1、紅球菌共代謝單氯苯甲酸及固定化細胞的研究齊云投稿日期：2006-06-28作者簡介：齊云（1977-），女，漢，河北 聯系方式：電話：02289845241；Email: ，趙林和譚欣(天津大學，環境科學與工程學院，天津，300072)文摘: 氯代苯甲酸廣泛應用于工農業生產中，導致了其大量釋放到環境中。同時，做為模式化合物用于研究氯代芳香化合物的生物降解及闡述氯代化合物生物脫氯的策略。作者自天津農藥廠污水處理系統的活性污泥中分離純化出高效降解3氯苯甲酸的細菌。經鑒定將其歸為紅平紅球菌(Rhodococcus erythropolis)。該菌能在10-30°C溫度范圍以3-氯代苯甲酸為

2、唯一碳源和能源生長，將苯環上的有機氯完全釋放出來。由于該菌有廣泛的溫度適應性，尤其是能在10°C低溫情況下利用底物，這對于低溫地區生物修復有重要意義，在低溫地域有很廣泛的應用前景。但該菌缺乏獨立分解2-或4-氯代苯甲酸的酶系。在以葡萄糖為外加碳源的條件下，菌株可以共代謝降解2-氯苯甲酸，但不能分解4-氯苯甲酸。研究了以聚乙烯醇(PVA),海藻酸鈉，殼聚糖為載體時，固定化細菌的效果。結果表明，單以PVA為載體時，固定化細胞不能成球性；以海藻酸鈉為載體時，固定化細胞強度不足，培養一定時間后大部分菌球破裂；在海藻酸鈉溶液中混入適量的PVA或殼聚糖都可大幅度提高固定化細胞的強度和韌性。關鍵詞

3、：氯苯甲酸；生物降解；共代謝；固定化氯代苯甲酸(chlorobenzoate, CBA)作為有機合成中間體或直接作為農藥、除草劑、防腐劑等而在工業中得到廣泛應用1。據報道，氯代苯甲酸是多氯聯苯(PCB)完全降解的限速步驟2。由于氯原子的引入，導致了苯環結構發生改變，使得氯代苯甲酸的生物降解性能大大降低，同時，由于氯代苯甲酸有較好的水溶性，容易進入自然環境，對人體健康造成嚴重的影響，對生態系統構成威脅。因此在水體凈化和土壤修復過程中，氯代苯甲酸的無害化處理是必不可少的。共代謝是微生物對有機物作用的一種方式,現在對微生物共代謝作用一般定義為：只有在初級能源物質存在時，才能進行的有機化合物的生物降解

4、過程, 在這一過程中，微生物體依賴初級基質的消耗而生長，同時具有降解不可利用碳源和能源物質的能力3。工業廢水中含有大量人工合成的污染物，按照傳統的方法很難降解。同時在又中存在眾多營養物質，因此微生物菌群可以通過共代謝降解難降解或本身不能降解的污染物。研究某一高效菌株對特定有機物在共基質的條件下的降解不僅為生物處理污水技術提供理論依據，而且對實際水處理工程具有指導意義。目前, 國外已將氯代苯甲酸作為模式化合物用以研究氯代芳香化合物的生物降解以及闡述微生物脫氯的策略4。但是國內對該化合物的生物降解性能研究還非常的少，并且缺乏對同類有機物共代謝降解等方面的研究。因此，開展生物降解氯代苯甲酸的研究就顯

5、得尤為重要。1. 材料與方法1.1 菌株來源活性污泥采自天津市農藥股份有限公司污水處理車間。活性污泥處理后進行富集培養，通過純種分離得到高效分解菌株，命名為S7。1.2 培養基基本培養基(MM)采用Kozlovsky等人方法5。加入200mg/L 3-氯代苯甲酸(3-CBA，Sigma-Aldrich, USA)做為唯一碳源和能源。1.3 形態觀察及生理生化特性 生理生化特性參照伯杰系統細菌學鑒定手冊6。1.4 16S rRNA基因擴增及序列測定將純培養的菌株接入10µl滅菌水中，送至寶生物工程有限公司，測定16S rRNA 基因序列，得到的1427bp序列與美國國家生物技術信息中心

6、 (NCBI)的BLAST工具進行對比(http:/ /BLAST/)，對比結果采用MEGA v.3軟件分析發育樹分析。1.5 菌懸液的制備及培養條件菌懸液的制備：將菌株接種在營養培養基中培養24h，以12,000r/min離心10min，收集菌體，用滅菌后的無機鹽培養基洗滌3次，重懸于10mL無機鹽培養基中制成菌懸液。將菌懸液加入1000mL錐形瓶中，加入300mL滅菌的氯代苯甲酸無機鹽培養液，使氯代苯甲酸的終濃度為200mg/L，在不同溫度下，140 rpm恒溫搖床中振蕩培養。每隔一定時間取樣，立即測定菌體濃度樣品以12,000r/min離心10mi

7、n后，取上清液經0.22µm 濾膜過濾，測定氯代苯甲酸、氯離子濃度。1.6 分析方法3-氯代苯甲酸含量的測定：采用反相高壓液相色譜 (安捷侖1100，美國)，SupelcosiTM LC18色譜柱(5m, 250×4.6mm)，流動相為甲醇：0.25%乙酸58：42。進樣量為20µl，流速為1 mL/min，在235nm紫外檢測。菌體生長測定：采用美國瓦里安紫外可見分光光度計在550nm條件下測定吸光度。氯離子測定：采用美國戴安Dionex 600離子色譜檢測。1.7 共代謝降解不同取代的單氯代苯甲酸將菌懸液加到以葡萄糖為生長底物的含有2-或4-氯代苯甲酸的基本培

8、養液中，使葡萄糖終濃度為500mg/L，2-或4-氯代苯甲酸的終濃度達到200mg/L，在30°C 140 rpm振蕩培養，每隔一定時間取樣，立即測定菌體濃度樣品以12,000r/min離心10min后，取上清液經0.22µm 濾膜過濾，測定氯代苯甲酸濃度。1.8 固定化細菌載體的選擇采用海藻酸鈉、聚乙烯醇(PVA)、殼聚糖為固定化細胞載體，測定不同濃度載體及幾種載體混合使用時，固定化小球的性能。2 結果與討論2.1 菌種分離鑒定形態學特性：在營養瓊脂培養基中培養14h后，菌株S7的菌絲從菌落中央開始斷裂，菌落成圓形，光滑，凸起，具有粘性，色微紅。24h后形成球形或桿狀。在

9、營養瓊脂、葡萄糖天門冬素瓊脂培養基中均無氣生菌絲。革蘭氏陽性，嚴格好氧，不抗酸。細胞壁化學分析：細胞壁含有特征性的阿拉伯糖和半乳糖以及meso-DAP，細胞壁屬于型。生理生化反應：菌S7的特性見表1。根據形態特征和生理生化反應，將該菌歸為紅球菌屬(Rhodococcus)。16S rDNA分析： 菌株S7的16S rDNA序列測定后網上提交到NCBI數據庫，登陸號為DQ306923。利用對比工具對其和其他同屬的菌株進行對比，構建系統發育樹，結果表明菌株S7與紅平紅球菌的親緣關系最近，因此，該菌鑒定為紅平紅球菌(R. erythropolis)。表1 菌株S7生理生化特征Table 1 Chem

10、otaxonomic properties of strain S7生理生化特性結果碳源利用結果淀粉水解葡萄糖硝酸鹽還原L阿拉伯糖纖維素分解D果糖酪素分解D半乳糖尿素水解D甘露糖6 NaCl 生長D山梨糖牛奶凝固肌醇V.P實驗檸檬酸鈉明膠液化油酸利用葡萄糖產酸苯酸鈉利用葡萄糖產氣氯代兒茶酚過氧化氫酶2氯代苯甲酸脲酶3氯代苯甲酸氧化酶4氯代苯甲酸運動性庚烷革蘭氏染色甲苯生長溫度范圍437°C（最適30°C）石油醚生長pH范圍5.0 12.0（最適7.0）苯酚紅球菌是革蘭氏陽性菌，在處理難降解有機物中起重要作用8。迄今為止，已經發現該屬的菌株可以分解酚、萘、蒽等9。國外對氯代苯

11、甲酸的降解菌的研究主要集中在革蘭氏陰性菌，本文為研究革蘭氏陽性菌降解氯代苯甲酸提供了一個新的資料，也為進一步的生物降解工業奠定了基礎。2.2 不同溫度下菌株對3-氯代苯甲酸降解能力比較將菌株S7 在10、20、30°C三種不同溫度下培養，定時取樣，測定菌體生長量、釋放的氯離子濃度及剩余3-氯代苯甲酸含量。實驗結果見圖1、2、3。圖 1 紅平紅球菌S-7在不同溫度培養條件下菌體濃度變化(OD550)Fig. 1 Growth of R. erythropolis S-7 at different temperatures從圖1可知，該菌能在1030°C的溫度范圍內生長，但在1

12、0°C時，菌體的延遲期最長，需要24h的適應期才開始生長。20°C和30°C培養條件下菌體的生長曲線非常相似，在30°C時生長最佳。圖 2 紅平紅球菌S-7在不同溫度培養條件下游離氯濃度變化Fig. 2 Chloride concentration of R. erythropolis S-7 at different temperatures圖2的氯離子濃度變化表明，全部的有機氯都從苯環上釋放出來，形成游離氯。S7能將所有的3-氯代苯甲酸苯環上結合的氯釋放出來，說明該菌具有降解其它氯代芳香化合物的潛能。圖 3 紅平紅球菌S-7在不同溫度培養條件下殘余3

13、-CBA濃度變化Fig. 3 3-CBA concentration of R. erythropolis S-7 at different temperatures從圖3的結果表明，菌株R. erythropolis S7可以在1030°C的溫度范圍內完全分解3-氯代苯甲酸。降解速度在一定程度上取決于菌體的生長量。菌體生長處于延遲期時，降解速率較慢；進入對數期，降解速度增加；進入穩定期時生物量最大，在20°C和30°C條件下，3-氯代苯甲酸不需適應馬上開始降解，在60h時，底物完全被利用。盡管菌株在10°C時能氯代苯甲酸降解完全，但是需要一定的時間來適

14、應低溫環境，使得在開始的24h內，底物濃度幾乎沒有發生變化。在寒冷的區域內，大部分的時間溫度在20°C以下，此時底物變得難溶解，而且細菌降解的酶系受到低溫的抑制，使得難降解物質在低溫條件下比常溫下更難分解10。鑒于大部分的微生物不能在10°C條件下生長并降解有機物，而該菌有廣泛的溫度適應性，能在我國北方大部分地區生長，該菌具有在低溫區域處理污水的能力，有廣泛的應用前景。2.3 葡萄糖為生長底物時菌株S7對2-氯代苯甲酸及4-氯代苯甲酸的降解葡萄糖在自然界中廣泛存在，也是細菌非常容易利用的碳源，在污水處理過程中會有葡萄糖的存在，并且葡萄糖不會對環境造成風險，因此考察在以葡萄糖

15、為生長底物時菌株對2-CBA(圖4)及4-CBA(圖5)的降解能力。 圖 4 葡萄糖為生長底物時對2-氯代苯甲酸的共代謝Fig. 4 2-CBA cometabolism with glucose as growth substrate圖4和圖5細菌的生長曲線表明，葡萄糖的存在加快了微生物新陳代謝的速率,增加了生物量。在以葡萄糖為唯一碳源時適應期很短，很快就進入對數期，24h后進入穩定期。在以2-或4-CBA為唯一碳源時，由于細菌缺乏相應降解的酶系，細菌不能利用底物生長。加入葡萄糖后，由于氯代苯甲酸的存在，使得菌體的生長的適應期增長，24h后才開始生長。在以葡萄糖和2-氯代苯甲酸為底物的培養條

16、件下，2-CBA可部分降解(圖4)，其降解曲線和細菌的生長曲線相似，都有適應期的存在。在培養36h以后，2-CBA的降解才逐漸增加。而且在葡萄糖耗盡后(72h)，細菌降解2-CBA的能力也逐漸減弱，最后完全消失。這種現象主要是因為在降解2-CBA過程中，葡萄糖不僅為細菌提供了碳源，同時也提供還原力NADH和其它必需因子，使得細菌能在利用葡萄糖的同時降解2-CBA。在葡萄糖耗盡后，細菌通過內源代謝來維持酶活性，此時2-氯代苯甲酸的轉化仍可以進行。但內源代謝的時間較短，直至降解能力完全消失。圖 5 葡萄糖為生長底物時對4-氯代苯甲酸的共代謝 Fig. 5 4-Chlorobenzoate come

17、tabolism with glucose as growth substrate從圖5的4-氯代苯甲酸降解曲線可見，雖然細菌能在以葡萄糖和4-CBA為底物的培養基中生長，但是4-CBA不能被降解。4-CBA也同樣抑制菌體的生長，適應期增加。菌株不能共代謝4-CBA可能是由于在這種情況下，即使添加了葡萄糖，葡萄糖所提供的因子仍不能滿足降解4-CBA所需，這與Schukat等人的實驗有相似之處11。2.4 固定化細菌載體的選擇2.4.1海藻酸鈉為包埋載體時載體濃度的選擇將菌懸液加到不同濃度的海藻酸鈉溶液后，用7號針頭滴加到3%氯化鈣溶液中，鈣化24h形成微球，然后用生理鹽水沖洗小球。取定量微球，

18、測定其強度。表2. 海藻酸鈉濃度對固定化小球載體性能的影響Table 2 Effect of sodium alginate concentration on immobilized balls properties海藻酸鈉濃度(%)操作難易程度成球性手感壓縮性1.5易操作較好彈性較好3易操作好彈性較好5較難操作好彈性好采用1.5%、3%、5%的海藻酸鈉作為固定化載體。操作結果見表2。經過5d的搖床培養后，發現所制備微球大部分都破裂。2.4.2以聚乙烯醇(PVA)為固定化載體將菌懸液加到不同濃度的PVA溶液后，用7號針頭滴加到飽和硼酸溶液中，室溫下在飽和硼酸溶液中交聯24h ,然后用生理鹽水沖

19、洗小球,除去其表面粘附的硼酸。取定量微球，測定其強度。 試驗結果見表3。表3. 聚乙烯醇濃度對固定化小球載體性能的影響Table 3 Effect of PVA concentration on immobilized balls propertiesPVA濃度（%）操作難易程度成球性強度5易操作差較好8易操作差較好10較難操作差好12難操作差好PVA作為最廣泛應用的固定化包埋材料之一,近年來受到廣大研究者的關注,但是,在實驗中發現, PVA在作為載體材料包埋固定化過程中存在著成球難,水溶膨脹性等等問題。隨著濃度增加，機械強度增加，但是操作難度也增加，當PVA 濃度大于12%時，由于液體黏度很

20、大，PVA 緩沖液很難與菌懸液混合均勻，2.4.3 殼聚糖抑菌實驗的研究配置不同濃度的殼聚糖溶液，加到牛肉膏蛋白胨液體培養基中，以不加入殼聚糖的培養基作為空白對照， 30°C培養3d后測定OD值。結果見表4。表4. 不同濃度殼聚糖對菌株生長的影響Table 4 Effect of chitosan concentration on growth of strain殼聚糖濃度（%）OD550 (三個樣品的平均值)相對存活能力（%）01.221000.11.21980.31.19970.61.16961.01.13945.01.08210.00.8469從表中可以看出，菌體對殼聚糖的耐受

21、能力比較高，基本對菌體生長沒有太大影響，可以作為固定化細菌的載體使用。2.4.4 以海藻酸鈉和殼聚糖為固定化載體在菌懸液中加入3%海藻酸鈉，充分溶解至成糊狀，用7號針頭滴入3%氯化鈣溶液中浸泡24h。在4°C條件下將制備的小球置于0.6%、pH 5.5的溶于1.0%冰醋酸中的殼聚糖溶液中進行成膜反應，15min后取出，用生理鹽水洗凈后，浸入0.15%的海藻酸鈉中5min，再用生理鹽水洗凈后，浸入11.6%的檸檬酸溶液中，液化30min，用生理鹽水洗凈制得微膠囊。從表中可以看出，采用0.6%殼聚糖和海藻酸鈉為載體時微球性能最好。表5. 以海藻酸鈉和殼聚糖為固定化載體時對固定化小球性能的

22、影響Table 5.When using sodium alginate and chitosan as carrier, the properties of the immobilized balls殼聚糖濃度（%）操作難易程度成球性手感壓縮性0.3易操作好較好0.6易操作好較好1.0較難操作好好2.4.5以海藻酸鈉和聚乙烯醇(PVA)為固定化載體在菌懸液中加入3%海藻酸鈉，0.15%、3%或10%PVA，充分溶解，用7號針頭滴入3%氯化鈣的飽和硼酸溶液中浸泡24h。用生理鹽水洗凈制得微膠囊。表6. 以海藻酸鈉和PVA為固定化載體時對固定化小球性能的影響Table 6 When using

23、sodium alginate and PVA as carrier, the properties of the immobilized ballsPVA濃度（%）操作難易程度成球性手感壓縮性0.15易操作好，且成球均勻好3較易操作好好10難操作較好彈性差，成乳白色比較不同濃度PVA制得的微球性能可知在以0.15PVA和3海藻酸鈉為載體時，微球性能最佳。2.4.6以PVA、海藻酸鈉、殼聚糖為固定化載體采用3%海藻酸鈉、0.6%殼聚糖和0.15%PVA為載體時固定化微球的性能。操作時比較容易，成球性好，彈性較強，強度較大。3 結論自農藥廠污水處理系統的活性污泥中分離出一株降解3-氯代苯甲酸的菌

24、株S7，經鑒定為紅平紅球菌（Rhodococcus erythropolis）。該菌可在10°C的低溫條件下完全降解3-氯代苯甲酸，在20°C和30°C時能在60h內利用全部的底物。此外，該菌能在以葡萄糖為生長底物的環境中共代謝利用2-氯代苯甲酸，但不能共代謝4-氯代苯甲酸。研究了以聚乙烯醇(PVA),海藻酸鈉，殼聚糖為載體時，固定化細菌的效果。在海藻酸鈉溶液中混入適量的PVA或殼聚糖都可大幅度提高固定化細胞的強度和韌性。參考文獻： 1 Yuroff S A, Sabat G, Hickey J W. Transporter-mediated uptake of

25、2-chloro- and 2-hydroxybenzoate by Pseudomonas huttiensis strain D1J. Appl Environ Microbiol, 2003, 69(12): 740174082 Corbella E M, Pertierra G A, Puyet A. Induction of the halobenzoate catabolic pathway and cometabolism of ortho-chlorobenzoates in Pseudomonas aeruginosa 142 grown on glucose-supplem

26、ented mediaJ. Biodegradation, 2001, 12(3): 1491573 Roman N, Petra P W, Lothar E, and Hermann S. Cometabolism of a nongrowth substrate: L-serine utilization by Corynebacterium glutamicumJ. Appl Environ Microbiol, 2004, 70(12): 714871554 Yi H, Min K, Kim C, Ka J. Phylogenetic and phenotypic diversity

27、of 4-chlorobenzoate-degrading bacteria isolated from soilsJ. FEMS Microbiol Ecol, 2000, 31: 53-605 Kozlovsky S A, Zaitsev G M, Kunc F et al. Degradation of 2-chlorobenzoic and 2,5-dichlorobenzoic acids in pure culture by Pseudomonas stutzeriJ. Folia Microbiol, 1993, 38: 371-3756 Goodfellow, M. Genus

28、 Rhodococcus Zopf 1891, 28ALM. Bergey's Manual of Systematic BacteriologyM. USA. Williams and Wilkins, 1986.7 J.薩姆布魯克, D.W.拉賽爾著，黃培堂等譯。分子克隆實驗指南M。第三版，北京：科學出版社，20058 Bell K, Philip J, Aw D W et al. The genus RhodococcusJ. J Appl Microbiol, 1998, 85(2):195-2109 Prieto M, Hidalgo A, Serra J et al. De

29、gradation of phenol by Rhodococcus erythropolis UPV-1 immobilized on Biolite in a packed-bed reactorJ. J Biotechnol, 2002, 97(1): 1-1110 Kato T, Haruki M, Imanaka T et al. Isolation and characterization of long-chain-alkane degrading Bacillus thermoleovorans from deep subterranean petroleum reservoi

30、rsJ. J Biosci Bioeng, 2001, 91(1): 64-70.11 Schukat B, Janke D, Krebs D et al. Cometabolic degradation of 2- and 3-chloroaniline because of glucose metabolism by Rhodococcus sp. An 117J. Curr Microbiol, 1983, 9(1):81-86Cometabolic degradation of mono-chlorobenzoate by a Rhodococcus sp. and research

31、on the immobilized cell Qi Yun1，Zhao Lin and Tan Xin(1School of Environmental Science and Engineering, Tianjin University, Tianjin 300072, China)Abstract: Large amounts of chlorobenzoates are released into the environment as a result of their wide use in agriculture and industry. They also have been used as models to study the biodegradation of halogenated aromatic compounds, and to elucidate the microbial strategies implicated in the release of chlorine substituents. A strain S7 which can degrade 3-chlorobenzoate was isolated from activated sludge of a pesticide wastewater treatment pl