1、葡多酚對體外培養肝細胞PKC表達影響                 【摘要】 目的 體外觀察葡多酚(GPC)對小鼠肝細胞蛋白激酶C(PKC)表達的影響。方法 將正常小鼠肝細胞加入不同劑量GPC共同培養后，用免疫細胞化學法檢測各組肝細胞PKC表達；四甲基偶氮噻唑藍(MTT)法檢測各組肝細胞的增殖活性。結果 100mg/L GPC組肝細胞內PKC陽性表達率和細胞增殖活性分別為3424%和0654±0062，經統計學2檢驗和t檢驗

2、，與正常對照比較差異均有統計學意義(P<005)。結論 葡多酚可促進小鼠肝細胞PKC表達，提高肝細胞增殖活性。 【關鍵詞】 葡萄原花青素葡多酚，又稱葡萄原花青素(grape procyanidins,GPC)，是從葡萄籽中提取的天然多酚類物質。據國內外報道，GPC不僅具有清除自由基、抗氧化等生物學功效，還能促進多種細胞的增殖活性1-3。本實驗采用體外細胞培養，研究不同劑量GPC對小鼠肝細胞PKC蛋白表達的調控作用，探討其與細胞增殖活性的關系。1 材料與方法11 材料111 GPC樣品 使用溶劑浸提法從葡萄籽中制取，含量>95%；標準品(日本島田株式會社)。112 試驗動物 山東省實

3、驗動物中心提供的昆明小鼠，體重1820g。113 主要試劑與儀器 一抗小鼠PKC單克隆抗體(簡稱一抗)(武漢博士德公司)；二抗山羊抗小鼠IgG抗體HRP(簡稱二抗)(北京中杉金橋公司)；二氨基聯苯胺(DAB)顯色試劑盒(武漢博士德公司)；PKC一抗工作濃度為1：50；RPMI1640培養基(美國GIBCO公司)；新生牛血清(奧地利PAA公司)；顯微鏡與照相機(日本OLIMPUS公司)；酶標? （葡多酚對體外培養肝細胞PKC表達影響 ?美國BECKMAN公司)。12 實驗方法121 肝細胞懸液的制備 將新鮮小鼠肝組織剪碎，過100目不銹鋼網，3層無菌沙布過濾，1000r/min離心10min，棄

4、上清，加磷酸鹽緩沖液(PBS)1000r/min離心10min，制成細胞濃度為1×106、細胞活力>95%的肝細胞懸液備用。122 PKC蛋白的表達 將上述細胞懸液培養于含有10%新生牛血清、100U/ml青霉素和100g/ml鏈霉素的RPMI1640培養基中，將蓋玻片置于6孔板培養皿中，加入終濃度10，50，100mg/L的GPC，空白對照加入RPMI1640，置37、5% CO2培養箱培養24h，取出蓋玻片，肝細胞經4%多聚甲醛固定10min。用免疫細胞化學法按檢測試劑盒說明檢測肝細胞中PKC蛋白的表達4：10%H2O2滅活內原性過氧化物酶，5%小牛血清蛋白(BSA)封閉液

5、室溫20min，加入一抗，二抗(DAB)顯色，蘇木素-伊紅(HE)染色，脫水，透明和封片。高倍(×400)顯微鏡下觀察PKC蛋白的表達水平。選擇細胞清晰的視野視察，在每個組觀察2500個肝細胞記錄其中的陽性細胞數。根據公式：PKC蛋白陽性表達率=PKC陽性細胞數/計數細胞總數×100%計算陽性表達率。123 MTT法測定各組小鼠肝細胞的增殖活性 將肝細胞懸液接種于96孔培養板，每孔01ml，加入終濃度10，50，100mg/L GPC，置37mg/L GPC，置37、5%CO2培養箱培養24h，用四甲基偶氮噻唑藍(MTT)法在波長492nm測定細胞增殖活性，用吸光度(A)值

6、表示。根據公式計算GPC對小鼠肝細胞增殖的促進率：促進率(%)=(GPC組-正常對照組)/正常對照組×100%。124 統計分析 采用SPSS110統計軟件進行t檢驗和2檢驗。2 結果21 PKC蛋白的表達結果 PKC蛋白在細胞內為胞漿表達，光鏡下呈現棕黃色顆粒。 本實驗結果可見，100mg/L GPC組細胞漿內棕黃色顆粒的細胞多、顏色深，為PKC蛋白強表達(圖1)，正常對照組胞漿內表達的細胞數少、染色淺，為弱表達(圖2)。2組的陽性表達率分別為3424%和1272%經2檢驗，差異有統計學意義(P<005)。10，50mg/L GPC組PKC表達與正常對照組比較差異無統計學意義

7、(P>005)，見表1。22 增殖活性檢測結果 100mg/L GPC組的增殖活性分別為(0654±0062)，正常對照組的增殖活性為(0405±0126)，經t檢驗，兩者差異有統計學意義(P<005)。10，50mg/L GPC組與正常對照組比較差異無統計學意義(P>005)，見表2。圖1 高劑量GPC組PKC強表達(DAB×200)（略）圖2 低劑量GPC組PKC弱表達(DAB×2000)（略）表1 各組PKC蛋白的表達（略）注：與正常對照組比較，*P<0.05表2 各組小鼠肝細胞增殖活性（略）注：與正常對照組比較，*P<

8、;0053 討論本研究顯示，100mg/L GPC組PKC蛋白表達水平較正常對照組顯著升高，且呈現隨GPC劑量的升高，PKC陽性表達率逐漸升高的明顯劑量-反應關系，表明GPC可激活PKC，使PKC蛋白表達水平上升，增強細胞內信息傳遞與細胞活化的影響，促進細胞的增殖分裂。本研究結果表明，GPC對肝細胞的增殖活性有促進作用，與文獻報道GPC可促進細胞增殖活性的結果相一致5，也同本實驗的PKC結果相吻合。綜上所述，GPC可提高肝細胞PKC表達水平，對肝細胞增殖活性有促進作用。同時提示，GPC對肝細胞增殖活性的促進作用可能是通過對PKC調控而實現的。?(此 資 料 轉 貼 于 ) 靜慰嘉南住?/STR

9、ONG>1 Puiggros F,Llopiz N,Ardevol A,et al.Grape seed procyanidins prevent oxidative injury by modulating the expression of antioxidant enzyme systemsJ.J Agric Food Chem,2005,53(15):6080-6086.2 那娜，鐘進義.葡多酚對血管內皮細胞自由基損傷的影響J.營養學報，2005，27(1)：58-60.3 Takahashi T,Kamimura A,Shirai A,et al.Several selecti

10、ve protein kinase C inhibitors includins procyanidins promote hair growthJ.Skin Pharmacol Appl Skin Physiol,2000,13(3-4):133-142.4 李亞麗，馬克里，鄒偉，等.磷脂酰乙醇胺N-甲基轉移酶2過表達對大鼠肝癌細胞不同亞型蛋白激酶C表達及轉位的影響J.中華肝臟病雜志，2005，13(9)：678-681.5 Ishikawa M,Maki K,Tofani J,et al.Grape seed proanthocyanidins extract promotes bone formation