的新鮮培養(yǎng)物至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，3035培養(yǎng)18-24h；接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至改良

6、馬丁培養(yǎng)基中，2328培養(yǎng)18-24h。將上述培養(yǎng)物用稀釋液稀釋至所需濃度備用。6.2 枯草桿菌芽孢懸液的制備6.2.1 取枯草桿菌新鮮培養(yǎng)物（18-24h）適量至營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基斜面，使菌液布滿營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基斜面，再將多余的培養(yǎng)物吸出，將斜面置于3035培養(yǎng)57天。用接種環(huán)取菌樣少許涂于玻片上，進行芽孢染色鏡檢。當(dāng)芽孢形成率達(dá)95以上時，即可進行以下處理。否則，應(yīng)繼續(xù)在室溫下放置一定時間，直至達(dá)到上述芽孢形成率后再進行以下處理。6.2.2 加適量無菌水于每一營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基斜面試管內(nèi)，以接種環(huán)輕輕推刮下菌苔。吸出第一批洗下的菌懸液，再取適量無菌水于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基斜面，重復(fù)洗菌一遍。將第一和第二批

7、洗下的菌懸液集中于一含玻璃珠的無菌三角燒瓶內(nèi)，振搖5min，打碎菌塊，使成均勻的芽孢懸液。6.2.3 用無菌棉花或紗布過濾芽孢懸液，清除其中的瓊脂凝快。6.2.4 將過濾后的芽孢懸液放于80水浴中10min以殺滅殘余的細(xì)菌繁殖體。待冷至室溫后，保存于4冰箱中備用。有效使用期為半年。6.2.5 芽孢懸液在使用時，應(yīng)先進行活菌計數(shù)。6.3 染菌載片制備6.3.1 載片脫脂處理：將載片放在含肥皂的水中煮沸30min，以純化水洗凈，用純化水煮沸10min，用蒸餾水漂洗至pH中性晾干備用。6.3.2 菌液滴染：將經(jīng)滅菌的載體平鋪于無菌平皿內(nèi)，滴加105cfu/ml的菌液10ul，并用接種環(huán)涂勻整個載體表

8、面。滴染菌液后，載體置37溫箱內(nèi)干燥約20-30min后再使用。6.4 中和劑鑒定操作程序6.4.1 根據(jù)試驗分組，準(zhǔn)備足量試管和平皿，依次進行編號。 第1組：用無菌鑷子取一染菌載片移入含有10ml中和劑的試管中。作用10min后，用電動混合器混合20s，或?qū)⒃嚬苷翊?0次，混勻，分別吸取1.0ml，接種于兩個平皿中，做活菌計數(shù)。細(xì)菌放3035培養(yǎng)48h，芽孢放3035培養(yǎng)72h，真菌放2328培養(yǎng)72h觀察最終結(jié)果。 第2組：用無菌鑷子取一染菌載片移入含有10ml中和產(chǎn)物（以浸有消毒劑的無菌載片置10ml中和劑內(nèi)，作用10min）的試管中。作用10min后，用電動混合器混合20s，或?qū)⒃嚬苷?/p>

9、打80次，混勻，分別吸取1.0ml，接種于兩個平皿中，做活菌計數(shù)。細(xì)菌放3035培養(yǎng)48h，芽孢放3035培養(yǎng)72h，真菌放2328培養(yǎng)72h觀察最終結(jié)果。 第3組：用無菌鑷子取一染菌載片移入含有10ml稀釋液的試管中。作用10min后，用電動混合器混合20s，或?qū)⒃嚬苷翊?0次，混勻，分別吸取1.0ml，接種于兩個平皿中，做活菌計數(shù)。細(xì)菌放3035培養(yǎng)48h，芽孢放3035培養(yǎng)72h，真菌放2328培養(yǎng)72h觀察最終結(jié)果。 第4組：分別吸取稀釋液和中和劑各1.0ml于同一無菌平皿內(nèi)，加入上述試驗同批次的培養(yǎng)基15-20ml，培養(yǎng)觀察。6.4.2 判定標(biāo)準(zhǔn) 實驗結(jié)果符合以下全部條件，所測中和劑

10、可判為合格： 第1、2和3組有相似量試驗菌生長，其組間菌落數(shù)誤差率不應(yīng)超過15%。第1、2和3組菌落數(shù)誤差率計算公式如下： （3組間菌落平均數(shù)-各組菌落平均數(shù)）的絕對值之和誤差率×1003×3組間菌落平均數(shù) 第4組無菌生長。否則，說明試劑有污染，應(yīng)重新進行試驗。6.4.3 結(jié)果記錄附件1：中和劑鑒定試驗結(jié)果記錄7. 載體定量殺滅試驗7.1 將菌液用稀釋液稀釋成 108cfu/ml的菌懸液。7.2 取已滅菌的載體放于無菌平皿內(nèi)，每種微生物試驗用載體分"5分鐘組"、"10分鐘組"和"15分鐘組"共3組。7.3 滴染10

11、8cfu/ml的菌懸液10ul于無菌載體上，載體置37溫箱內(nèi)干燥 約20-30min后再使用。7.4 用無菌鑷子將染菌載體加入含有消毒劑的平皿中，作用至規(guī)定時間，將染菌載體移入含有10ml中和劑的試管內(nèi)，用電動混合器混合20s，或?qū)⒃嚬苷翊?0次，使菌片上的微生物被洗脫進入中和液內(nèi)，再放置5 min，使中和作用充分。最終進一步混勻，適當(dāng)稀釋，分別吸取1.0ml接種于兩個平皿中，做活菌計數(shù)。細(xì)菌放3035培養(yǎng)48h，芽孢放3035培養(yǎng)72h，真菌放2328培養(yǎng)72h觀察最終結(jié)果。7.5 另取一平皿，注入10ml稀釋液代替消毒劑，放入染菌載片，作用10min后取出載片，移入含有10ml中和劑的試管

12、內(nèi)，其隨后的試驗步驟與上述試驗相同，作為陽性對照。7.6 判定標(biāo)準(zhǔn)消毒劑對挑戰(zhàn)菌的殺滅對數(shù)值3判為合格。7.7 殺滅對數(shù)值計算殺滅對數(shù)值（KL）對照組平均活菌濃度對數(shù)值-試驗組活菌濃度對數(shù)值7.8 結(jié)果記錄附件2：載體定量殺滅試驗結(jié)果記錄8. 現(xiàn)場考察試驗8.1 消毒劑的配制：潔凈區(qū)操作人員按照凍干粉針劑車間消毒劑的配制和使用（SOP 034401）配制75%酒精、0.1%新潔爾滅、2%來蘇爾和6%過氧化氫。8.2 生產(chǎn)結(jié)束后操作人員按照車間生產(chǎn)區(qū)清潔（SOP 030492）對潔凈區(qū)進行清潔消毒。8.3 清潔消毒完畢15分鐘后，現(xiàn)場QA使用接觸皿對清潔消毒后的潔凈區(qū)進行表面微生物監(jiān)測取樣，共測

13、定3次。表面微生物監(jiān)測位點詳見附件3。8.4 測定結(jié)果記錄附件4：潔凈區(qū)表面微生物監(jiān)測結(jié)果記錄8.5 合格標(biāo)準(zhǔn)潔凈級別表面菌落數(shù)（非地面）表面菌落數(shù)（地面）100級1cfu/皿3 cfu/皿10000級5 cfu/皿10 cfu/皿9. 附件11.1 中和劑鑒定試驗結(jié)果記錄11.2 載體定量殺滅試驗結(jié)果記錄11.3 表面微生物監(jiān)測點11.4 潔凈區(qū)表面微生物監(jiān)測結(jié)果記錄10. 相關(guān)SOP文件編號文件名稱034401凍干粉針劑車間消毒劑的配制和使用030492車間生產(chǎn)區(qū)清潔020141微生物實驗室管理020143物品進出微生物檢驗室020342微生物檢驗區(qū)的清潔消毒020343培養(yǎng)基的配制020344細(xì)菌的接種、傳代和保存020377高壓滅菌021267微生物數(shù)量的測定11. 修改事項在實施過程中，如果方案需要修改，必須提交書面的報告，闡述修改的原因，修改的內(nèi)容，并經(jīng)過相關(guān)部門及QA的認(rèn)可。修改后的方案同先前執(zhí)行的方案一起歸檔。12. 再驗證12.1 當(dāng)消毒劑的使用濃度和清潔消毒程序